動物細(xì)胞原代培養(yǎng)幻燈片

動物細(xì)胞原代培養(yǎng)2010.10~2010.1211/16/2022【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆諢o菌操作技術(shù)。了解小鼠解剖操作技術(shù)。了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。了解細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。了解倒置顯微鏡的使用。2【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)：是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。還可以利用培養(yǎng)細(xì)胞制備染色體，分析外界因素（如理化因素）對細(xì)胞的影響，研究細(xì)胞癌變等等。在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展了細(xì)胞融合、細(xì)胞雜交等細(xì)胞工程技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)。（分為植物細(xì)胞培養(yǎng)及動物細(xì)胞培養(yǎng)）3動物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從有機(jī)體獲取的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)是原代培養(yǎng)。將培養(yǎng)細(xì)胞洗脫后轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行在培養(yǎng)叫做傳代培養(yǎng)。4【實(shí)驗(yàn)步驟】1.工作環(huán)境及表面的處理（超凈臺的使用）早期細(xì)胞培養(yǎng)，依靠的是精湛的操作技術(shù)和盡可能的靠近火焰一達(dá)到細(xì)胞的無菌化。目前，超凈臺是使工作臺無菌化最經(jīng)濟(jì)有效的手段。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60min滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10min后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。52.細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理用于細(xì)胞培養(yǎng)的器材包括：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)板，吸管，各種瓶子等。目前，上述器材均可以從商家買到無菌一次性的用品。但是，成本太高。玻璃器材，經(jīng)過濕熱或者干熱滅菌后可以反復(fù)使用。不宜進(jìn)行高溫高壓滅菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中進(jìn)行消毒，并在超凈臺上吹干。73.實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)無菌操作的原則：保證細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)部以及吸管包裹層等內(nèi)部的無菌狀態(tài)。無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%酒精擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

8小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在超凈工作臺或有空氣濾過裝置的工作間里進(jìn)行。培養(yǎng)液或其它溶液不應(yīng)該在工作區(qū)以外打開。裝吸管或吸頭的容器也不應(yīng)該在工作區(qū)以外打開。

9細(xì)胞培養(yǎng)中液體的吸取，均需機(jī)械移液裝置移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源，更重要的是細(xì)胞培養(yǎng)液及成分通過食入或吸入的方式及入人體，可能對研究人員造成傷害。細(xì)胞培養(yǎng)瓶在超凈臺中打開后，瓶蓋應(yīng)蓋頂超下放置與工作臺中。如果培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)被污染，切勿直接倒掉，應(yīng)高壓滅菌后倒掉處理。10濕潤的培養(yǎng)箱是常見的污染源。通常由充滿液體的托盤提供培養(yǎng)箱合適的濕度，然而托盤本身及可導(dǎo)致各種細(xì)菌和真菌的污染，這種污染還可能存在與培養(yǎng)箱壁上和提供氣體的管道上。應(yīng)該定期對培養(yǎng)箱進(jìn)行加熱處理。也可以采用70%乙醇擦洗表面，并定期更換輸送CO2管道，并將該管子浸泡與20%的含氯漂白劑中消毒。不應(yīng)用的細(xì)胞應(yīng)及時(shí)丟棄處理，不應(yīng)繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中不予理睬。11工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassII)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。定期檢測下列項(xiàng)目：

1.CO2

鋼瓶之CO2

壓力

2.CO2

培養(yǎng)箱之CO2

濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。

3.無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)。水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水。124.維持細(xì)胞生長所需培養(yǎng)液的無菌處理基本培養(yǎng)液由必須氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、葡萄糖和作為生長因子、激素和貼壁因子來源的血清組成。一般用碳酸氫鈉（NaHCO3)體系進(jìn)行緩沖。細(xì)胞的生長不僅產(chǎn)生CO2，也需要CO2才能生存。所以，細(xì)胞的培養(yǎng)需要在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉平衡。如果CO2的濃度為5%，則配培養(yǎng)液中應(yīng)加入1.97g/L的碳酸氫鈉。培養(yǎng)瓶蓋應(yīng)輕輕的擰上，不要完全擰死，以保證氣體的交換。13培養(yǎng)液的pH值應(yīng)為7.2至7.4。高密度細(xì)胞使細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖耗竭并產(chǎn)生CO2和乳酸，在含酚紅作為指示的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液將從紅色變?yōu)槌壬?。?xì)胞培養(yǎng)液長時(shí)間貯藏在4°C冰箱中，會使培養(yǎng)液的pH值產(chǎn)生變化，變堿，是培養(yǎng)液的顏色呈深品紅紫色。應(yīng)用時(shí)可用Hepes（N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸）調(diào)整?？梢韵蚺囵B(yǎng)液中加入抗生素，比如青霉素，鏈霉素，慶大霉素等，抑制由于操作中的微小失誤而導(dǎo)致的低水平的感染。但是，有時(shí)由于抗生素的加入，也會使感染不易被迅速發(fā)現(xiàn)。14培養(yǎng)液的配制商家一般以三種形式提供培養(yǎng)液：1.粉末劑（需要實(shí)驗(yàn)著配制）2.濃縮裝（用無菌水稀釋即可）3.無需進(jìn)一步處理的工作液形式。由于粉末劑是其中最便宜的一種，一般實(shí)驗(yàn)室較多采用。配制培養(yǎng)液需要濾菌裝置：除菌器、真空泵以及0.45μm或0.22μm的濾膜。分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等培養(yǎng)液應(yīng)貯藏在4°C冰箱中。配好的培養(yǎng)液應(yīng)在無抗菌素的無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每次配好后留樣，培養(yǎng)72小時(shí)，觀察培養(yǎng)液確實(shí)沒有污染后使用。1516RPM1640培養(yǎng)液成分17血清1.血清必須貯存于-20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會增加約10%，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。2.一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。3.瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

184.heat-inactivation【熱處理】是指56℃,30min加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀斐缮虻砦镏@著增多，且會影響血清之品質(zhì)。5.勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。19二氧化碳培養(yǎng)箱的使用

氣套式20外形圖21正常使用環(huán)境環(huán)境溫度：（5-30）℃環(huán)境相對濕度：不大于90％大氣壓力：（86-106）kpa周圍無強(qiáng)烈震動及腐蝕性氣體應(yīng)避免陽光直接照射或其他冷、熱源的影響22使用方法安裝、連接CO2鋼瓶清潔、消毒用酒精將CO2箱工作室內(nèi)擦凈，再通過儀表設(shè)置進(jìn)行高溫消毒23注意事項(xiàng)打開玻璃門，必需歷時(shí)1分鐘以上，工作室內(nèi)CO2才可能放凈。當(dāng)CO2顯示值為零時(shí)，才能關(guān)上玻璃門，進(jìn)行新一輪的CO2控制。否則累積誤差會造成CO2濃度控制不準(zhǔn)。24污染的檢查方法用兩個(gè)裝有培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿，一個(gè)培養(yǎng)皿人為污染，如對培養(yǎng)皿表明呵氣，然后加蓋放入箱內(nèi)培養(yǎng)；另一個(gè)培養(yǎng)皿，沒有任何污染，半啟蓋放入箱內(nèi)培養(yǎng)。若人為污染，皿里有雜菌生長，對照的應(yīng)無雜菌現(xiàn)象，則證明箱內(nèi)已消毒清潔。25倒置生物顯微鏡26原理組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。

27操作步驟1、開機(jī)。接連電源。打開鏡體下端的電控開關(guān)。

2、使用

（1）準(zhǔn)備：將待觀察對象置于載物臺上。旋轉(zhuǎn)三孔轉(zhuǎn)換器，選擇較小的物鏡。觀察，并調(diào)節(jié)鉸鏈?zhǔn)诫p目目鏡，舒適為宜。

（2）調(diào)節(jié)光源：推拉調(diào)節(jié)鏡體下端的亮度調(diào)節(jié)器至適宜。通過調(diào)節(jié)聚光鏡下面的光柵來調(diào)節(jié)光源的大小。

（3）調(diào)節(jié)像距：轉(zhuǎn)三孔轉(zhuǎn)換器，選擇合適倍數(shù)的物鏡；更換并選擇合適的目鏡；同時(shí)調(diào)節(jié)升降，以消除或減小圖像周圍的光暈，提高了圖像的襯度。（4）觀察：通過目鏡進(jìn)行觀察結(jié)果；調(diào)整載物臺，選擇觀察視野。

3、關(guān)機(jī)取下觀察對象，推拉光源亮度調(diào)節(jié)器至最暗。關(guān)閉鏡體下端的開關(guān)，并斷開電源。旋轉(zhuǎn)三孔轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡片置于載物臺下側(cè)，防止灰塵的沉降。28日常維護(hù)及注意事項(xiàng)1.所有鏡頭表面必須保持清潔，落在鏡頭表面的灰塵，可用吸耳球吹去，也可用軟毛刷輕輕的撣去掉。

2.當(dāng)鏡頭表面沾有油污或指紋時(shí)，可用脫脂棉蘸少許無水乙醇和乙醚的混合液（3:7）輕輕擦拭。

3.不能用有機(jī)溶液清擦其它部件表面，特別是塑料零件，可用軟布蘸少量中性洗滌劑清擦。

4.在任何情況下操作人員不能用棉團(tuán)、干布塊或干鏡頭紙擦試鏡頭表面，否則會刮傷鏡頭表面，嚴(yán)重?fù)p壞鏡頭，也不要用水擦試鏡頭，這樣會在鏡頭表面殘留一些水跡，因而可能滋生霉菌，嚴(yán)重?fù)p壞顯微鏡。

5.儀器工作的間歇期間，為了防止灰塵進(jìn)入鏡筒或透鏡表面，可將目鏡留在鏡筒上，或蓋上防塵塞，或用防塵罩將儀器罩住。

6.微鏡盡可能不移動，若需移動應(yīng)輕拿輕放，避免碰撞。

7.不允許隨意拆卸儀器，特別是中間光學(xué)系統(tǒng)或重要的機(jī)械部件，以免降低儀器的使用性能。29實(shí)驗(yàn)動物的選擇小鼠，清潔級。(選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，10－13天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。)30實(shí)驗(yàn)材料藥品：RPMI1640培養(yǎng)液，小牛血清(FCS)，0.25%胰蛋白酶，PBS（-）器材：培養(yǎng)瓶1支/組，50ml離心筒2支/組，培養(yǎng)皿1套/組，吸管1支/組，EP管1支/組（在無菌室共用試劑車取用），剪子1把/組，鑷子1把/組，濾器1支/組。設(shè)備：水浴搖床、離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡31原代培養(yǎng)程序取材漂洗剪切消化制備單細(xì)胞懸液接種32實(shí)驗(yàn)步驟1.剪取組織頸椎脫臼法處死小鼠，放在100ml的燒杯中用70％乙醇消毒3min（206實(shí)驗(yàn)室）。用剪刀剪開腹部，取出腎、肝、脾（任意一種臟器）。33將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無菌室。34將小白鼠置超凈工作臺上，打開腹腔352.清洗在盛有PBS液平皿中洗滌數(shù)次，剔除包膜、結(jié)締組織，將剔除后臟器放入另一盛有PBS平皿中。將腎、肝、脾剪成1mm3（剪成肉末狀）大小的組織塊，再次清洗，洗去殘留的血細(xì)胞，以備消化。用的是胚胎3637石蠟切片的制備的準(zhǔn)備工作1.取材剪取肝組織。切去的肝組織不宜太大，以便固定劑穿透，切成一小塊2-3mm厚，取3、4塊即可。2.固定將切好的肝組織用生理鹽水洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定30-50min。3.洗滌用70％乙醇沖洗。4.脫水70％、80％各級乙醇脫水各40min。90％乙醇浸泡，以備下次實(shí)驗(yàn)使用。383.在50ml離心筒中加入0.25％胰蛋白酶溶液25ml，在溫暖的環(huán)境中或置于37°水浴搖床中輕輕搖動15min，轉(zhuǎn)速約為180r/min。4.讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以滅活胰蛋白酶。（小牛血清在共用無菌操作臺上取用）5.在離心管中殘留未消化組織塊中再次加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，重復(fù)步驟3和4。396.將混合的細(xì)胞懸液離心，1200rpm，5min，棄上清。7.將沉淀用新鮮的無菌PBS重懸，再1000-1200rpm，5min離心。8.用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮為止,然后再按照（6）進(jìn)行離心，離心后棄去上清液，將沉淀用少量細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)吹打，將其接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。9.用濾器過