2022年醫(yī)學(xué)專題-第6章-酶工程制藥(二)

第四節(jié)酶的人工模擬一、模擬酶的概念：人工模擬酶就是根據(jù)酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的蛋白或非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物。模擬酶用合成高分子來模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)，一般具有高效和高適應(yīng)性的特點(diǎn)，在結(jié)構(gòu)上比天然酶相對(xiāngduì)簡單。模擬酶不僅在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，更重要的是它能摸擬酶的作用機(jī)制和立體化學(xué)等特性。第一頁，共五十一頁。二、模擬(mónǐ)酶的理論基礎(chǔ)1.模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)Pauling穩(wěn)定(wěndìng)過渡態(tài)理論：酶先與底物結(jié)合，進(jìn)而選擇性地穩(wěn)定(wěndìng)某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)（TS），降低反應(yīng)活化能，從而加快反應(yīng)速度。模擬酶要和酶一樣，能夠在結(jié)合底物過程中，通過底物的定向化、鍵的扭曲及變形來降低反應(yīng)的活化能。第二頁，共五十一頁。第三頁，共五十一頁。第四頁，共五十一頁。2.主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)主-客體化學(xué)的基本意義來源于酶和底物的相互作用，體現(xiàn)為主體(zhǔtǐ)和客體在結(jié)合部位的客間及電子排列的互補(bǔ)。超分子的形成源于底受和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，超分子兼具分子識別、催化和選擇性輸出的功能。主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)已經(jīng)成為酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)，是人工模擬酶研究的重要理論武器。第五頁，共五十一頁。三、模擬(mónǐ)酶的分類根據(jù)Kirby分類法，模擬酶可分為：單純酶模型：以化學(xué)方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性。機(jī)制酶模型：通過對酶作用機(jī)制諸如識別(shíbié)、結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識，來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。單純合成的酶樣化合物：一些化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡單分子。第六頁，共五十一頁。按照模擬(mónǐ)酶的屬性，可分為：主-客體酶（環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等）膠束酶肽酶半合成酶分子印跡酶第七頁，共五十一頁。1.主-客體(kètǐ)酶模型優(yōu)良的模擬酶—環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）。能提供一個(gè)疏水的結(jié)合部位并能與一些無機(jī)和有機(jī)分子形成包結(jié)絡(luò)合物，以此影響和催化一些反應(yīng)。由幾個(gè)D-(+)-吡喃葡萄糖殘基通過α-1，4糖苷鍵連接而成。每個(gè)葡萄糖殘基呈現(xiàn)椅式構(gòu)象，整個(gè)分子類似環(huán)柱形分子，由于環(huán)糊精分子空穴邊緣有許多羥基，能溶于水，空穴內(nèi)基本是疏水的。環(huán)糊精催化的特點(diǎn)是：參與反應(yīng)的底物分子先被環(huán)糊精分子包接，再于其發(fā)生反應(yīng)，與酶促反應(yīng)十分相似，已模擬了轉(zhuǎn)氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。除了環(huán)糊精等天然存在(cúnzài)的宿主酶模型外，人們還合成了冠醚、穴醚、環(huán)番、環(huán)芳烴等大環(huán)多齒配體來構(gòu)建酶模型。第八頁，共五十一頁。第九頁，共五十一頁。2.膠束模擬(mónǐ)酶膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境，可以對底物束縛，如果再在膠束上共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合了催化基團(tuán)和一些輔酶后，就有可能提供“活性中心”部位(bùwèi)，使膠束成為具有酶活力或部分酶活力的膠束模擬酸。目前比較重要的膠束酶模型有：模擬水解酶的膠束酶模型輔酶的膠束酶模型金屬膠束酶模型第十頁，共五十一頁。3.肽酶肽酶就是模擬(mónǐ)天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。4.半合成酶以天然酶為母體，用化學(xué)方法或基因工程方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)(jītuán)，從而形成一種新的人工酶。第十一頁，共五十一頁。5.印跡(yìnjì)酶分子印跡：制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程。該特定分子稱為印跡分子或模板。（1）分子印跡的原理分子印跡的過程：1、選定印跡分子和功能單位，讓它們(tāmen)之間發(fā)生互補(bǔ)作用，形成印跡分子功能單位復(fù)合物。2、用交聯(lián)劑在印跡分子功能單位復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)，形成交聯(lián)的聚合物。3、從聚合物中除去印跡分子，得到對印跡分子具有選擇性的聚合物。第十二頁，共五十一頁。第十三頁，共五十一頁。第十四頁，共五十一頁。（2）印跡(yìnjì)分子與單體相互作用的類型印跡方法：共價(jià)分子印跡和非共價(jià)分子印跡。非共價(jià)分子印跡：首先是印跡分子與功能單位相混合，二者以非共價(jià)鍵發(fā)生反應(yīng)，然后功能單位與交聯(lián)劑發(fā)生共聚合，形成高交聯(lián)的剛性聚合物，最后使印跡分子從聚合物上脫離，并留下一個(gè)在形狀和功能基團(tuán)位置上與印跡分子相互補(bǔ)的識別部位(bùwèi)。共價(jià)分子印跡：印跡分子與功能基團(tuán)形成共價(jià)鍵，在與交聯(lián)劑發(fā)生共聚合后，用化學(xué)方法將印跡分子從這個(gè)高度交聯(lián)的聚合物上除去。第十五頁，共五十一頁。（3）分子印跡酶通過分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，利用(lìyòng)此技術(shù)可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)，并與底物定向排列。應(yīng)用范圍：分子印跡聚合物可作為剪裁分離物質(zhì)的材料；在酶技術(shù)和有機(jī)合成中，可作為模擬抗體、模擬酶或具有催化活性的聚合物；在生物傳感器的構(gòu)建中作為傳感器。第十六頁，共五十一頁。制備具有酶活性的分子印跡酶，要選擇合適的印跡分子，目前所選擇的印跡分子主要有底物、底物類似物、酶抑制劑、過渡態(tài)類似物和產(chǎn)物等。催化活性基團(tuán)的引入：將催化基團(tuán)定位在印跡空腔的合適位置對印跡酶發(fā)揮(fāhuī)催化效率相當(dāng)重要。通常引入催化基團(tuán)的方法為誘導(dǎo)法，即通過相反電荷等相互作用引入互補(bǔ)基團(tuán)。第十七頁，共五十一頁。（4）生物印跡酶生物印跡是分子印跡的一種形式，它以天然的生物材料，如蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)為骨架，在其上進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對印跡分子具有特異性識別(shíbié)空腔的過程。用這種方法可以制備生物印跡酶。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)制備生物印跡酶的主要過程為：①使蛋白質(zhì)部分變性；②加入印跡分子，使之與部分變性的蛋白質(zhì)充分結(jié)合；③用交聯(lián)劑交聯(lián)印跡的蛋白質(zhì)；④透析等方法除去印跡分子。第十八頁，共五十一頁。第五節(jié)酶的化學(xué)修飾一、目的(mùdì)和意義天然酶的缺陷：易于變性失活（酸、堿、有機(jī)溶劑、熱）；容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制；工業(yè)反應(yīng)要求的酸度和溫度并不總是在酶反應(yīng)的最適酸度和溫度范圍內(nèi)；底物不溶于水，或酶的米式常數(shù)過高；酶做為藥物在體內(nèi)的半衰期較短等因素限制了酶制劑的應(yīng)用。酶的化學(xué)修飾：對酶在分子水平上用化學(xué)方法進(jìn)行改造，即在體外將酶分子通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶分子的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。目的：提高酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶分子的免疫原性（醫(yī)藥）。意義：擴(kuò)大了酶制劑的應(yīng)用范圍，同時(shí)化學(xué)修飾法也是研究酶的活性中心性質(zhì)的重要手段。第十九頁，共五十一頁。2、常用化學(xué)修飾劑要求：較大相對分子量；良好(liánghǎo)的生物相容性和水容性；分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)；修飾后酶的半衰期較長。常用修飾劑：糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝膠，聚乳；高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子，肝素，血漿蛋白質(zhì)，聚氨基酸；雙功能試劑，戊二醛，二胺；其他，固定化酶載體，糖基化試劑，甲基化試劑，乙基化試劑和小分子有機(jī)化合物。第二十頁，共五十一頁。3、修飾方法（1）修飾酶的功能基團(tuán)，酶分子中可解離的基團(tuán)如氨基、羥基、羧基、巰基等都可以修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸的電荷；通過碳二亞胺反應(yīng)，可以改變側(cè)鏈羧基的性質(zhì)；通過?；磻?yīng)可改變側(cè)鏈羥基的性質(zhì)。（2）酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián)，應(yīng)用某些雙功能試劑可將酶蛋白(dànbái)分子之間、亞基之間或分子內(nèi)部不同肽鏈部分進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。（3）修飾酶的輔因子，可將輔因子共價(jià)結(jié)合在酶分子上，或引入新的或修飾過的具有強(qiáng)反應(yīng)性的輔因子。（4）酶與高分子化合物結(jié)合，蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合后可提高穩(wěn)定性。第二十一頁，共五十一頁。4、修飾酶的特性穩(wěn)定性提高、抗各類失活因子的能力提高、抗原性消除、體內(nèi)半衰期延長、最適酸度改變、酶學(xué)性質(zhì)改變，對組織分布能力改變。5、前景酶分子經(jīng)過化學(xué)修飾后，并不是所有的缺點(diǎn)都可以克服了，并且修飾的結(jié)果難以預(yù)測，今后，應(yīng)選用更多的、合適的修飾方法，如使用基因工程法、蛋白質(zhì)工程法、人工模擬法和某些(mǒuxiē)物理修飾法等，使酶的性質(zhì)進(jìn)一步改善。第二十二頁，共五十一頁。第六節(jié)酶工程研究(yánjiū)的進(jìn)展一、有機(jī)相的酶反應(yīng)20世紀(jì)80年代中期，A.M.Klibanov等人打破傳統(tǒng)酶學(xué)思想的束縛，將酶引入到非水介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)，開辟了非水酶學(xué)（nonaqueousenzymology）這一新的研究領(lǐng)域，極大地拓寬了酶的應(yīng)用范圍。非水酶學(xué)的提出，為酶在醫(yī)藥、精細(xì)化工、材料科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了廣闊(guǎngkuò)的前景。第二十三頁，共五十一頁。有機(jī)(yǒujī)相的酶反應(yīng)1、有機(jī)相酶反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)

增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；熱力學(xué)平衡向合成方向移動；可抑制有水參與的副反應(yīng)；酶不溶于有機(jī)溶劑，易于回收在利用；容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物；酶的熱穩(wěn)定性提高，酸度適用范圍擴(kuò)大；無微生物污染；能測定某些在水介質(zhì)中不能測定的常數(shù)；固定化酶方法簡單，可以只沉淀(chéndiàn)在載體表面。第二十四頁，共五十一頁。2、有機(jī)相酶反應(yīng)的溶劑(róngjì)體系水-水溶性溶劑均相體系；水-水不溶性溶劑兩相體系；膠束與反相膠束體系，單相有機(jī)溶劑體系。第二十五頁，共五十一頁。3.水和溶劑對有機(jī)溶劑中酶的影響酶活力疏水性越強(qiáng)的溶劑，其中酶所要求的水量越少；親水性強(qiáng)的溶劑應(yīng)加入更多的水以維持酶活力。酶選擇性取決于酶分子的結(jié)構(gòu)，會因酶所處的溶劑不同而發(fā)生(fāshēng)巨大變化。酶的穩(wěn)定性有機(jī)溶劑中的水含量對溶劑中酶的穩(wěn)定性影響很大；有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性隨系統(tǒng)水含量增加而下降。第二十六頁，共五十一頁。4.有機(jī)相的酶工程在有機(jī)相中，天然酶容易變性而失活、分散性差、容易聚結(jié)成團(tuán)。因此，酶在有機(jī)相中的穩(wěn)定化研究具有重要的意義。固定化酶不僅使酶在有機(jī)相中易于分散，提高擴(kuò)散效果，而且能增加(zēngjiā)其穩(wěn)定性，還可以調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，有利于酶的回收和連續(xù)化生產(chǎn)。酶的化學(xué)修飾和表面活性劑包埋可以增加酶表面的疏沙發(fā)一，改善酶在有機(jī)相中的脂溶性和穩(wěn)定性，提高酶的催化效率。第二十七頁，共五十一頁。二、核酶和脫氧(tuōyǎng)核酶具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)。根據(jù)其催化的反應(yīng)可分為兩大類：剪切型核酶

催化自身或異體RNA的切割，相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶，主要(zhǔyào)包括錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白質(zhì)—RNA復(fù)合酶（RNaseP）。剪接型核酶

主要包括組Ⅰ內(nèi)含子和組Ⅱ內(nèi)含子，可實(shí)現(xiàn)mRNA前體自我拼接，具有內(nèi)切核酶酶和連接酶兩種活性。第二十八頁，共五十一頁。切割RNA的DNA分子，稱之為脫氧核酶。大多數(shù)脫氧核酶的催化需要Mg2+等二價(jià)金屬離子作為輔助因子。這些離子的作用是：中和DNA單鏈上的負(fù)電荷，從而增加單鏈DNA的剛性；利用金屬螯合作用發(fā)揮空間誘導(dǎo)效應(yīng)；產(chǎn)生H+，誘導(dǎo)并參與體系的電子或質(zhì)子傳遞，催化體系發(fā)生氧化(yǎnghuà)還原反應(yīng)。第二十九頁，共五十一頁。三、抗體酶利用抗體能與抗原特異性結(jié)合的原理，可用過渡態(tài)類似物作為半抗原來誘發(fā)抗體，這樣(zhèyàng)產(chǎn)生的抗體便能特異地識別反應(yīng)過程中真正的過渡態(tài)分子，從而降低反應(yīng)的活化能，達(dá)到催化反應(yīng)的目的，這種抗體便稱為催化抗體。催化抗體是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，因此也叫抗體酶?？贵w酶與天然酶相比，最大優(yōu)點(diǎn)是：種類繁多，不但能催化一些天然酶能催化的反應(yīng)，還能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)。第三十頁，共五十一頁。抗體酶制備方法（1）穩(wěn)定過渡態(tài)法：用類似于反應(yīng)過渡態(tài)的小分子作為半抗原，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體而獲得。（2）抗體與半抗原互補(bǔ)法：利用抗體-半抗原互補(bǔ)性產(chǎn)生抗體酶，通過半抗原的優(yōu)化設(shè)計(jì)使之正確模仿過渡態(tài)的幾何結(jié)構(gòu)及所有的反應(yīng)鍵，從而(cóngér)產(chǎn)生高活力的抗體酶。（3）熵阱法：利用抗體結(jié)合能克服反應(yīng)熵壘來設(shè)計(jì)半抗原。第三十一頁，共五十一頁。利用(lìyòng)過渡態(tài)類似物制備抗體酶第三十二頁，共五十一頁。（4）多底物類似法：將酶催化反應(yīng)的輔因子引入到抗體結(jié)合部位，產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位，又有底物結(jié)合部位的抗體（5）抗體結(jié)合部位修飾法：將抗體的結(jié)合部位引入催化基團(tuán)（6）抗體庫法：用基因克隆技術(shù)將全套(quántào)抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，從中篩選特異性的可變區(qū)基因。第三十三頁，共五十一頁。對于任何分子，幾乎都可以通過免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而且專一性很強(qiáng)，抗體的這種多樣性標(biāo)志(biāozhì)著抗體酶的應(yīng)用潛力是巨大的。第三十四頁，共五十一頁。四、基因工程(jīyīngōngchéng)酶的構(gòu)建1、酶基因的克隆和表達(dá)重組(zhònɡzǔ)DNA技術(shù)克隆各種天然酶的基因，在微生物中表達(dá)，篩選出高產(chǎn)菌株，可以通過發(fā)酵大量生產(chǎn)所需要的酶。2、酶基因的遺傳修飾人為地將酶基因中個(gè)別核苷酸加以修飾或更換，從而改變酶蛋白分子中某個(gè)或幾個(gè)氨基酸，不僅改變酶的結(jié)構(gòu)，而且改變拜的催化活力，專一性及穩(wěn)定性。第三十五頁，共五十一頁。第七節(jié)酶工程產(chǎn)品(chǎnpǐn)制造實(shí)例酶工程具有技術(shù)先進(jìn)、廠房設(shè)備投盜小、工藝簡單、能耗量低、產(chǎn)品收率高、效率高、效益大、污染輕等優(yōu)點(diǎn)。

以往采用化學(xué)合成、微生物發(fā)酵及生物材料提取等傳統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)的藥品，都可以通過酶工程生產(chǎn)，甚至可以獲得傳統(tǒng)技術(shù)不可能得到(dédào)的昂貴藥品。第三十六頁，共五十一頁。一、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)(shēngchǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G經(jīng)青霉素?；缸饔茫獬?cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸，也稱無側(cè)鏈青霉素。6-氨基青霉烷酸是生產(chǎn)半合成青霉素的最基本原料。1、工藝路線（1）大腸桿菌的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉湯瓊脂(qióngzhī)培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來水。用氫氧化鈉調(diào)酸度為7.0，在55。16kP下滅菌30分后備用。在250毫升搖瓶中加入發(fā)酵液培養(yǎng)液30毫升，將斜面接種后培養(yǎng)18-30小時(shí)的大腸桿菌D816（產(chǎn)青霉素酰化酶），用15毫升無菌水制成菌細(xì)胞懸液，取1毫升懸浮液接種至裝有30毫升發(fā)酵液培養(yǎng)基的搖瓶中，在搖床上28℃，170轉(zhuǎn)每分振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，如此依次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至1000-2000升規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機(jī)收集菌體，備用。第三十七頁，共五十一頁。（2）大腸桿菌固定化取濕菌體100公斤，置于40度反應(yīng)罐中，在攪拌下加入50升10%戊二醛5升，在轉(zhuǎn)移至搪瓷盤中，使之成為3-5厘米厚的液層，室溫放置2小時(shí)，再轉(zhuǎn)移至4度冷庫過夜，待形成固體凝膠后，通過粉碎和過篩，使其成為直徑為2毫米左右的顆粒狀固定化大腸桿菌細(xì)胞，用蒸餾水以酸度7.5和0.3摩爾每升磷酸緩沖液先后充分洗滌，抽干，備用。（3）固定化大腸桿菌反應(yīng)堆制備(zhìbèi)將上述充分洗滌后的固定化大腸桿菌細(xì)胞裝填于帶保溫夾套的填充式反應(yīng)器中，即成為固定化大腸桿菌反應(yīng)堆，反應(yīng)器規(guī)格為直徑70*160厘米。第三十八頁，共五十一頁。（4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)取20公斤青霉素G鉀鹽，加入(jiārù)到1000升配料罐中，用0.03摩爾每升、pH7.5的磷酸緩沖液溶解并使青霉素G鉀鹽濃度為3%，用2摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5-7.8，然后將反應(yīng)器及pH調(diào)節(jié)罐中反應(yīng)液溫度升到40度，維持反應(yīng)體系的酸度在7.5-7.8范圍內(nèi)，以70每分70升流速使青霉素G鉀鹽溶液通過固定化大腸桿菌反應(yīng)堆進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化，直至轉(zhuǎn)化液酸度不變?yōu)橹?。循環(huán)時(shí)間一般為3-4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，放出轉(zhuǎn)化也8，再進(jìn)入下一批反應(yīng)。第三十九頁，共五十一頁。（5）6-氨基青霉烷酸的提取

上述轉(zhuǎn)化液經(jīng)過濾澄清后，濾液用薄膜濃縮器減壓濃縮至100升左右，冷卻至室溫后，于250升攪拌罐中加50升醋酸丁脂充分?jǐn)嚢杼崛?0-15分，取下層水相，加1%克每毫升活性炭于70度攪拌脫色30分，濾除活性炭，濾液用6摩爾每升鹽酸調(diào)酸度至4左右，5度放置結(jié)晶(jiéjīng)過夜，次日濾取結(jié)晶(jiéjīng)，用少量冷水洗滌，抽干，115℃烘2-3小時(shí)得成品6-氨基青霉烷酸，收率為70-80%。第四十頁，共五十一頁。二、固定化酶法生產(chǎn)(shēngchǎn)5’—復(fù)合單核苷酸5'—復(fù)合(fùhé)單核苷酸可用于治療白血球下降、血小板減少以及肝功能失調(diào)等疾病。核糖核酸經(jīng)磷酸二脂酶作用，可分解為腺苷、胞苷、尿苷、鳥苷等一磷酸化合物，該磷酸二脂酶存在于桔青霉細(xì)胞、谷氨酸發(fā)酵菌細(xì)胞、麥芽根等生物材料中，本法以麥芽根為材料制備磷酸酶。第四十一頁，共五十一頁。工藝路線：1、磷酸二脂酶的制備取干麥芽根，加9-10倍體積的水，用2摩爾每升的鹽酸調(diào)酸度至5.2，于30度條件下浸泡15-20小時(shí)，然后加壓去渣，浸出液過濾(guòl(fā)ǜ)，濾液冷卻至5度，加入2.5倍體積的5度95%冷工業(yè)酒精，5度靜置2-3小時(shí)后，吸去上層清夜，回收乙醇，下層離心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗滌2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，備用。第四十二頁，共五十一頁。2、固定化磷酸二脂酶的制備取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸銨溶液溶解，過濾得到酶液。另取濕ABXE-纖維素40公斤，加入0-5度蒸餾水至80升，攪拌下先后加入1摩爾每升鹽酸和5%亞硝酸鈉溶液各10升，攪拌均勻，于0-5度下反應(yīng)，150分，抽濾，濾餅迅速用預(yù)冷的0.05摩爾每升鹽酸和蒸餾水各洗3次，抽干(chōuɡàn)后，將濾餅投入上述磷酸二脂酶溶液中，攪拌均勻后用1摩爾每升碳酸鈉溶液調(diào)pH8.0，攪拌反應(yīng)30分，用冷水洗3-4次，抽干(chōuɡàn)，得到固定化磷酸二脂酶，備用。第四十三頁，共五十一頁。3、轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)反應(yīng)取2公斤核酸，緩慢假如預(yù)熱至60-70度的360升、pH5.00.001摩爾每升氯化鋅溶液中，用摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)至pH5.0-5.5，濾除沉淀，將清液升溫至70度，加入上述濕的固定化磷酸二脂酶40公斤，，于67度維持pH5.0-5.5，攪拌反應(yīng)1-2小時(shí)，根據(jù)增色效應(yīng)，用紫外吸收法判斷轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)平衡點(diǎn)，轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)完成后，濾出轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)液，用于分離5’—單核苷酸，固定化酶再繼續(xù)用于下一批轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)反應(yīng)。第四十四頁，共五十一頁。4、5’—復(fù)合單核苷酸的分離純化將上述轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)液用6摩爾每升的鹽酸調(diào)酸度至3，濾除沉淀，，濾液用6摩爾每升氫氧化鈉調(diào)酸度至7，進(jìn)入已處理好的氯-型陰離子交換樹脂柱，流速為2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去離子水洗滌柱床，然后用3%氯化鈉溶液以1-1.2升每分流速洗脫，當(dāng)流出液pH達(dá)到7時(shí)開始部分收集，直至洗脫液中不含核苷酸為止，合并含核苷酸鈉的洗脫液進(jìn)行精制。第四十五頁，共五十一頁。5、精制及灌封上述核苷酸鈉溶液用薄膜濃縮器濃縮后，測定核苷酸含量，再用無熱源水稀釋至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%藥用活性炭，煮沸10分，脫色和除熱源，濾除活性炭，濾液經(jīng)除6號菌漏斗或0.45微米孔徑的微孔(wēikǒnɡ)濾膜過濾除菌后灌封，即為5’—復(fù)合單核苷酸。第四十六頁，共五十一頁。三、固定化酶法生產(chǎn)(shēngchǎn)L-氨基酸氨基酸可用于醫(yī)藥、食品以及農(nóng)業(yè)。合適比例的混合液可直接注入體內(nèi)補(bǔ)充營養(yǎng)，