武漢大學(xué)臨醫(yī)免疫學(xué)試驗(yàn)課

2013年臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課一、間接免疫熒光（寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告）二、ELISA法檢測(cè)HBs-Ab（寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告）三、凋亡細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告）第二次

實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)是指用酶、熒光素、同位素等標(biāo)記分子標(biāo)記Ab或Ag，通過(guò)酶聯(lián)比色儀、熒光顯微鏡或放射測(cè)定來(lái)定量檢測(cè)AgAb反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)不改變標(biāo)記的Ag或Ab的性質(zhì)，不改變包被的Ag或Ab的性質(zhì)，不影響AgAb反應(yīng)的特異性。該技術(shù)具有靈敏性高及特異性強(qiáng)，既能定性、定量，又能定位檢測(cè)的特點(diǎn)。免疫標(biāo)記技術(shù)包括免疫酶技術(shù)（如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）、免疫熒光技術(shù)、放射免疫測(cè)定等方法。

免疫熒光技術(shù)

是利用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)分析或定位相應(yīng)抗原，以測(cè)定細(xì)胞相應(yīng)抗原的存在。廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)中的一種熒光素是異硫氰酸熒光素（FITC），當(dāng)在熒光顯微鏡下用紫外線(xiàn)照射時(shí)，發(fā)出可見(jiàn)的黃綠色熒光。另一個(gè)廣泛應(yīng)用的熒光素是藻紅蛋白（PE），發(fā)出可見(jiàn)的紅色熒光。免疫熒光技術(shù)分為直接法、間接法和補(bǔ)體法等。免疫熒光技術(shù)-直接法免疫熒光技術(shù)-間接法免疫熒光技術(shù)-補(bǔ)體法補(bǔ)體法

實(shí)驗(yàn)三間接免疫熒光[原理]間接免疫熒光法是用熒光素標(biāo)記二抗以檢測(cè)Ag或Ab的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其原理是Ag首先與一抗結(jié)合，然后一抗再與熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合，形成一個(gè)Ag-Ab1-熒光素標(biāo)記Ab2的三分子復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光。實(shí)驗(yàn)材料：抗原：分離人PBMC一抗：兔抗人白細(xì)胞血清二抗：FITC-抗兔單克隆抗體已劃好標(biāo)記圈的標(biāo)本片洗脫液（PBS）間接免疫熒光法操作步驟：一、分離新鮮人血清中的PBMC

外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

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葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法[原理]外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。[材料]1、淋巴細(xì)胞分層液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重為1.077±0.001g/L）2、Hank’s液或者RPMI-1640培養(yǎng)基3、試管、吸管、水平離心機(jī)等[方法]1、無(wú)菌采集靜脈血2-3ml，注入盛有肝素的抗凝試管中，混勻。2、吸取淋巴細(xì)胞分層液3ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液2ml（剩余的抗凝血離心取血漿作檢測(cè)HBsAb用)小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）3、室溫2000r／min離心20min。管內(nèi)可分為四層。4、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個(gè)核細(xì)胞，加入到1.5ml的EP管中作細(xì)胞抗原備用。

（淡黃色）（乳白色）（無(wú)色）（白色）（紅色）二、涂細(xì)胞抗原片將PBMC用適量PBS稀釋?zhuān)?0μl左右液體滴加到標(biāo)本片黑色圈圈背面中央。靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。固定。三、加入一抗將稀釋好的一抗約15μl滴加到涂有細(xì)胞的標(biāo)本片處（可看到一小薄層圓圈），37℃，濕盒孵育30分鐘。四、漂洗階段。甩干標(biāo)本片上液體，小心擦去圓圈周?chē)臍堄嘁后w，于圓圈中央滴加洗脫液1滴，水平來(lái)回震蕩，靜置5分鐘，再甩去液體。重復(fù)上述步驟，洗滌5次。五、加入熒光二抗（整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需關(guān)閉強(qiáng)烈光源，避光?。⒍辜s15μl滴加到涂有細(xì)胞的標(biāo)本片上（可看到一小薄層圓圈）。37℃，濕盒避光孵育30分鐘。

六、漂洗階段。同步驟4，洗滌5次。

七、鏡檢。將干燥后標(biāo)本片移至熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。FITC為綠色熒光。結(jié)果觀察：熒光顯微鏡觀察：暗背景中有綠色熒光細(xì)胞實(shí)驗(yàn)四

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。由于Ab

或Ag與酶連接后，仍保持免疫活性和酶活性，當(dāng)相應(yīng)Ag、Ab特異性結(jié)合后，其分子上的酶作用相應(yīng)底物時(shí)，可引起底物水解顯色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺來(lái)檢測(cè)Ab或Ag。常用ELISA檢測(cè)方法有：間接法、抗原競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法（雙抗體夾心法、雙抗原夾心法）和其他方法。間接法

基本原理與類(lèi)型

雙抗體夾心法

竟?fàn)幏?/p>

實(shí)驗(yàn)條件選擇：

固體載相：纖維素、聚苯乙烯板

底物：價(jià)廉、安全、本身無(wú)色、酶解后出現(xiàn)顏色

終止反應(yīng)：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，以保持實(shí)驗(yàn)時(shí)間不需太長(zhǎng)

終點(diǎn)測(cè)定：目測(cè)、分光光度計(jì)酶：辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

底物：分解后顏色溶解度

鄰苯二胺（OPD）深桔黃色大3,3,5,5,-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)綠色大

堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)底物：分解后顏色溶解度萘酚（AS-mx）、快藍(lán)（FB）藍(lán)色小快紅（FR）紅色小ELISA（雙抗原夾心法）查HBs-Ab

[原理]

采用純化HBsAg包被酶標(biāo)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入酶標(biāo)抗原（HBsAg-HRP），當(dāng)標(biāo)本中存在抗HBsAg的抗體HBsAb時(shí)，HBsAb與包被HBsAg結(jié)合并與HBsAg-HRP結(jié)合形成HBsAg－HBsAb-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無(wú)顯色反應(yīng)。[材料]1、HBsAg包被酶標(biāo)板2、酶標(biāo)抗原（HBsAg-HRP）3、陽(yáng)性對(duì)照（HBsAb+）4、陰性對(duì)照（HBsAb-）5、待測(cè)標(biāo)本（血漿）6、洗滌液7、顯色劑A+顯色劑B（TMB底物）8、終止液[方法]1、在已包被抗原的酶標(biāo)反應(yīng)板的每孔中加入待測(cè)標(biāo)本50μl，設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各兩孔?？變?nèi)均加相應(yīng)的試劑一滴。并設(shè)空白對(duì)照孔1孔。2、

每孔加入酶標(biāo)抗原一滴（空白對(duì)照孔除外），充分混勻，封板，37℃孵育30分鐘。3、洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿(mǎn)各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)五次后拍干。4、

每孔加入顯色劑A、顯色劑B各一滴，充分混勻，封板，37℃孵育15分鐘。（藍(lán)綠色）5、每孔加入終止液一滴，混勻。（黃色）6、觀察各孔顏色變化。思考題：為什么標(biāo)記一種抗抗體能檢測(cè)多對(duì)抗原抗體系統(tǒng)？附：乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）抗原：抗體1、表面Ag（HBsAg）HBsAb2、核心抗原（HBcAg）HBcAb3、e抗原（HBeAg）HBeAb兩對(duì)半：HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb

HBV-Ag、Ab檢測(cè)結(jié)果臨床分析HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb+----HBV感染/無(wú)癥狀攜帶者+-+--急性/慢性乙肝/無(wú)癥狀攜帶者+-+-+

急性/慢性乙肝（傳染性強(qiáng)，大三陽(yáng)）

+

-

-

+

+

急性感染趨向恢復(fù)（小三陽(yáng)）-+-+

+

既往感染恢復(fù)期-+--+

既往感染恢復(fù)期---+-既往感染或“窗口期”-+---既往感染或接種過(guò)疫苗12345

實(shí)驗(yàn)五凋亡細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

【原理】本實(shí)驗(yàn)是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺淋巴細(xì)胞在地塞米松誘導(dǎo)下細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞在凋亡過(guò)程中有一系列特征性的形態(tài)學(xué)的改變，其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴(lài)性的核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，降解為180~200bp的片段或其整倍數(shù)的片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可形成典型的“梯狀帶”。

【材料】昆明小鼠RPMI-1640培養(yǎng)基小牛血清地塞米松基因組DNA抽提試劑盒10mg/mlRNA酶TE緩沖液(pH8.0)50×TAE電泳緩沖液DNAladder分子量標(biāo)準(zhǔn)品6×凝膠加樣緩沖液眼科剪、眼科鑷、不銹鋼網(wǎng)、250目尼龍濾布、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫水浴、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀等

【方法】一、1％瓊脂糖凝膠的制備稱(chēng)取1g瓊脂糖粉溶于100ml1×TAE緩沖液中，隔水煮沸溶解(或微波爐中溶解）。取15ml上述1％瓊脂糖制成凝膠板備用。

二、胸腺細(xì)胞的制備：眼球摘除放血頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌條件下取胸腺，置入含5%小牛血清的預(yù)冷RPMI-1640培養(yǎng)液中，先用不銹鋼網(wǎng)研磨，再將研磨好的細(xì)胞懸液用250目尼龍濾布過(guò)濾，1000rpm離心4min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1x107/ml。取上述1x107/ml濃度的胸腺細(xì)胞加入終濃度為1x10－5M的地塞米松，培養(yǎng)5h即為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，不加地塞米松為對(duì)照組。（去上清，沉淀細(xì)胞加1ml1640混勻備用）。三、小鼠胸腺細(xì)胞DNA快速提取小鼠胸腺細(xì)胞（細(xì)胞濃度107/ml）（誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組）EP管(1.5ml)棄上清充分混勻后，55℃溫浴20分鐘。12000轉(zhuǎn)/分，10秒20mlA液和100mlL液加入10μl3MNaAc和1250μlB液充分振蕩混勻后離心12000轉(zhuǎn)3分鐘期間顛倒EP管五次移取700ml至吸附柱中,靜止1分鐘，離心30s。棄去收集管中的液體，重復(fù)上述操作。加入600μlW液離心30s。棄去收集管中的液體，重復(fù)上述操作，再離心1次將吸附柱移入一個(gè)干凈的EP管中(1.5ml)中。在吸附膜的