DNA連接酶幻燈片

第四節(jié)DNA連接酶生物化學(xué)與分子生物學(xué)*******DNA連接酶舊稱“合成酶”，是1967在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。

DNA連接酶催化雙鏈DNA鏈一條鏈上切口的連接，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵。4.1什么是DNA連接酶？DNA連接酶的作用前提兩條鏈，且切口處DNA鏈5’端有-PO4，3’端有-OH注意事項(xiàng)：DNA連接酶是封閉雙鏈DNA骨架上的缺口（nick），即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂；而不能封閉裂口（gap），即在雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈斷裂DNA連接酶的作用需要能量在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，DNA連接酶催化的連接反應(yīng)，是利用NAD＋[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸]作能源的而在動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源DNA連接酶的用途DNA連接酶主要用于基因工程，將由限制性核酸內(nèi)切酶“剪”出的粘性末端重新組合，故也稱“基因針線”外源DNA連接到載體上，，進(jìn)而導(dǎo)入到受體細(xì)胞大腸桿菌DNA連接酶T4DNA連接酶（常用）熱穩(wěn)定DNA連接酶4.2DNA連接酶的種類4.2.1大腸桿菌DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶是一條多肽鏈。對(duì)胰蛋白酶敏感，可被其水解，水解后形成的小片段仍具有部份活性。在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中起著重要的作用備注：先前認(rèn)為大腸桿菌DNA連接酶只能夠連接粘性末端，但是目前也發(fā)現(xiàn)可以連接平末端，但是連接效果不好

加入10-15%的PEG（聚合劑）和高濃度的K+可以提高連接效率4.2.2T4DNA連接酶T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，可催化雙鏈DNA的粘性末端、平末端及RNA-DNA雜合體中單鏈的連接，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用其熱穩(wěn)定性較差，最適連接溫度是16℃,在實(shí)驗(yàn)室中使用較為廣泛

催化雙鏈DNA的粘性末端連接5‘…G--C--T--C--T--G--C--AG--G--A--G…3’3‘…C--G--A—GA--C--G--T--C--C--T--C…5’OHPPOH5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’nicknickDNA連接酶連接平末端雙鏈DNA分子5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’P-C--A--G--G--A--G…3’OH-G--T--C--C--T--C…5’DNA連接酶5‘…G--C--T--C--T--G-OH3‘…C--G--A--G--A--C-PRNA-DNA雜合體鏈上切口處的連接5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--GA--C--G--T--C--C--T--C…5’5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’POHDNA連接酶nickRNA4.2.3熱穩(wěn)定DNA連接酶熱穩(wěn)定DNA連接酶是從嗜熱高溫放線菌菌株中分離純化的，一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接作用的一種核酸酶。在85℃高溫下都具有連接酶的活性，而且在重復(fù)多次升溫到94℃之后也仍然保持連接酶的活性

在基因克隆中具有重要作用。比如PCR幾種DNA連接酶的比較大腸桿菌DNA連接酶T4DNA連接酶熱穩(wěn)定DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體高溫放線菌能源輔助因子NAD+ATPATP功能主要催化DNA黏性末端的連接黏性末端、平末端均可連接DNA復(fù)制中起連接作用

用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。共同點(diǎn)：都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉雙鏈DNA的功能

4.3體外連接DNA片段的方式黏性末端的連接平末端的連接

4.3體外連接DNA片段的方式同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接不同黏性末端的連接4.3.1黏性末端的連接同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接GAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'EcoRI

GCTTAA5'5'AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG5'AATTCGGCTTAA5'T4DNA連接酶退火GCTTAAGCTTAA5'AATTCG5'AATTCG同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接TGATCAACTAGT5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'5'BclI

BamHITACTAG5'5'GATCATGCCTAGGATCCGT4DNA連接酶退火GCCTAGGATCCG5'GATCATTACTAG5'GCCTAGGATCCG5'GATCATGCTTAA5'不同黏性末端的連接CTGCAGGACGTC5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'5'BamHIPstI

CTGCAG5'5'GACGTCGCCTAGGATCCGT4-DNApol切平Klenow補(bǔ)平CG5'5'GCGGATCCCTAGGATCCCTAGGT4DNAligaseGCCTAGGATCCG5'GATCGCCGCTAG5'GCCTAGGATCCG5'GATCGCCGCTAG5'4.3.2平末端的直接連接從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，黏性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多

提高平頭末端連接效率的方法加大連接酶用量（10倍于黏性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM平末端的直接連接末端修飾后的連接加上連桿（linker），使之形成黏性末端后，再用DNA連接酶連接DNA接頭(adapter)連接法4.3.2平末端的連接直接用T4DNA連接酶連接平末端5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G

…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C

…5’P-C--A--G--G--A--G

…3’OH-G--T--C--C--T--C

…5’T4DNA連接酶5‘…G--C--T--C--T--G-OH3‘…C--G--A--G--A--C-PDNA片段末端同聚物加尾后連接GCATG3’C5'5'C3’GTACGTdTdCTPTdTdGTPGCATGCCCCCC3’

C5'5'C3’CCCCCCGTACG退火

KlenowT4DNAligasePstISphICTGCA3'GG3'ACGTC5'5'CTGCAGGGGGG

3'GG3'

GGGGGGACGTC5'5'CTGCAGGGGGGGGGGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCC

C5'5'CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGGGGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCC

C5'5'CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCC

CGTAC5'5'CATGCCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCC

CGTAC5'5'CATGCCCCCCCGTACGPstI酶切位點(diǎn)加上連桿后再連接如果重組體DNA是用平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么很可能無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入DNA片段。為了解決這個(gè)問題，可采用連桿法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。所謂連桿(1inker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。DNA片段末端加上化學(xué)合成的連桿，能形成黏性末端，連接后可用內(nèi)切酶進(jìn)行切割。原理：連桿的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂羞B桿的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補(bǔ)的黏性末端。于是便可以按照常規(guī)的黏性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。缺點(diǎn)：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的連桿相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化連桿產(chǎn)生黏性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。改進(jìn)方法：改用其它類型的連桿，或者用DNA