細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞增

一、培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞主要有兩種狀態(tài)。一種是能貼附在培養(yǎng)支持物上的細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞、NH3T3等，叫貼壁型細(xì)胞，體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都屬于這種細(xì)胞。另一種細(xì)胞并不貼附在容器的壁上，而是懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，如HL—60，叫做懸浮型細(xì)胞，這類細(xì)胞主要是血液原性或癌原性的細(xì)胞。1貼壁(粘附)型細(xì)胞

粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)

生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，

有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須

粘附于一固相表面

才能生存和生長(zhǎng)。

2培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而

屬于粘附型細(xì)胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞3

類型

細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異

體內(nèi)：粘附是全方位

外形具有復(fù)雜的立體特征

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面

外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型

4分類

根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類：

上皮樣成纖維細(xì)胞樣

其它，不定型5上皮樣細(xì)胞型

名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于--來(lái)源：來(lái)源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞

扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核6生長(zhǎng)特點(diǎn)

易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)

7成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起中有卵圓形核8生長(zhǎng)特點(diǎn)

排列成放射狀，漩渦狀

并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而

單獨(dú)行動(dòng)游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，

常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起

9培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定

血清

Hela高血清低血清

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pH

Hela太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度

3T3低密度高密度

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

生長(zhǎng)狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣10懸浮生長(zhǎng)型

概念培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)11優(yōu)點(diǎn)

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)

易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)

12貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，看不到有空泡，細(xì)胞邊緣清楚，培養(yǎng)基內(nèi)看不到懸浮的細(xì)胞和碎片，培養(yǎng)液清澈透明，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)顆粒較多，透明差，空泡多時(shí)，表明生長(zhǎng)較差。當(dāng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基混濁時(shí)，應(yīng)想到細(xì)菌真菌污染的可能。懸浮細(xì)胞當(dāng)邊緣清楚，透明發(fā)亮?xí)r，生長(zhǎng)較好；反之，則較差或已死亡。由于培養(yǎng)基內(nèi)有pH指示劑的存在，因此它的顏色往往可以間接地表明細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。呈橙黃色時(shí)，細(xì)胞一般生長(zhǎng)狀態(tài)較好；呈淡黃色時(shí)，則可能是培養(yǎng)時(shí)問(wèn)過(guò)長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞過(guò)多；如呈紫紅色，則可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，或已死亡。13細(xì)胞污染細(xì)菌污染真菌污染細(xì)菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除14細(xì)菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。15真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

!16細(xì)菌和真菌的清除

使用抗生素抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。（當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平）。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍藥物沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。1795％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問(wèn)題，平均發(fā)生率達(dá)到11%能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá)不能通過(guò)可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意污染來(lái)源：操作環(huán)境不良操作人員的疏失實(shí)驗(yàn)器具不潔等已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染18熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法支原體污染檢測(cè)19細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落等等，細(xì)胞間隙可見(jiàn)鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。支原體污染表現(xiàn)熒光染料Hoechst33258染色法檢測(cè)支原體20熒光染色法(33258)顯示染色體，細(xì)胞周圍亮點(diǎn)為支原體21Giemsa染色法，附于胞質(zhì)上黑點(diǎn)為支原體22掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體23

支原體的清除

支原體清除劑MRA（Mycoplasma

Removal

Agent）處理法每4天換一次液，連續(xù)處理15天清洗純化法細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌原理：由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生，所以通過(guò)反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限.如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。

藥物輔助高溫處理法先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。支原體特異性血清法用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。

24二、培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)及活細(xì)胞的鑒定在細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，往往要進(jìn)行活細(xì)胞的鑒定和細(xì)胞的計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞的密度，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)必不可少的一種基本技能。251．細(xì)胞計(jì)數(shù)①將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。②將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。③靜置3分鐘。④鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml＝（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）×10000注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。262．細(xì)胞活力①將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。②加入0.5ml0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘。③吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。④鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。另外，活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。27

HemocytometerThemostcommonroutinemethodforcellcountingwhichisefficientandaccurateiswiththeuseofahemocytometer.HemocytometerCellCounts28

Volume:0.1mm3

1ml=1cm3=1000mm31mm1mm0.1mm29Deadcell30細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力31細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)的注意事項(xiàng)①消化單層細(xì)胞時(shí)，務(wù)求細(xì)胞分散良好，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。否則會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。②取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液。在連續(xù)取樣計(jì)數(shù)時(shí)尤應(yīng)注意這一點(diǎn)。否則，前后計(jì)數(shù)結(jié)果會(huì)有很大誤差。③鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇見(jiàn)2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。如細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明消化不充分。④細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10mm2或多于500個(gè)/10mm2時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。⑤在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液時(shí)，加液量不要溢出蓋片，也不要過(guò)少或帶氣泡。⑥在計(jì)數(shù)過(guò)程中，對(duì)大方格的邊緣壓線細(xì)胞應(yīng)按數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。⑦染色標(biāo)本在計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)必須在15分鐘內(nèi)檢查計(jì)數(shù)完畢。因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)染液可以將死細(xì)胞迅速地染上藍(lán)色，再延長(zhǎng)時(shí)間則活細(xì)胞也將逐漸著色。32細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法）(一)原理MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT（噻唑藍(lán)）為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開(kāi)裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可以用DMSO來(lái)溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。33(二)操作（實(shí)用于貼壁細(xì)胞）1.接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

2.培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2-3天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。

3.顯色：分別培養(yǎng)不同時(shí)間，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

4.比色：選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。34(三)結(jié)果以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線或計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、細(xì)胞相對(duì)增殖率等。35【注意事項(xiàng)】1.選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。

2.避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在顯色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

3.設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。每組設(shè)定3復(fù)孔。

4.MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，