2022年醫(yī)學(xué)專題-第7章-細(xì)菌的遺傳分析

7.1細(xì)菌(xìjūn)的細(xì)胞和基因組（掌握）7.2大腸桿菌的突變型及其篩選（了解）7.3細(xì)菌的接合與中斷雜交染色體作圖（掌握）7.4F’因子與性導(dǎo)（自學(xué)了解）7.5細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)作圖（掌握）7.6細(xì)菌同源重組的機(jī)制（自學(xué)了解）第七章細(xì)菌的遺傳(yíchuán)分析第一頁(yè)，共六十八頁(yè)。本章主要以大腸桿菌（E.coli）為材料(cáiliào)，討論：1、細(xì)菌的遺傳物質(zhì)的傳遞規(guī)律2、細(xì)菌染色體作圖3、細(xì)菌同源重組的分子機(jī)制第二頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.1細(xì)菌(xìjūn)的細(xì)胞和基因組7.1.1細(xì)菌(xìjūn)的細(xì)胞7.1.2細(xì)菌的基因組第三頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.1.1細(xì)菌(xìjūn)的細(xì)胞E.coli的菌落colonyE.coli細(xì)胞E.coli的擬核nucleoid第四頁(yè)，共六十八頁(yè)。細(xì)菌:

真細(xì)菌（eubacteria）如大腸桿菌（Escherchiacoli）

古細(xì)菌（archaebacteria）如詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）多種形態(tài)存在：球菌（cocci）桿菌（bacilli）螺旋菌（sprilla）等大?。弘S種類(zhǒnglèi)不同而異桿菌一般長(zhǎng)1～5?，寬0.5～1?；球菌以直徑大小表示，一般為0.5～1?；螺旋菌一般長(zhǎng)為1～50?，直徑為0.5～1?第五頁(yè)，共六十八頁(yè)。細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、擬核、核糖體、細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)含物；細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)：如莢膜和鞭毛遺傳物質(zhì)環(huán)狀核酸分子，也可稱染色體。單細(xì)胞→菌落（clone）/菌株（strain）世代(shìdài)時(shí)間短，20分鐘一代，容易得到生化突變型。原養(yǎng)型prototroph→營(yíng)養(yǎng)缺陷型auxotroph細(xì)菌與細(xì)菌之間可有遺傳物質(zhì)的交換第六頁(yè)，共六十八頁(yè)。經(jīng)滲透處理(chǔlǐ)的E.Coli釋放出來(lái)的DNA，其染色體長(zhǎng)度1200μm細(xì)菌染色體不凝縮，沒(méi)有著絲粒，也沒(méi)有紡錘體結(jié)構(gòu)。細(xì)菌繁殖：雙鏈環(huán)形DNA分子隨著細(xì)胞(xìbāo)伸長(zhǎng)而采取二分分裂（binaryfission）的方式分開。細(xì)菌染色體的復(fù)制與細(xì)胞二分(èrfēn)分裂第七頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.1.2細(xì)菌(xìjūn)的基因組細(xì)菌染色體大多為裸露(luǒlù)的環(huán)狀閉合DNA雙鏈，沒(méi)有組蛋白和其他蛋白質(zhì)結(jié)合，也不形成核小體結(jié)構(gòu)。位于細(xì)胞內(nèi)一個(gè)稱為“擬核”（nucleoid）的區(qū)域中。這種結(jié)構(gòu)有利于外源DNA的插入。細(xì)菌的染色體長(zhǎng)度為250～35000μm不等。第八頁(yè)，共六十八頁(yè)。擬核結(jié)構(gòu)(jiégòu)電鏡觀察表明：擬核結(jié)構(gòu)最顯著的特征是其DNA被包裹壓縮成一個(gè)個(gè)有序的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(loopdomain)。大腸桿菌基因組長(zhǎng)4639229bp，在松弛狀況(zhuàngkuàng)：1333μm長(zhǎng)，而其細(xì)胞長(zhǎng)度約為2μm、寬1μm

，必須壓縮最少1000倍后才能裝入細(xì)胞中。對(duì)擬核成分分析表明，DNA占80％，其余為RNA和蛋白質(zhì)。已分離出HU、H1等DNA結(jié)合蛋白，類似于真核染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，可能與結(jié)構(gòu)域的形成有關(guān)。大腸桿菌擬核中約有100個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)相當(dāng)于40kb，各個(gè)結(jié)構(gòu)域具有相對(duì)的獨(dú)立性。染色體(擬核)的結(jié)構(gòu)域是超螺旋結(jié)構(gòu)。這是DNA雙螺旋的螺旋軸盤繞而形成的螺旋，是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種形式。第九頁(yè)，共六十八頁(yè)。如用DNA酶處理大腸桿菌擬核，各結(jié)構(gòu)域DNA鏈將會(huì)斷裂，超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，變?yōu)樗沙谛徒Y(jié)構(gòu)。擬核的中央(zhōngyāng)部分為支架蛋白和RNA。若用RNA酶處理，擬核中DNA的折疊結(jié)構(gòu)即不能保持，說(shuō)明RNA和支架蛋白是保持?jǐn)M核結(jié)構(gòu)的重要因素細(xì)菌染色體以高度(gāodù)組裝的形式存在第十頁(yè)，共六十八頁(yè)。E.coli的染色體為閉合雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)約1333μm.1997年測(cè)定完成E.coliK-12MG1655菌株全基因組:4639229（約4.7×106）bp其中(qízhōng)：87.8％編碼蛋白質(zhì)0.8％編碼穩(wěn)定性RNA0.7%無(wú)編碼功能的重復(fù)序列11％屬調(diào)節(jié)序列和具有其它功能在編碼蛋白質(zhì)序列：總共編碼4288種已知和未知的蛋白質(zhì)（可讀框），其中約38％功能不明。E.coli的全基因組概況(gàikuàng)第十一頁(yè)，共六十八頁(yè)。在K-12MG1655菌株中，基因的平均長(zhǎng)度為950bp,基因之間的平均間隔約為118bp，但是菌株之間可能會(huì)有很大的差別。2005年報(bào)道了第二個(gè)菌株E.coliK-12W3110基因組的完整序列。比較K-12MG1655菌株和K-12W3110菌株，發(fā)現(xiàn)兩者基因組大小并不是一致(yīzhì)的：K-12W3110基因組大小為4646332bp，基因總數(shù)為4464個(gè)K-12MG1655基因組大小為4639229bp，基因總數(shù)為4288個(gè)E.coli的全基因組概況(gàikuàng)第十二頁(yè)，共六十八頁(yè)。E.coli的全基因組僅顯示部分基因注意圖距單位：min第十三頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.2大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)的突變型及其篩選7.2.1大腸桿菌的突變類型（1）合成代謝功能的突變型（anabolicfunctionalmutants）野生型品系在基本培養(yǎng)基上具有合成所有代謝和生長(zhǎng)所必需的復(fù)雜有機(jī)物的功能，這稱為合成代謝功能（anabolicfunction）。這需要大量基因(jīyīn)的表達(dá)，其中任何一個(gè)必需的基因(jīyīn)發(fā)生了突變都不能進(jìn)行一個(gè)特定的生化反應(yīng)，從而阻礙整個(gè)合成代謝功能的實(shí)現(xiàn)，這種突變型稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。它們多是條件致死突變（conditionlethalmutation），因?yàn)槟芡ㄟ^(guò)在基本培養(yǎng)基中添加所需的有機(jī)成分使具有這種突變的細(xì)菌存活。第十四頁(yè)，共六十八頁(yè)。（2）分解代謝功能的突變型（catabolicfunctionalmutants）野生型大腸桿菌能利用比葡萄糖復(fù)雜的不同碳源，因?yàn)樗苁箯?fù)雜的糖類轉(zhuǎn)化成葡萄糖或其他簡(jiǎn)單的糖類，也能將復(fù)雜分子，如氨基酸或脂肪酸降解為乙酸或三羧酸循環(huán)的中間物。這些降解功能稱為分解代謝功能（catabolicfunction）。同樣，一系列降解功能的實(shí)現(xiàn)也需要許多有關(guān)基因的表達(dá)，其中任何一個(gè)基因的突變都會(huì)影響降解功能的實(shí)現(xiàn)。如Lac－突變型不能分解乳糖，因此就不能生長(zhǎng)在以乳糖為唯一碳源的基本(jīběn)培養(yǎng)基中，而野生型Lac＋細(xì)菌都能利用乳糖。Lac－表型可能是因?yàn)閘acZ＋或lacY＋基因發(fā)生突變，分別產(chǎn)生了基因型為lacZ－或lacY－的突變型菌株。這種菌株顯然亦是條件致死突變型。第十五頁(yè)，共六十八頁(yè)。（3）抗性突變型（resistant

mutants）細(xì)菌由于某基因的突變而對(duì)某些噬菌體或抗生素產(chǎn)生抗性（resistant）。對(duì)噬菌體的抗性突變往往是以某種方式改變細(xì)菌的膜蛋白，從而某種噬菌體不能吸附或吸附在這種突變細(xì)菌上的能力降低(jiàngdī)。對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的突變是一個(gè)嚴(yán)重的公害問(wèn)題，所以研究得也較深入，而且細(xì)菌對(duì)各種抗生素的抗性機(jī)制各不相同。如對(duì)鏈霉素抗性突變的細(xì)菌是由于核糖體的30S亞基的S12蛋白變異，鏈霉素能和敏感細(xì)菌（野生型）的S12結(jié)合，從而使翻譯過(guò)程發(fā)生差錯(cuò)或者使翻譯過(guò)程的啟動(dòng)作用失效。而抗鏈霉素突變型的S12不再和鏈霉素結(jié)合，因此抗性突變細(xì)菌可以在鏈霉素存在的情況下，進(jìn)行正常的翻譯作用和正常的分裂繁殖。第十六頁(yè)，共六十八頁(yè)。第十七頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.2.2細(xì)菌(xìjūn)的培養(yǎng)與突變型篩選影印培養(yǎng)法第十八頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.3細(xì)菌的接合與中斷(zhōngduàn)雜交染色體作圖細(xì)菌中，大腸桿菌（E.coli）是最為廣泛的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)菌的遺傳重組(zhònɡzǔ)可以通過(guò)三種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)：（1）接合（conjugation）：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)直接接觸，把一個(gè)細(xì)胞（供體）的遺傳物質(zhì)傳遞給另一個(gè)細(xì)胞（受體），從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。接合能傳遞大段的DNA，在細(xì)菌的遺傳重組中是效率最高的。（2）轉(zhuǎn)化（transformation）：是指游離的細(xì)菌DNA片段被吸收到不同的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)（受體）。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：是指一種細(xì)菌的DNA片段經(jīng)過(guò)溫和的或經(jīng)有缺陷的噬菌體傳遞給另一種細(xì)菌。第十九頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.3.1細(xì)菌(xìjūn)的接合注意(zhùyì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)性嚴(yán)格的對(duì)照control多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型1946年，Lederberg和Tatum的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(jiēguǒ)說(shuō)明了什么？結(jié)果A+B混合培養(yǎng)后的菌液涂布在基本培養(yǎng)基上可以1/107的頻率長(zhǎng)出原養(yǎng)型菌落，而單獨(dú)的A和B則不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第二十頁(yè)，共六十八頁(yè)。1.A、B兩個(gè)菌株之間發(fā)生雜交導(dǎo)致某種形式的遺傳重組？2.原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)不一定(yīdìng)是基因型的改變，可能是培養(yǎng)上的互補(bǔ)，即一些物質(zhì)從一個(gè)品系的細(xì)胞中泄漏出來(lái)而被另一個(gè)品系的細(xì)胞所吸收？3.還是另一種可能，是基因型的改變，但不一定是由于兩個(gè)品系間的雜交，而是一個(gè)品系的DNA片段逸出細(xì)胞后，攜帶著相應(yīng)的基因（如met+bio+）進(jìn)入另一個(gè)品系的細(xì)胞，因?yàn)檫@種轉(zhuǎn)化作用而產(chǎn)生了上述的原養(yǎng)型？實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能(kěnéng)的解釋：第二十一頁(yè)，共六十八頁(yè)。澄清上述問(wèn)題——U型管實(shí)驗(yàn)：1950年Davis：U型管實(shí)驗(yàn)，有力地支持了細(xì)菌菌株雜交的判斷。他用一個(gè)U型管，在底部用一塊過(guò)濾器隔開，把管分隔為相等的兩臂。濾器的孔很小，細(xì)菌不能通過(guò)(tōngguò)，只有象DNA這樣0.1微米的游離分子、培養(yǎng)液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以通過(guò)(tōngguò)。U型管兩臂中分別為營(yíng)養(yǎng)缺陷型品系A(chǔ)和B，使它們繁殖到飽和狀態(tài)，同時(shí)在U型管的一端交替地吸和壓，使兩臂中的培養(yǎng)液充分混合，但細(xì)菌的兩個(gè)品系的細(xì)胞卻不會(huì)接觸。在U型管中培養(yǎng)一些時(shí)間后，再?gòu)膬啥朔謩e取細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一個(gè)細(xì)菌能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第二十二頁(yè)，共六十八頁(yè)。兩種細(xì)胞之間的物理(wùlǐ)接觸是接合重組的必要條件大腸桿菌F＋和F－細(xì)胞之間通過(guò)菌毛(pilus)進(jìn)行接合細(xì)菌的接合第二十三頁(yè)，共六十八頁(yè)。F因子與細(xì)菌(xìjūn)的接合F因子：fertilityfactor致育因子或性因子。是游離于細(xì)菌染色體外的閉合(bìhé)環(huán)狀DNA，但有時(shí)也可整合至染色體上F＋細(xì)胞：含有(hányǒu)F因子，供體F－細(xì)胞：不含F(xiàn)因子，受體第二十四頁(yè)，共六十八頁(yè)。F因子(yīnzǐ)的結(jié)構(gòu)F因子包含(bāohán)3個(gè)區(qū)原點(diǎn)origin：轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)致育基因：編碼生成菌毛的蛋白，形成接合管配對(duì)區(qū)：與染色體多處區(qū)域配對(duì)，可使F因子整合至染色體上第二十五頁(yè)，共六十八頁(yè)。高頻(ɡāopín)重組highfrequencyofrecombination，HfrF＋與F－之間雜交只有F因子的傳遞，而細(xì)菌的染色體并不轉(zhuǎn)移，因此盡管F因子轉(zhuǎn)移頻率很高，但兩者染色體之間重組頻率很低，大約是每百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中發(fā)生一次重組，因此F＋品系稱為低頻重組（lowfrequencyrecombination，Lfr）。F因子也可以整合到細(xì)菌染色體中，像這種帶有一個(gè)整合的F因子的品系則稱為高頻(ɡāopín)重組（highfrequencyrecombination，Hfr），因?yàn)镠fr細(xì)胞與F－

細(xì)胞接合后可以將供體染色體的一部分或全部傳遞給F－受體，當(dāng)供體和受體的等位基因帶有不同標(biāo)記時(shí)，在它們之間就可以發(fā)生重組，重組頻率可達(dá)到10-2以上，故稱Hfr品系。F’因子：整合的F因子偶爾也能離開細(xì)菌染色體回到細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)情況下，脫離染色體時(shí)，可以攜帶寄主的少數(shù)基因，形成環(huán)狀的F。這種含有細(xì)菌染色體基因的F因子叫做F’（Fprime）因子第二十六頁(yè)，共六十八頁(yè)。根據(jù)F因子存在的狀態(tài)不同而將細(xì)菌分為：①F－菌株：缺乏F因子。②F＋菌株：具有游離的F因子。③Hfr菌株：F因子整合(zhěnɡhé)到宿主染色體上。④F′菌株：帶有部分宿主染色體的游離F因子。由此也決定了它們之間的接合性能和遺傳重組的頻率：①F＋×F＋，不能接合，因?yàn)橄嗷ヅ懦?。②F－×F－，不能接合，因無(wú)F因子不能形成(xíngchéng)接合管。③F＋×F－，可接合并將受體F－轉(zhuǎn)化為F＋，但為低頻重組。④Hfr×F－，可接合，受體一般為F－，但為高頻重組。⑤F′×F－，可接合，并將受體F－轉(zhuǎn)變?yōu)镕′，并對(duì)所攜帶的宿主基因是高頻重組。第二十七頁(yè)，共六十八頁(yè)。細(xì)菌(xìjūn)重組的特點(diǎn)Hfr與F－細(xì)胞之間接合，通常只有部分的供體染色體DNA進(jìn)入受體。內(nèi)外(nèiwài)基因形成部分二倍體部分(bùfen)二倍體區(qū)發(fā)生奇數(shù)次交換導(dǎo)致線性染色體，該細(xì)胞不能存活部分二倍體區(qū)發(fā)生偶數(shù)次交換形成重組的環(huán)狀染色體，該細(xì)胞可存活細(xì)菌重組的特點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移是單方向的，僅供體→受體這與真核生物減數(shù)分裂中染色單體間交換導(dǎo)致的重組不同第二十八頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.3.2中斷雜交(zájiāo)與重組作圖（1）中斷雜交（Interrupted-matingexperiment）實(shí)驗(yàn)原理Wollman和Jacob想了解Hfr品系在雜交時(shí)，什么時(shí)候把它的基因轉(zhuǎn)入F－細(xì)胞，進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)，其中中斷雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)E.coli的遺傳(yíchuán)研究作出了重大的突破。Hfr菌株

thr+leu+azirtonrlac+gal+strs×F-菌株

thr－leu－azistonslac－gal－strrazi疊氮化鈉；ton:噬菌體T1；str:鏈霉素；lac:乳糖(rǔtánɡ)；gal:半乳糖(rǔtánɡ)第二十九頁(yè)，共六十八頁(yè)。①接合采用Hfr菌株為strs，F(xiàn)－菌株為strr

，混合通氣培養(yǎng)(細(xì)菌與細(xì)菌開始接觸)è

形成(xíngchéng)接合管。接合在完全培養(yǎng)基上進(jìn)行，培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，不加鏈霉素、疊氮化鈉和噬菌體T1。②中斷接合在接合處理后的不同時(shí)間攪拌（斷開接合管,使配對(duì)的細(xì)菌分開）和提取樣品，從而獲得不同接合時(shí)間（min）的細(xì)菌樣品。③殺死Hfr將不同接合時(shí)間的細(xì)菌樣品稀釋后接種在含有鏈霉素的完全培養(yǎng)基上，結(jié)果對(duì)鏈霉素敏感的Hfr菌株被殺死，只有F－細(xì)菌存活。④檢查F－細(xì)菌所含供體基因?qū)@得不同接合時(shí)間的F－細(xì)菌樣品都分別接種在含疊氮化鈉，含噬菌體T1，含乳糖而無(wú)葡萄糖，含半乳糖而無(wú)葡萄糖的培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)各供體基因出現(xiàn)的頻率。⑤作圖根據(jù)各基因出現(xiàn)時(shí)間先后的順序?qū)⑺帕性谌旧w上，并標(biāo)明出現(xiàn)的時(shí)間，而各基因出現(xiàn)時(shí)間的差數(shù)就是它們之間的距離，這種圖距是以時(shí)間（min）為單位的，有別于真核生物遺傳作圖時(shí)以厘摩（cM）為單位。Hfr菌株

thr+leu+azirtonrlac+gal+strs×F-菌株

thr－leu－azistonslac－gal－strr第三十頁(yè)，共六十八頁(yè)。中斷雜交(zájiāo)結(jié)果：第三十一頁(yè)，共六十八頁(yè)。這種根據(jù)供體基因進(jìn)入(jìnrù)受體細(xì)胞的順序和時(shí)間繪制連鎖圖的技術(shù)，稱為中斷雜交技術(shù)（Interruptedmatingtechnique）。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變基因在雜交試驗(yàn)中有選擇重組型排除親代型的作用，所以稱為被選擇的標(biāo)記基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hfr的未選擇性標(biāo)記基因進(jìn)入F－所需時(shí)間：分鐘轉(zhuǎn)移的Hfr基因＜909azir11azirtonr18azirtonrlac+25azirtonrlac+gal+（2）中斷(zhōngduàn)雜交作圖第三十二頁(yè)，共六十八頁(yè)。F因子(yīnzǐ)在細(xì)菌染色體上有許多插入位點(diǎn)，而且其插入片段的取向不同而形成不同的Hfr品系。用這些不同Hfr菌株進(jìn)行中斷雜交實(shí)驗(yàn)，則它們的轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、基因轉(zhuǎn)移順序以及轉(zhuǎn)移方向都不相同E.coliK12的部分遺傳圖注意圖距單位：min第三十三頁(yè)，共六十八頁(yè)。（3）重組(zhònɡzǔ)作圖基因距離較遠(yuǎn)用中斷雜交作圖是很有效的，但是基因距離較近，基因間轉(zhuǎn)移時(shí)間在2min之內(nèi)，那么僅用中斷雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因定位就不十分精確可靠(kěkào)。這時(shí)可用傳統(tǒng)的重組作用法（recombinationmapping）例如：

根據(jù)中斷雜交試驗(yàn)（時(shí)間單位法），已知lac和ade

這兩個(gè)基因是緊密連鎖的，在某些品系的雜交中ade基因是后于lac進(jìn)入F－細(xì)胞的。

問(wèn)兩基因間的距離為多少？第三十四頁(yè)，共六十八頁(yè)。以下雜交：Hfr

lac＋ade＋strs×F—

lac－ade－strr↓重組子ade＋strr在含有鏈霉素的基本培養(yǎng)基上，Hfr細(xì)菌被殺死，因其為strs未雜交的F－lac－ade－strr

也死亡，因?yàn)槭窍汆堰嗜毕菪退赃x出來(lái)的重組子都是ade＋strr因?yàn)閍de＋是在lac＋之后(zhīhòu)進(jìn)F－細(xì)胞，所以我們選出的F－ade＋

strr，一定是由同時(shí)得到lac＋和ade＋的下圖顯示了該雜交組合可能的交換情形——第三十五頁(yè)，共六十八頁(yè)。Hfrlac＋ade＋F－

lac－ade－Hfrlac＋ade＋F－

lac－ade－Hfrlac＋ade＋F－

lac－ade－Hfrlac＋ade＋F－

lac－ade－F－

lac＋ade－F－

lac－ade－F－

lac－ade＋F－

lac＋ade＋lac和ade之間未交換(jiāohuàn)lac和ade之間單交換(jiāohuàn)之一，產(chǎn)生重組子，但不能生長(zhǎng)，因?yàn)槭窍汆堰嗜毕菪蚻ac和ade之間單交換之二產(chǎn)生(chǎnshēng)重組子lac和ade之外雙交換，但產(chǎn)生的不是lac和ade間的重組子第三十六頁(yè)，共六十八頁(yè)。計(jì)算(jìsuàn)

lac和ade之間的重組率1、選擇在腺甘酸（ade）缺乏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的類型。它們表明ade基因已轉(zhuǎn)入細(xì)胞。2、選出的lac－ade＋類型即是重組(zhònɡzǔ)子，因?yàn)槲挥诤竺娴腶de＋都已進(jìn)入，表明lac＋也已進(jìn)入，而lac－ade＋表型就是供體受體lac、ade兩個(gè)基因間發(fā)生交換的結(jié)果?？捎么藖?lái)計(jì)算重組值。所以，它們的重組率，也可代表基因間的距離RF第三十七頁(yè)，共六十八頁(yè)。時(shí)間圖距與重組(zhònɡzǔ)率圖距的關(guān)系

用時(shí)間單位法測(cè)得這兩個(gè)基因間的距離是1分鐘，用重組法測(cè)得的重組值是20％。用重組率（RF）所測(cè)得的基因間距離與用中斷雜交(zájiāo)以時(shí)間（T）為單位的基因間距離基本上是一致的。兩個(gè)值的比：RF:T約等于20，即它們之間關(guān)系大約是1min等于20個(gè)圖距單位（cM）。所以大致上是，1個(gè)時(shí)間單位（1分鐘）相當(dāng)于20％重組值。大腸桿菌染色體全長(zhǎng)約100min，含4×106核苷酸對(duì)，所以總圖距相當(dāng)于2000cM，故1cM≈2000bp。這種接合重組作圖在短距離內(nèi)是有效的。如相距2min以上的就有可能表現(xiàn)不連鎖。同時(shí)這種接合重組不產(chǎn)生交互重組類型，所以用這種方法得出的圖距和減數(shù)分裂生物中所確定的圖距不同。第三十八頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.5細(xì)菌的轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)與轉(zhuǎn)導(dǎo)作圖7.5.1細(xì)菌的轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)與作圖7.5.2細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)與作圖第三十九頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.5.1細(xì)菌(xìjūn)的轉(zhuǎn)化作圖細(xì)菌的轉(zhuǎn)化:DNA直接轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的過(guò)程。環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化：整體進(jìn)入整合。片段DNA轉(zhuǎn)化：?jiǎn)捂溸M(jìn)入整合。在實(shí)施以上步驟時(shí)：①一般(yībān)要對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理：化學(xué)處理或用強(qiáng)電場(chǎng)處理（electroporation，電穿孔）。目的是增加受體細(xì)胞膜對(duì)供體DNA的可透性。②制備感受態(tài)細(xì)胞（competentrecipientcell）：能吸取DNA分子而被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞叫做感受態(tài)細(xì)胞。在某一細(xì)菌群體中，只有極少數(shù)細(xì)胞是感受態(tài)的，它們具有感受因子（competencefactor），可能是細(xì)胞表面的一種蛋白質(zhì)或是一種轉(zhuǎn)化酶（translocase），它參與DNA的吸收。第四十頁(yè)，共六十八頁(yè)。轉(zhuǎn)化過(guò)程可以分為幾個(gè)步驟：雙鏈DNA分子和細(xì)胞表面感受位點(diǎn)可逆性的結(jié)合。供體DNA片段被吸入受體細(xì)胞。侵入受體細(xì)胞的供體雙鏈DNA轉(zhuǎn)變成單鏈形式，其中一條鏈被降解。未被降解的一條鏈部分或整個(gè)地與受體DNA鏈進(jìn)行交換(jiāohuàn)重組，形成雜合的DNA分子（heteroduplexDNA）。這種雜合的DNA復(fù)制以后，形成一個(gè)親代類型（受體）的DNA和一個(gè)重組類型的DNA并導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞的形成與表達(dá)。第四十一頁(yè)，共六十八頁(yè)。通過(guò)轉(zhuǎn)化確定基因連鎖、基因順序和圖距：在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，DNA小片段→受體。相距很遠(yuǎn)的二個(gè)基因很難同時(shí)存在于一個(gè)DNA片段中，若兩個(gè)基因的二個(gè)片段同時(shí)進(jìn)入受體，一般不能同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，按照(ànzhào)概率定律，兩個(gè)片段同時(shí)轉(zhuǎn)化的概率是它們的單獨(dú)轉(zhuǎn)化的概率的乘積，這種概率是很低的。兩個(gè)基因緊密連鎖時(shí)，它們就有較多的機(jī)會(huì)包括在同一個(gè)DNA片段中，并同時(shí)整合到受體染色體里——共轉(zhuǎn)化（cotransformation），共轉(zhuǎn)化的基因一般是連鎖的。第四十二頁(yè)，共六十八頁(yè)。共轉(zhuǎn)化頻率的計(jì)算：例：在一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，用a+b+品系的供體DNA，轉(zhuǎn)化基因型ab的受體品系，得到(dédào)的轉(zhuǎn)化類型和數(shù)目：

a+b+307

a+b215

ab+278轉(zhuǎn)化子的總數(shù)是800,（用a+作為選擇(xuǎnzé)）問(wèn)b位點(diǎn)與a位點(diǎn)共轉(zhuǎn)化的頻率是多少？解：a+基因與b+基因共轉(zhuǎn)化的頻率用整個(gè)a+轉(zhuǎn)化子數(shù)目以及

a+和b+轉(zhuǎn)化子數(shù)目的值來(lái)計(jì)算。a+b+共轉(zhuǎn)化子數(shù)307，a+轉(zhuǎn)化子有兩種類a+b+（307）和a+b(215)總數(shù)是522。ab+類型與所提問(wèn)題不相關(guān)，因?yàn)閷?duì)于a+來(lái)說(shuō)它們不是轉(zhuǎn)化子，所以：

a+和b+共轉(zhuǎn)化的頻率是：307/522×100％＝58.8%共轉(zhuǎn)化率＝×100％a＋b＋共轉(zhuǎn)化子數(shù)目a＋轉(zhuǎn)化子數(shù)目第四十三頁(yè)，共六十八頁(yè)。用共轉(zhuǎn)化確定(quèdìng)基因順序：例如：如果基因p和q常常一起傳遞到受體，這樣兩個(gè)基因可能是相對(duì)地緊密連鎖，同樣基因q和o也經(jīng)常一起傳遞到受體細(xì)胞。這兩個(gè)基因也是彼此連鎖的。

兩種可能的排列順序：p－o－q和p－q－o。若順序是p－o－q，這樣p和o必將共轉(zhuǎn)化,因?yàn)樗鼈儽萷和q靠得更緊密。若順序是p－q－o，這樣p和o將很少或根本不發(fā)生共轉(zhuǎn)化，因?yàn)樗鼈冸x得相對(duì)較遠(yuǎn)。結(jié)果表明沒(méi)有p和o的共轉(zhuǎn)化，說(shuō)明基因順序肯定是p－q－o第四十四頁(yè)，共六十八頁(yè)。基因順序和圖距的計(jì)算(jìsuàn)：例如：用枯草桿菌（Bacillussubtilis）的一個(gè)菌株trp2＋his2＋tyr1＋作供體，提取DNA，向受體trp2－h(huán)is2－try1－菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子類型如下：?jiǎn)?個(gè)基因間的距離和排列(páiliè)順序如何？第四十五頁(yè)，共六十八頁(yè)。基因(jīyīn)順序和圖距的計(jì)算：注意：計(jì)算trp2和his2之間的重組值時(shí)，685個(gè)trp2－h(huán)is2－是與供體trp2＋his2＋這2個(gè)基因之間未發(fā)生交換的細(xì)胞(xìbāo)數(shù)，因此不能統(tǒng)計(jì)在內(nèi)trp2his2tyr1344013第四十六頁(yè)，共六十八頁(yè)。供體DNA片段(piànduàn)受體菌染色體DNA1＋2＋3＋1－2－3－①②③④發(fā)生①②交換產(chǎn)生重組子：1＋2－3－發(fā)生②③交換產(chǎn)生重組子：1－2＋3－發(fā)生③④交換產(chǎn)生重組子：1－2－3＋發(fā)生①③交換產(chǎn)生重組子：1＋2＋3－發(fā)生①④交換產(chǎn)生親型：

1＋2＋3＋發(fā)生②④交換產(chǎn)生重組子：1－2＋3＋發(fā)生①②③④交換產(chǎn)生重組子：1＋2－3＋注意：配對(duì)區(qū)間只有發(fā)生偶數(shù)次交換才能形成有效的重組，奇數(shù)次交換導(dǎo)致線性DNA，該種菌不能存活。3基因片段轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)時(shí)可能的交換類型及其重組子第四十七頁(yè)，共六十八頁(yè)。7.5.1細(xì)菌(xìjūn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作圖細(xì)菌(xìjūn)的轉(zhuǎn)導(dǎo):轉(zhuǎn)導(dǎo)就是以病毒作為載體把遺傳信息從一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞傳到另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為:

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generaltransduction）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）烈性噬菌體的感染周期溫和噬菌體的感染周期第四十八頁(yè)，共六十八頁(yè)。烈性噬菌體（virulentphage）感染寄主細(xì)胞后就進(jìn)入裂解反應(yīng)，使細(xì)胞裂解。如T4噬菌體。T4噬菌體溫和噬菌體（temperatephage）感染寄主細(xì)胞后具有裂解和溶源兩種發(fā)育途徑。如λ噬菌體。λ噬菌體第四十九頁(yè)，共六十八頁(yè)。吸附侵入生物合成裝配裂解釋放T4噬菌體的生活周期（1）烈性噬菌體的增殖感染宿主細(xì)胞后就進(jìn)入(jìnrù)裂解反應(yīng)，使宿主細(xì)胞裂解。整個(gè)過(guò)程包括：吸附侵入生物合成裝配裂解釋放第五十頁(yè)，共六十八頁(yè)。（2）溫和噬菌體的增殖λ噬菌體感染(gǎnrǎn)周期有2種途徑：裂解周期lyticcycle溶源周期lysogeniccycle裂解周期溶源周期開始第五十一頁(yè)，共六十八頁(yè)。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)在噬菌體的裂解周期接近完成時(shí)，病毒DNA被包進(jìn)蛋白質(zhì)外殼。那么轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體是如何形成的呢？1965年，K.Ikeda和J.Tomizawa對(duì)E.coli的溫和噬菌體P1的一些實(shí)驗(yàn)研究闡明了轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體是如何形成的。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)一個(gè)非溶源性的細(xì)菌細(xì)胞（供體）被P1裂解時(shí)，細(xì)菌的染色體DNA斷裂成一些片段，接著在細(xì)菌細(xì)胞中合成了噬菌體的外殼蛋白。當(dāng)復(fù)制(fùzhì)的噬菌體DNA被包裝到蛋白質(zhì)外殼時(shí)，偶然地也會(huì)把純粹是細(xì)菌的DNA片段包裝到一個(gè)噬菌體外殼中，形成所謂轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒（transducingparticle）/轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒第五十二頁(yè)，共六十八頁(yè)。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒（Transducingphages），其產(chǎn)生的頻率非常低（10－5～10－7）。由于噬菌體外殼蛋白(dànbái)決定噬菌體附著細(xì)胞表面的能力，因此，這種噬菌體顆粒仍然具有侵染性。它感染細(xì)菌細(xì)胞，并將其內(nèi)含物－細(xì)菌的DNA片斷注入其中。進(jìn)入的DNA片段可以和寄主細(xì)胞DNA發(fā)生重組，形成遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生重組的細(xì)菌細(xì)胞——轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)菌DNA片段長(zhǎng)度大約為一個(gè)病毒基因組的大小，細(xì)菌染色體比病毒的染色體大得多，細(xì)菌染色體斷裂后形成非常多的片段，到底在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，被包進(jìn)病毒外殼蛋白的中是那個(gè)片斷，完成是隨機(jī)的，所以稱作普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)第五十三頁(yè)，共六十八頁(yè)。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)吸附裂解寄主DNA生物合成錯(cuò)誤裝配感染其它細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成功流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)第五十四頁(yè)，共六十八頁(yè)。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖（1）共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的計(jì)算——確定基因之間的次序和距離(jùlí)一般性轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化很相似。兩個(gè)基因同在一起轉(zhuǎn)導(dǎo)就是共轉(zhuǎn)導(dǎo)（cotranduction）。共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率愈高，表明兩個(gè)基因在染色體上的距離愈近，連鎖愈密切；相反，如果兩個(gè)基因的共轉(zhuǎn)導(dǎo)很低，說(shuō)明其距離較遠(yuǎn)，因此，測(cè)定兩基因的共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率就可以確定基因之間的次序和距離。A.兩因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（two-factortranduction）

計(jì)算方法與共轉(zhuǎn)化計(jì)算方法類似B.三因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（three-factortranduction）第五十五頁(yè)，共六十八頁(yè)。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖例如供體的基因型為a+b+c+，受體的基因型a－b－c－，在一個(gè)三因子轉(zhuǎn)導(dǎo)雜交實(shí)驗(yàn)(shíyàn)中，將產(chǎn)生各種不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)體。由于兩個(gè)基因（a+b+或b+c+）共同進(jìn)入一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的機(jī)率和它們之間的距離成反比。即二基因距離愈近就愈可能被包裝到同一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)子中并共同轉(zhuǎn)移到同一個(gè)受體細(xì)胞中，形成一個(gè)共轉(zhuǎn)導(dǎo)子a+b+。共轉(zhuǎn)導(dǎo)率的計(jì)算：共轉(zhuǎn)導(dǎo)率＝×100％a＋b＋共轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)目a＋轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)目第五十六頁(yè)，共六十八頁(yè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖中兩個(gè)基因ab之間的重組率計(jì)算第五十七頁(yè)，共六十八頁(yè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖例子用E.colitrpA＋supC＋pyrF＋供體細(xì)胞和trpA－supC－pyrF－作為受體由P1噬菌體媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)進(jìn)行三因子轉(zhuǎn)導(dǎo)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果：?jiǎn)枺核鼈?tāmen)的基因順序？共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率？第五十八頁(yè)，共六十八頁(yè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖例子解：上述三個(gè)基因在遺傳圖上的順序(shùnxù)可以從第3種轉(zhuǎn)導(dǎo)型上立即判斷出來(lái)，因?yàn)樗撬拇谓粨Q導(dǎo)致中間位置基因改變，其數(shù)目最少（等于0）

三個(gè)基因的次序：supCtrpApyrF第五十九頁(yè)，共六十八頁(yè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖例子supC+和trpA+二基因共轉(zhuǎn)導(dǎo)形成第1和第2兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)型，因此，supC－trpA的共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率是（36+114）/603=0.25同理：supC－pyrF的共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率是：36/603＝0.06三基因在遺傳(yíchuán)圖上順序和相對(duì)距離是：supCtrpApyrF共轉(zhuǎn)導(dǎo)率越高說(shuō)明兩基因(jīyīn)靠得越近，反之，越遠(yuǎn)第六十頁(yè)，共六十八頁(yè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)作圖中共轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)率與圖距的關(guān)系1966年，T.TWu(HarvardUniversity)得到了一個(gè)共轉(zhuǎn)導(dǎo)率與從接合實(shí)驗(yàn)(shíyàn)中得到的圖距相連系的數(shù)學(xué)表達(dá)式：

x=(1－d/L)3x：兩個(gè)基因的共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率d：染色體上兩基因間的距離（以分鐘計(jì)，min）L：轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA的平均長(zhǎng)度（以分鐘計(jì)，min）(對(duì)于P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)，這個(gè)長(zhǎng)度L約為細(xì)菌染色體的2%，即2min)第六十一頁(yè)，共六十八頁(yè)。由溫和噬菌體進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)