酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

酪氨酸特性及其影響因素摘要：酶是由生物細胞合成的、對特定底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是生物催化劑。生物體內(nèi)所有的化學反應(yīng)幾乎都是在酶的催化作用下進行的。只要有生命活動的地方就有酶的作用，生命不能離開酶的存在。在酶的催化下，機體內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝有條不紊地進行著；同時又在許多因素的影響下，酶對代謝發(fā)揮著巧妙的調(diào)節(jié)作用。生物體的許多疾病與酶的異常密切相關(guān)；許多藥物也可通過對酶的作用來達到治療的目的。隨著酶學研究的深入，必將對人類社會產(chǎn)生深遠影響和做出巨大貢獻。Summary:Theenzymeishighefficiencycatalystonaspecificsubstrateproteinsynthesisbybiologicalcellsisthebiologicalcatalyst.Chemicalreactionsinallorganismsisalmostintheunderthecatalysisofenzyme.Aslongasthereislifethereisthefunctionofenzymetheenzymeinthepresenceoflifecannotleave.Intheenzymecatalyticmachinebodymaterialthenewsupersedestheold.Witheverythingingoodorderandwellarranged;andatthesametime,theinfluenceofmanyfactorsundertheregulationofenzymeplayscleverlyonmetabolism.Manydiseasesandenzymeoforganismsarecloselyrelated;manydrugscanalsobebasedontheroleoftheenzymetoachievethepurposeoftreatment.Withthein-depthstudyofboundenzymehaveafar-reachingimpactonhumansocietyandmakegreatcontributionsto.關(guān)鍵詞：酶催化活性影響因素正文引言：酶是具有催化作用的蛋白質(zhì)。其活性僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。酶與一般非生物催化劑相比，具有以下幾個特點：酶的主要成分是蛋白質(zhì)。它具有表現(xiàn)活性和專一性所必需的空間結(jié)構(gòu)，以提供反應(yīng)中心。由于蛋白質(zhì)遇高溫、強酸、強堿、重金屬鹽或紫外線等容易變性而失活，所以酶促反應(yīng)都是在比較溫和的條件下進行的。2、酶促反應(yīng)所需的活化能較低。如使1mol蔗糖水解所需活化能高達1.34MJ，用H+離子作催化劑時活化能降至87.9KJ，若用蔗糖酶催化時只需39.4KJ。酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高108~1020倍，比一般非生物催化劑高107~1013倍。酶具有高度的專一性。酶對所作用的底物有嚴格的選擇性，每一種酶只能對某一類物質(zhì)甚至只對某一種物質(zhì)起催化作用，這是一般非生物陳化劑所無法比擬的。影響酶作用的因素有酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度和抑制劑等。在酶濃度恒定的情況下，增加底物的濃度，可以提高酶促反應(yīng)的初速度。當?shù)孜餄舛仍鲋聊骋幌薅群?，反?yīng)初速度就不再隨底物的濃度而變化，而是逐漸趨近某一極限值，這個極限值稱為最大速度(Vmax)。酪氨酸的提取及其催化活性研究一、前言：生物酶的基本知識酶（enzyme）是由生物細胞合成的、對特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是生物催化劑。生物體內(nèi)所有的化學反應(yīng)幾乎都是在酶的催化作用下進行的。只要有生命活動的地方就有酶的作用，生命不能離開酶的存在。在酶的催化下，機體內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝有條不紊地進行著；同時又在許多因素的影響下，酶對代謝發(fā)揮著巧妙的調(diào)節(jié)作用。生物體的許多疾病與酶的異常密切相關(guān)；許多藥物也可通過對酶的作用來達到治療的目的。隨著酶學研究的深入，必將對人類社會產(chǎn)生深遠影響和作出巨大貢獻。酶與一般非生物催化劑相比，具有以下幾個特點：1、酶的主要成分是蛋白質(zhì)。它具有表現(xiàn)活性和專一性所必需的空間結(jié)構(gòu)，以提供反應(yīng)中心。由于蛋白質(zhì)遇高溫、強酸、強堿、重金屬鹽或紫外線等容易變性而失活，所以酶促反應(yīng)都是在比較溫和的條件下進行的，如人體中的各種酶促反應(yīng)，一般都為37℃2、酶促反應(yīng)所需的活化能較低。如使1mol蔗糖水解所需活化能高達1.34MJ，用H+離子作催化劑時活化能降至87.9KJ，若用蔗糖酶催化時只需39.4KJ。3、酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高108~1020倍，比一般非生物催化劑高107~1013倍。如存在于血液中能催化H2CO3分子分解的碳酸酐酶，它的催化效率非常高，每一分子每分鐘可以催化數(shù)萬個H2CO3分子分解。正是因為血液中有這樣高效率的酶，才能及時完成排放CO2的任務(wù)，維持血液的正常生理pH值。4、酶具有高度的專一性。酶對所作用的底物有嚴格的選擇性，每一種酶只能對某一類物質(zhì)甚至只對某一種物質(zhì)起催化作用，這是一般非生物陳化劑所無法比擬的。影響酶作用的因素有酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度和抑制劑等。在酶濃度恒定的情況下，增加底物的濃度，可以提高酶促反應(yīng)的初速度。當?shù)孜餄舛仍鲋聊骋幌薅群螅磻?yīng)初速度就不再隨底物的濃度而變化，而是逐漸趨近某一極限值，這個極限值稱為最大速度(Vmax)。酶的以上特性已引起化學工作者的極大興趣，例如酶正被作為分析試劑、探針得到應(yīng)用；生物酶的化學模擬已廣泛開展，將為研制高性能的工業(yè)催化劑奠定基礎(chǔ)。酶的電化學研究的開展還開辟了生物電化學的新領(lǐng)域。酶化學是一門交叉學科，對其研究具有廣闊的前景。酶促反應(yīng)動力學是酶化學的主要內(nèi)容之一，這方面的研究具有重要的理論和實踐意義。二、實驗目的1、認識生物體中酶的存在和催化作用，了解生物體系中酶促反應(yīng)的特點與有機合成的不同和相同之處，認識一些生物化學過程的特殊性。2、掌握生物活性物質(zhì)的提取和保存方法，學會使用儀器分析的手段研究催化反應(yīng)，特別是生物化學體系中催化過程的基本思路和方法。三、實驗原理酪氨酸是一種以Cu+或Cu2+為輔助因子的全酶，能催化空氣中的氧對多巴的氧化反應(yīng)。催化過程可以通過多巴轉(zhuǎn)換反應(yīng)過程的顏色變化來監(jiān)測，通過測定吸光度隨時間的變化來求的酶的活性。酪氨酸酶可用比色法測定。由于多巴轉(zhuǎn)變成多巴紅速率很快，在轉(zhuǎn)到下一步產(chǎn)率慢得多，故可在酶存在下，測定多巴轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟图t的速率而測定酶的活性。（可用吸光度對時間作圖，從所得的直線斜率求酶的活性）。酶參與的多巴轉(zhuǎn)換反應(yīng)如下：酪氨酸——多巴——多巴醌——無色——多巴紅——二羥基吲哚——吲哚醌——黑色素酶的活性計算：一般pH、離子強度），25℃時在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需要的量為酶的活性單位。通過下式可計算出所用的酶的活性：，式中：a為所用溶液的酶的活性，為最大吸收處吸光度的變化，t為時間，k為酪氨酸的摩爾吸收系數(shù)，V為加入的酶體積。進而計算出所用原料中的酶的活性：，式中：為原料中酶的活性，為原料所得的酶溶液的總體積，m為原料總質(zhì)量。本實驗擬通過從土豆等物中提取酪氨酸酶并測定其活性，使我們對酶有個基本認識。當土豆、蘋果、香蕉或蘑菇受損傷時，在空氣作用下，很快變?yōu)樽厣?，這是因為它們的組織中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物質(zhì)內(nèi)部，當內(nèi)部物質(zhì)暴露于空氣中，在氧的參與下將發(fā)生反應(yīng)，生成黑色素。四、儀器和試劑1、儀器：分光光度計、離心機、電子天平、研缽、水浴、容量瓶、秒表。2、試劑：酪氨酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、新鮮土豆。五、實驗步驟及數(shù)據(jù)記錄1、溶液配制1.1酪氨酸溶液的配制酪氨酸在中性水溶液中溶解度較小，因而配制過程中需加入一定量鹽酸溶解。首先稱取一定量的酪氨酸配制0.1mol/L酪氨酸儲備液，在實驗過程中稀釋至0.02mol/L，使用時需要加入一定量的NaOH調(diào)節(jié)其pH接近中性。1.2緩沖溶液的配置首先分別配置0.2mol/LKH2PO4溶液0.2mol/LNaOH溶液，然后以一定的體積比配置pH=6.0和pH=7.2的KH2PO4-NaOH緩沖溶液。體積比如下表：表1.1KH2PO4-NaOH緩沖溶液的體積比pHKH2PO4與NaOH的體積比6.05∶0.5707.25∶3.5002、酶的提取取新鮮土豆，清潔后切碎，稱取10.05g置于研缽中，加入7.5mLpH=7.2的磷酸緩沖溶液，用力擠壓和研碎，用兩層紗布濾出提取液，立即高心分離5min，傾出上層清液保存于冰箱中，提取液為棕色，在放置過程中不斷變黑。3、酪氨酸最大吸收波長確定取2.5mL酶提取液用pH=7.2的緩沖溶液稀釋至10mL比色管中，搖勻。取0.4mL已稀釋過的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的緩沖溶液，加入2.0mL酪氨酸溶液，搖勻。反應(yīng)約數(shù)分鐘后，于分光光度計上掃描繪制酪氨酸的吸收光譜圖。表1.2最大吸收波長的確定波長（nm）400410420430440450460470480490500吸光度0.4970.5090.5320.5600.5850.5900.5650.5500.5460.5500.551吸收光譜的繪制如下：圖1.1酪氨酸吸收光譜的繪制由圖1.1可知酪氨酸的最大吸收波長為450nm。4、酶活性測量分別取0.3、0.4、0.5mL稀釋過的提取液于10mL比色管中，加入5.0mLpH=6.0的緩沖溶液，再加入4.0mL酪氨酸溶液，同時開始計時，用分光光度計在450nm處測定吸光度。開始6min內(nèi)每分鐘讀一個數(shù)，以后隔2min讀一個數(shù)，直至吸光度變化不大為止。以吸光度對時間作圖，從直線斜率求出酶的活性。表1.3不同酶含量的活性測試酶稀釋液體積時間（min）0.3mL0.4mL0.5mL10.4420.5870.61220.4410.5840.61130.4530.5910.63040.4560.5960.64150.4630.6120.65860.4710.6230.65380.4820.6240.662100.4750.6280.670120.4740.6310.668140.4750.6300.6695、酶活性因素測量（1）取1.5mL稀釋過的提取液于10mL比色管中，加入4.5mLpH=6.0的緩沖溶液，再加入4mL酪氨酸溶液，分別加入一定量NaOH溶液和HCl溶液，然后用pH=7.2的緩沖溶液定容，此時測得的溶液的pH分別為2、10，測定溶液的吸光度隨時間變化值。（2）取1.5mL稀釋過的提取液于10mL比色管中，加入4.5mLpH=6.0的緩沖溶液，再加入4mL酪氨酸溶液，然后用pH=7.2的緩沖溶液定容，搖勻分別在熱水浴30℃、50℃（3）取1.5mL稀釋過的提取液于10mL比色管中，加入4.5mLpH=6.0的緩沖溶液，再加入4mL酪氨酸溶液，分別加入濃度為0.01827mol/L的EDTA1ml、2ml，然后用pH=7.2的緩沖溶液定容，測定溶液的吸光度隨時間變化值。表1.4酶活性因素的測量時間（min）pH≈7（10℃）pH≈2pH≈10水浴30℃水浴40℃無EDTA1mlEDTA2mlEDTA10.1430.0420.0800.2250.1620.1630.1630.16120.1510.0460.0810.2260.1650.1660.1650.16430.1590.0420.0840.2300.1700.1710.1680.16640.1590.0420.0830.2380.1730.1720.1700.16850.1700.0400.0830.2430.1750.1760.1740.17160.1730.0380.0840.2490.1780.1780.1750.17370.1800.0370.0850.2550.1820.1820.1770.17480.1900.0370.0860.2630.1850.1880.1810.17690.1900.0370.0870.2700.1900.1920.1840.179100.2010.0360.0880.2760.1930.1960.1880.181110.2070.0320.0890.2840.1950.2000.1930.185120.2180.0290.0900.2900.1980.2060.1870.187六、結(jié)果討論1、繪制不同酶加入量的動力學曲線：以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標，可得出在加入酶的作用下，酪氨酸轉(zhuǎn)換的動力學過程，再由直線部分得出轉(zhuǎn)換速率，即可計算酶的活性。依次得出不同提取液的活性。圖1.2不同酶含量活性測量2、酶的活性計算：將不同體積提取液的實驗結(jié)果填入下表，計算出原料中酶的活性。（酪氨酸的吸光系數(shù)為lgk=3.7）表1.5酶的活性計算已稀釋的提取液體積/mL原提取液活性/mL-1原料活性/g-10.300.00614.0574.0340.400.00663.2923.2760.500.00823.2723.2553、影響酶的活性的因素研究：（1）pH值對酶活性的影響圖1.3pH值對酶活性的影響由圖1.3可知，在pH=2或10時，溶液吸光值基本不變，這說明酶在此環(huán)境下已經(jīng)失去活性，而喪失其催化效果。（2）掩蔽劑EDTA對酶活性的影響圖1.4EDTA對酶活性影響由圖1.4可知，當加入EDTA后，曲線斜率明顯下降，并且EDTA含量越高，曲線斜率越低，這表明當加入EDTA后酶的催化活性降低，并且EDTA含量越高，酶活性越低。（3）溫度對酶活性的影響