細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程

關(guān)于細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程第1頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)核移植動(dòng)物細(xì)胞工程常用技術(shù)其它動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)第2頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)二、核移植技術(shù)本節(jié)內(nèi)容：第3頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念1、概念：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖。2、原理：細(xì)胞增殖第4頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五定義：人們通常將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。胰蛋白酶處理取出組織胚胎或幼齡動(dòng)物器官組織剪碎分散成單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（貼壁生長長成單層細(xì)胞。有接觸抑制現(xiàn)象）。①原代培養(yǎng)3、過程圖示原代培養(yǎng)第5頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五強(qiáng)調(diào)一：細(xì)胞貼壁過程■細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁?！雠囵B(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于貼附。第6頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五■當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí),細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。強(qiáng)調(diào)二：接觸抑制第7頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五

定義：當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處于接觸抑制后,用胰蛋白酶處理,使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細(xì)胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi),這個(gè)過程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過程）②傳代培養(yǎng)第8頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五▲細(xì)胞株：傳代細(xì)胞一般能傳到40-50代，遺傳物質(zhì)一般不會(huì)發(fā)生改變，叫細(xì)胞株。強(qiáng)調(diào)：細(xì)胞系、細(xì)胞株（了解即可，老課本體系）▲細(xì)胞系：傳代50代以后不能再傳下去，部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能連續(xù)傳代，獲得不死性，叫細(xì)胞系。第9頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五3、總結(jié)：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官配置細(xì)胞懸液剪碎用胰蛋白酶處理10代細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶40-50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代分散成單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。傳代10-50代左右，增長緩慢以至于完全停止，部分細(xì)胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質(zhì)可能改變）為什么用胰蛋白酶處理？分瓶培養(yǎng)原代培養(yǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞貼壁、接觸抑制繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細(xì)胞獲得不死性，細(xì)胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細(xì)胞。細(xì)胞株：一般說遺傳物質(zhì)未改變細(xì)胞系：遺傳物質(zhì)已改變原代培養(yǎng)第10頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件:1）無菌無毒的環(huán)境：

適宜的溫度：人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜的酸堿度：PH：7.2-7.4液體合成培養(yǎng)基：糖、氨基酸、促生長因子、水、無機(jī)鹽、微量元素等；通常還需加入血漿、血清等天然成分。4）氣體環(huán)境：2）營養(yǎng)：3）溫度和pH：“95％空氣+5％CO2”的混合氣體培養(yǎng)箱。氧氣是細(xì)胞代謝必須的；CO2維持培養(yǎng)液的PH。對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具無菌處理；培養(yǎng)液中添加抗生素防止培養(yǎng)過程中污染；定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產(chǎn)物，防止對培養(yǎng)細(xì)胞造成危害。第11頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五問題3：為什么用胰蛋白酶處理？問題1、為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官、組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？因?yàn)槠浼?xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)，分化程度低。問題2、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？擴(kuò)大細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，利與細(xì)胞吸收營養(yǎng)。動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰蛋白酶處理動(dòng)物組織，可以使動(dòng)物組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)和細(xì)胞外的其他成分酶解，獲得單個(gè)細(xì)胞。

問題4：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用的適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2，胃蛋白酶在PH為7.2-7.4的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中無活性。問題5：用胰蛋白酶處理不會(huì)把所培養(yǎng)的細(xì)胞消化掉嗎？控制好時(shí)間！長時(shí)間處理當(dāng)然會(huì)損傷細(xì)胞。第12頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五問題6、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？問題7、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機(jī)鹽）、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動(dòng)物血清等。不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體。問題8、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的原理：細(xì)胞增殖。問題9、目前使用的或冷凍保存的正常細(xì)胞通常在10代以內(nèi)，為什么？10代以內(nèi)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。第13頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:1、蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2、應(yīng)用于基因工程主要用于作為受體細(xì)胞3、檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性

4、細(xì)胞的生理、藥理、病理研究

如用于篩選抗癌藥物第14頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較：比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖、植物激素葡萄糖促--動(dòng)物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動(dòng)物的器官或組織其他條件無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件第15頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物1、定義：

動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核,移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎,這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。3、分類：

胚胎核移植、體細(xì)胞核移植。胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易。動(dòng)物體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)其全能性十分困難2、原理：

動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性第16頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五4、體細(xì)胞核移植過程—示動(dòng)物克隆—無性繁殖1）克隆羊多利培育過程：黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利◆特別注意：克隆動(dòng)物性狀與供體動(dòng)物完全一樣嗎？不可能！因?yàn)椋阂?、供體動(dòng)物只提供細(xì)胞核，而細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)（如線粒體DNA）來自于受體卵母細(xì)胞。二、生物的性狀不僅與遺傳物質(zhì)有關(guān)，還受環(huán)境的影響。供體受體代孕受體第17頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核a重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利1、寫出ab所代表細(xì)胞工程名稱：a表示：

b表示:

2、實(shí)施細(xì)胞工程時(shí)，所需受體細(xì)胞大多采用卵母細(xì)胞的原因：體積大，易操作。含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。3、多利面部毛色是：

根據(jù)遺傳學(xué)原理說明判斷依據(jù)。4、若黑面綿羊的基因型為AA,白面綿羊的基因型為aa，則克隆羊的基因型為

核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都來自白面綿羊aa第18頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五

◆取供體細(xì)胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細(xì)胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩2）核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細(xì)胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。有人說它三個(gè)母親，對嗎？第19頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五核移植流程:1、供體細(xì)胞的采集與培養(yǎng)5、用物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂進(jìn)程。6、電刺激促融使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎。4、將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞3、顯微操作去除卵母細(xì)胞中的核2、受體卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)7、胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)8、妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)相同的犢牛。第20頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五4、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景第21頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五廣而告之：

你還在為身體有殘疾而苦惱嗎？你還在為器官移植找不到合適的工體而焦慮嗎？你能再這樣下去了，看看我們的體細(xì)胞核移植技術(shù)吧，只需要從你身上取出一個(gè)小小的體細(xì)胞，通過核移植培養(yǎng)出胚胎干細(xì)胞，再用胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出各種組織器官，這樣的器官的組織相容性抗原跟你的一模一樣，用這樣的器官進(jìn)行器官移植，根本不會(huì)發(fā)生免疫排斥。不夸張的說，如果這項(xiàng)技術(shù)研究成熟了，以后大家換條胳膊換條腿就跟給汽車換個(gè)輪胎一樣。你聽明白了嗎？這不是天方夜譚，巨大的前景就在眼前，你還在等什么呢？趕緊加入到生命科學(xué)的研究中來吧！第22頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五第23頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五5.體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題看書P49-50頁第24頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體第25頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五動(dòng)物細(xì)胞融合

回憶已學(xué)知識，你是否已經(jīng)見到過動(dòng)物細(xì)胞融合的實(shí)例？人鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)第26頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五1、定義：也稱細(xì)胞雜交，是指用自然或人工方法使兩個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過程。一、動(dòng)物細(xì)胞融合◆雜交細(xì)胞：融合后形成的具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞成為雜交細(xì)胞。第27頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五

基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體。來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體。

同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)2個(gè)靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合，稱誘發(fā)融合。第28頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五

細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合

受精作用第29頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五動(dòng)物細(xì)胞融合第30頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五2、誘導(dǎo)融合的因素生物法：滅活的病毒誘導(dǎo)融合.(利用滅活仙臺病毒是動(dòng)物細(xì)胞融合所特有的。這是由于病毒的磷脂外殼與動(dòng)物細(xì)胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。)化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合.物理法：電激融合病毒顆粒黏附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞第31頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五思考討論：為什么細(xì)胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？

因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會(huì)感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。第32頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五3、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。第33頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合理論基礎(chǔ)融合前處理誘導(dǎo)方法結(jié)果應(yīng)用相同點(diǎn)制備單克隆抗體培育新品種雜交細(xì)胞雜交植株突破了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，打破了生殖隔離電激、振動(dòng)、離心、聚乙二醇纖維素酶、果膠酶胰蛋白酶(或膠原蛋白酶）細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞的全能性電激、滅活的病毒、聚乙二醇融合的原理相同，誘導(dǎo)方法相似植物細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較第34頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是?將抗原注入動(dòng)物體,然后從動(dòng)物血清中提取抗體這種方法的缺點(diǎn)是什么?效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動(dòng)物抗體注入人體可能產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。能否用單個(gè)B淋巴細(xì)胞通過克隆形成的細(xì)胞群來產(chǎn)生單一類型的抗體呢？B淋巴細(xì)胞在體外不能無限增殖。二：動(dòng)物細(xì)胞融合的成功應(yīng)用

——單克隆抗體的制備思考第35頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五抗原吞噬細(xì)胞攝取處理T細(xì)胞暴露、呈遞B細(xì)胞直接刺激漿細(xì)胞增殖、分化抗體產(chǎn)生從動(dòng)物血清中分離淋巴因子獲取抗體的傳統(tǒng)方法該方法的缺點(diǎn)是？第36頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五傳統(tǒng)獲得抗體方法的缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，純度低，特異性差如何獲得大量的、特異性強(qiáng)的抗體？利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)克隆單一的經(jīng)免疫的B細(xì)胞這就是“單克隆抗體”第37頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五單克隆抗體的制備—極富創(chuàng)造性的方案將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎(jiǎng)。第38頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五1.如何取得B淋巴細(xì)胞？2.把B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞放在一起，有幾種融合方式？3.如何篩選出所需的細(xì)胞?4.細(xì)胞培養(yǎng)有幾種方式?5.如何提取單克隆抗體？制備過程提示:第39頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五制備單克隆抗體2.單克隆抗體制備的原理◆每一個(gè)

只分泌一種特異性抗體?！?/p>

具有無限增殖的特性?！?/p>

技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能

，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的

?！衾?/p>

技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)大量增殖特定抗體第40頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五單克隆抗體制備過程注射特定抗原骨髓瘤細(xì)胞在具有篩選作用的培養(yǎng)基上培養(yǎng)體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔免疫的B淋巴細(xì)胞（漿細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)融合雜交瘤細(xì)胞專一抗體檢驗(yàn)專一抗體檢驗(yàn)陽性細(xì)胞克隆細(xì)胞單克隆抗體第一次篩選第二次篩選第41頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五BMMBMBMBBMM篩選1融合體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)注射入小鼠體內(nèi)培養(yǎng)抗原培養(yǎng)瓶中篩選2小鼠動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞單克隆抗體抗原免疫處理動(dòng)物細(xì)胞融合篩選動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)提取第42頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五

例：已知細(xì)胞增殖時(shí)合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將兩種細(xì)胞在培養(yǎng)液中混合，加聚乙二醇促融，在培養(yǎng)液中有種細(xì)胞。

加入氨基喋呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的及其彼此融合的細(xì)胞不能增殖。人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞中可利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。從培養(yǎng)液中分離出雜交細(xì)胞。如何篩選出培養(yǎng)液中的雜交瘤細(xì)胞？5骨髓瘤細(xì)胞第43頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五多孔細(xì)胞培養(yǎng)板有限稀釋法

將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，在每個(gè)孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下開始培養(yǎng)，然后再篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞群。如何篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞？第44頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五動(dòng)物特異性免疫分離B淋巴細(xì)胞（B）；找到骨髓瘤細(xì)胞（G）。注意B淋巴細(xì)胞是一個(gè)系列。（B1,B2,B3,---Bn）細(xì)胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞（只有BG雜交瘤細(xì)胞存活。但BG雜交瘤細(xì)胞也是一個(gè)系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系列

，每孔只放一個(gè)雜交瘤細(xì)胞?！翱寺』囵B(yǎng)”每個(gè)雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細(xì)胞。選擇所需要的雜交瘤克隆細(xì)胞群，體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。提取單克隆抗體。1、單抗的制備過程要點(diǎn)：第45頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五3）、為何要進(jìn)行兩次篩選？4）、如何進(jìn)行第2次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。第1次篩選得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞群。問題強(qiáng)化：1）、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體第46頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五單克隆抗體的特點(diǎn)項(xiàng)目合成分泌細(xì)胞提取途徑功能特性生產(chǎn)特點(diǎn)傳統(tǒng)抗體體內(nèi)的多種B淋巴細(xì)胞從血清中種類多樣，特異性差純度低，產(chǎn)量低單克隆抗體體外培養(yǎng)或移植到小鼠腹腔培養(yǎng)的單一雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞群從雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液或小鼠腹腔的腹水中種類單一，特異性強(qiáng)純度高，產(chǎn)量高第47頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五1、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速特點(diǎn).2、用于治療疾病和運(yùn)載藥物：主要用于癌癥治療。優(yōu)點(diǎn)：療效高，毒副作用小。生物導(dǎo)彈：抗癌細(xì)胞的單克隆抗體+放射性同位素+化學(xué)藥物或細(xì)胞毒素。（單克隆抗體：導(dǎo)向作用。準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。）2、單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應(yīng)用第48頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體總結(jié)一種誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法一種新細(xì)胞滅活病毒雜交瘤細(xì)胞一個(gè)優(yōu)勢單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢第49頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五例題1：1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科勒和米爾斯坦，把小鼠的淋巴細(xì)胞（脾細(xì)胞）和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合起來，成為雜交瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在體外大量生產(chǎn)抗體的目的。實(shí)驗(yàn)過程如圖所示。(1)淋巴細(xì)胞能與骨髓瘤細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，兩種細(xì)胞膜也能“融合”

在一起，說明細(xì)胞膜

。(2)單克隆抗體的準(zhǔn)確定義應(yīng)為()A．一類特殊抗體B．無性繁殖系

C．單一抗體細(xì)胞的無性繁殖第產(chǎn)生的抗體

D．單一抗體細(xì)胞的有性繁殖系產(chǎn)生的抗體(3)雜交瘤細(xì)胞繁殖進(jìn)行的是_______分裂，其遺傳性狀__________。(4)單克隆抗體注入體內(nèi)后可以自動(dòng)追蹤抗原(病原體或癌變細(xì)胞等)并與之結(jié)合，而絕不攻擊任何正常細(xì)胞，故稱為“生物導(dǎo)彈”這是利用了

_____________

。具有一定的流動(dòng)性C有絲不變抗體能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特點(diǎn)第50頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五[例題2]（1）在用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體時(shí)，將抗原注射到小鼠體內(nèi)，可獲得(多選)

（）

A．T淋巴細(xì)胞B．效應(yīng)B淋巴細(xì)胞

C．抗體D．記憶細(xì)胞（2）下列關(guān)于單克隆抗體的制備和應(yīng)用的敘述中，正確的是(多選)（）

A．B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，一般需要滅活的仙臺病毒或聚乙二醇誘導(dǎo)

B．融合后形成的雜交瘤細(xì)胞既能無限增殖，又能產(chǎn)生單克隆抗體

C．體外培養(yǎng)時(shí)，一個(gè)B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生一種抗體，但不能無限增殖

D．單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性明顯

BCD

ACD第51頁，共56頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)6分，星期五已知細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合