本科生實(shí)驗(yàn)課件

實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的制作一、目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。

二、基本原理

在植物病理學(xué)研究工作中經(jīng)常要使用各種不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是按照生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。在植物病理學(xué)研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。在培養(yǎng)基配制完之后，必須經(jīng)過(guò)滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。三、材料、試劑與儀器1．材料馬鈴薯。2．試劑葡萄糖、瓊脂等。3．儀器與用品高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（或酸度計(jì)）、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。四、操作步驟PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）配方去皮馬鈴薯200g;葡萄糖20g;瓊脂15～20g;蒸餾水1000ml自然pH,在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA培養(yǎng)基。1．稱量:去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g。提示瓊脂加入的量取決于瓊脂的質(zhì)量，質(zhì)量好的15g就夠了，質(zhì)量差的應(yīng)適當(dāng)增加。另外，在夏天氣溫較高時(shí)，適當(dāng)增加用量。2．將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000ml，煮沸30min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?．將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。提示在瓊脂融化的過(guò)程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。4．加入葡萄糖。葡萄糖容溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1000ml。提示通常在制作培養(yǎng)基的鍋內(nèi)用紅藍(lán)鉛筆標(biāo)記出不同體積的刻度，如1000ml,2000ml等，在定容時(shí)直接將水加至已標(biāo)記的刻度即可。8．滅菌將培養(yǎng)基以0.1Mpa，121C,高壓蒸氣滅菌20min。9．?dāng)R置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50C左右，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃溫箱培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)者方可使用。

五、所需時(shí)間流程培養(yǎng)基配制高壓滅菌培養(yǎng)觀察六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)各組上交按計(jì)劃制備的培養(yǎng)基。七、思考題1為什么有的培養(yǎng)基要調(diào)pH值，有的可以不調(diào)?2加壓蒸氣滅菌為什比干熱滅菌所要求的溫度低、時(shí)間短?3．想一想，試一試，將幾只試管包扎在一起比較牢固？實(shí)驗(yàn)二植物病害的調(diào)查通過(guò)植物病害的調(diào)查，了解植物病害種類、分布和發(fā)生情況，是掌握病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，開(kāi)展病害防治的基礎(chǔ)工作。

通過(guò)調(diào)查研究，才能制定防治策略，提出切合實(shí)際，行之有效的防治方法與適當(dāng)?shù)姆乐芜m期。防治前了解情況才能做到心中有數(shù)，防治后調(diào)查可以檢查防治效果及存在問(wèn)題。一、目的要求

了解植物病害田間取樣的各種方法和掌握調(diào)查病情的方法，學(xué)會(huì)計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，以及進(jìn)一步估計(jì)因病造成的損失等。二、材料和用具

大棚蔬菜病害；筆記本、鉛筆、米尺。三、內(nèi)容與方法

病害調(diào)查可分為一般調(diào)查和重點(diǎn)調(diào)查兩類，根據(jù)調(diào)查目的不同，再?zèng)Q定調(diào)查的方法。3.1一般調(diào)查當(dāng)一個(gè)地區(qū)有關(guān)病害發(fā)生情況的資料很少，可先進(jìn)行一般調(diào)查，主要是了解病害的分布和發(fā)病程度，調(diào)查的面要廣，并且要有代表性。3.2重點(diǎn)調(diào)查經(jīng)過(guò)一般調(diào)查發(fā)現(xiàn)的重要病害，可作為重點(diǎn)調(diào)查的對(duì)象，深入了解它的分布，發(fā)病率、損失率、生態(tài)環(huán)境和防治效果等。重點(diǎn)調(diào)查的次數(shù)要多一些，發(fā)病率的計(jì)算也要求比較準(zhǔn)確。3.3植物病害田間調(diào)查的時(shí)間和次數(shù)：根據(jù)調(diào)查目的來(lái)確定。3.4取樣的方法與數(shù)量：（1）棋盤式：（2）對(duì)角線取樣法（3）平行線跳躍式取樣法（抽行式）：實(shí)驗(yàn)三病害標(biāo)本的采集及病原菌的分離

分離材料的選擇對(duì)分離培養(yǎng)的成敗有著決定的影響，因?yàn)樵诟胁≈参锸芎Σ课坏耐獠?，有多種腐生菌，為減少腐生菌的污染，分離所用的病害材料應(yīng)盡可能新鮮，并且最好在病、健交接處選材取樣。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強(qiáng)、比較活躍，容易分離成功。

番茄灰霉病主要發(fā)生在果實(shí)上，在病部形成鼠灰色的霉層；番茄葉霉病主要發(fā)生在葉片上，葉子背面形成褐色霉層。最易伴生腐生細(xì)菌。分離時(shí)用無(wú)菌接種針（環(huán)）挑取孢子少許用劃線方法接種到PDA平板上?；蛘呒訙缌司恼麴s水制成孢子懸浮液,均勻涂抹在平板上.全自動(dòng)高壓滅菌鍋

分離工作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)是分離不可缺少的設(shè)施。

2.組織分離法：這種方法適用于大部分病菌的分離，以番茄葉霉病、灰霉病為試材進(jìn)行：（1）取番茄葉霉病病葉，先用無(wú)菌水沖洗干凈。（2）在病、健交界處剪取2～3毫米長(zhǎng)的病組織，在70%的酒精中浸2～3秒種。

目的是在表面消毒的同時(shí)，驅(qū)除病組織表面的氣泡，使病組織與升汞溶液能夠充分接觸發(fā)揮消毒作用。

（3）按無(wú)菌操作法將病組織移入0.1%升汞溶液中表面消毒3～5分鐘，時(shí)間長(zhǎng)短依病組織不同而異。（4）然后在無(wú)菌水中連續(xù)漂洗3次，除去殘留的消毒劑后，直接移至PDA平板培養(yǎng)基上。每皿放4～5塊，倒置于20～25℃室溫下，一般3～4天后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。

(為防止細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入1000ppm鏈霉素10毫升)，

（5）待菌落長(zhǎng)出后挑取前緣菌絲，回接于PDA斜面培養(yǎng)基上，在25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無(wú)菌條件下鏡檢是否是番茄葉霉或灰霉病菌，若僅有其中的一種病菌的孢子，則說(shuō)明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)四病原真菌的培養(yǎng)性狀及生長(zhǎng)量的測(cè)定

植物病害方面，培養(yǎng)真菌的目的主要是觀察它的性狀和研究環(huán)境條件對(duì)它的影響，或者是大量繁殖后用于接種或其他試驗(yàn)。真菌生長(zhǎng)量的測(cè)定主要有（1）目力估測(cè)；（2）直線生長(zhǎng)：測(cè)定菌落的半徑或直徑或者計(jì)算菌落面積；（3）濕重測(cè)定：振蕩培養(yǎng)后測(cè)定菌絲的重量；（4）干重測(cè)定：菌絲烘干后測(cè)重。一、目的要求

了解幾種常見(jiàn)植物病原真菌在平板上生長(zhǎng)的特性以及不同病原真菌的生長(zhǎng)速率。二、材料、用具及儀器番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌番茄葉霉病菌褐孢菌PDA平板筆記本、鉛筆、米尺、接種刀、打孔器、接種環(huán)、消毒液（70%的酒精）微波爐高壓滅菌鍋超凈工作臺(tái)恒溫培養(yǎng)箱三、實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)五真菌孢子的萌發(fā)及的記數(shù)

促使真菌孢子的產(chǎn)生和孢子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，在真菌病吉的研究上是很重要的。真菌的鑒定主要是根據(jù)子實(shí)體和孢子的形態(tài)，孢子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)又是殺菌劑藥效測(cè)定的主要方法。為了研究病原真菌的生活史、病害循環(huán)以及病害的發(fā)生和流行的條件等。都涉及孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)問(wèn)題。一、目的要求

掌握常見(jiàn)孢子萌發(fā)的方法和孢子的記數(shù)方法。二、材料、用具及儀器灰霉病菌褐孢菌鐮刀菌鏈格菌PDA平板小燒杯筆記本、鉛筆、打孔器、接種環(huán)玻璃棒顯微鏡攪拌器恒溫培養(yǎng)箱三、實(shí)驗(yàn)步驟

3.1懸滴法：可用有凹陷的載玻片，粘固劑可以用蜂蠟，或者在蜂蠟中加少許凡士林。在蓋玻片的四個(gè)邊上涂上粘固劑，然后在蓋玻片的中央加一滴孢子懸浮液，將蓋玻片翻轉(zhuǎn)而放在載玻片上，輕輕壓一下，蓋玻片就粘在載破片上，將載破片放在培養(yǎng)皿中，在適宜的溫度下使孢子萌發(fā)。3.2培養(yǎng)皿中的萌發(fā)法將10m1適當(dāng)稀釋的孢子懸浮狡加在平底的培養(yǎng)皿中，萌發(fā)后在顯做鏡下直接觀察，其優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以測(cè)定大量孢子的萌發(fā)率。3.3瓊膠平板表面萌發(fā)法許多在水中萌發(fā)不太好的孢子，可放在任瓊膠平板表面萌發(fā)。為了避免雜菌的生長(zhǎng)，有時(shí)，可用水瓊膠平板。4.孢子的記數(shù)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法：孢子的計(jì)數(shù)最好是用計(jì)數(shù)器。計(jì)數(shù)器的種類很多，紐鮑爾(Neubauer)血球計(jì)數(shù)板是常用的一種。它是一塊很厚的載玻片，上面劃有每邊長(zhǎng)為0.05mm的小方格，每小格的面積是0.0025mm2。加蓋玻片后，小格的深度是0.1mm，所以每小格的容積是0.00025mm3，它的體積是1／4000000mL。測(cè)數(shù)時(shí)，先將蓋玻片放在計(jì)數(shù)汁上有刻度的位置，從蓋破片的一側(cè)加小滴適當(dāng)稀釋的孢子懸浮液，然后在顯微鏡下觀察每小格中孢子的數(shù)目；觀察80小格，以它的平均數(shù)乘以4000000。就是1毫升懸浮液中孢子的數(shù)目。5.作業(yè)

計(jì)算單位面積產(chǎn)孢量

實(shí)驗(yàn)六細(xì)菌的染色反應(yīng)1.亞甲藍(lán)染色法：用亞甲藍(lán)染色法，成分如下：溶液1（亞甲藍(lán)0.3g，95％酒精30mL）；溶液2（0.01％氧氧化鉀溶液100mL）;溶液1和2分別配好后混合后可染色。用移植環(huán)挑取少量瓊膠平板上培養(yǎng)24～48h左右的內(nèi)生細(xì)菌與蒸餾水混合，將配成的稀懸浮液1滴涂勻在潔凈的載玻片上，在空氣中干燥后通過(guò)火焰二三次固定后染色。細(xì)菌染色后，用油鏡觀察其形狀和大小。

2.革蘭氏染色法（GramStain）原理:第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁阻留在細(xì)胞內(nèi)。第三步：酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)。

G+菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無(wú)色，沙黃復(fù)染后呈紅色。1、菌株：未知2、流程路線：(1)涂片(2)干燥(3)固定(4)草酸銨結(jié)晶紫染色1min(5)水洗干燥(6)碘液媒染1min(7)水洗干燥(8)95%乙醇脫色15~20秒(9)水洗干燥(10)番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢(1)涂片干燥固定:21（2）草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥（3）碘液媒染1min水洗干燥

（4）95%乙醇脫色15~20秒水洗干燥（5）番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢注意事項(xiàng)（1）在涂片時(shí)不可過(guò)厚，否則在染色脫色時(shí)，都不易均勻，固定時(shí)，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。（2）嚴(yán)格掌握脫色程度，是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟。如脫色時(shí)間太長(zhǎng)，陽(yáng)性菌會(huì)誤為革蘭氏陰性菌，時(shí)間不足，革蘭氏陰性菌會(huì)誤為革蘭氏陽(yáng)性菌。（3）在鏡檢時(shí)，以分散開(kāi)的菌體的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)七病原菌的接種接種試驗(yàn)是植物病理學(xué)最重要的工作，早期的接種試驗(yàn)主要是確定一種病原物的致病性，證明病害的病原物，以后逐漸擴(kuò)展到各個(gè)領(lǐng)域如侵染過(guò)程、病害循環(huán)、病原物致病性的分化、植物對(duì)病原物抗性、病害流行、損失估計(jì)和病害控制的研究各個(gè)方面。（1）噴霧法噴霧法是將孢子（或菌絲）懸浮液噴灑在寄主表面，常用于接種由氣流和雨水傳播的病害。病菌可以從氣孔、傷口或表皮直接侵入。（2）噴撒法噴撒法是用于接種銹菌和白粉菌，可將干的病菌孢子噴撒在潮濕的植物表面上。白粉菌和銹菌的孢子可與滑石粉混合后放在小噴粉器中噴。加滑石粉的量是孢子量的10倍左右。（3）涂抹法如接種麥類銹菌，由于寄主表面和銹菌孢子都不易沾濕（不宜用噴灑法接種），一種接種法是先用手指沾水摩擦葉片，使表面有一薄層水膜，然后將孢子涂抹在上面。噴霧、噴撒和涂抹接種后的植物，必須保濕約24～48h，使病菌的孢子能夠萌發(fā)和侵入。（4）注射法注射法是將病菌孢子懸浮液用注射針注入寄主的生長(zhǎng)點(diǎn)或幼嫩部分，發(fā)病往往可以很重。這種方法用于接種麥類銹菌及玉米瘤黑粉菌等的效果很好，也適用于一些其他病害的接種。（5）針刺法接種傷口侵入的