第八章 典型發(fā)酵過(guò)程的特性與工業(yè)控制 2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)課件

發(fā)酵工程精品課程/jpkc/fjgc華東理工大學(xué)·生物工程學(xué)院

發(fā)酵工程精品課程http://biotech.ecust.e1第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http2動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁普遍存在存在生長(zhǎng)速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營(yíng)養(yǎng)要求普遍簡(jiǎn)單復(fù)雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~2000nm10000~100000nm接種濃度低高（10-5.ml-1）生長(zhǎng)濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁普3一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動(dòng)物細(xì)胞離體生長(zhǎng)和增殖，并保持其特性和功能的技術(shù)，這些細(xì)胞不再形成組織。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://4

1細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌

4群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）

5培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高

6原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc

1細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細(xì)胞大，無(wú)細(xì)5兩個(gè)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)細(xì)胞系：首次分離組織的培養(yǎng)稱(chēng)之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱(chēng)為細(xì)胞株。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc兩個(gè)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biote6細(xì)胞生長(zhǎng)的類(lèi)型貼壁依賴性來(lái)自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要貼壁單層生長(zhǎng)。只要它們沒(méi)有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長(zhǎng)。非貼壁依賴性細(xì)胞無(wú)需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長(zhǎng)的細(xì)胞。來(lái)自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈圓形。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞生長(zhǎng)的類(lèi)型典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biot7生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，8貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過(guò)濾系統(tǒng)。

●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。

●適用于所有類(lèi)型細(xì)胞。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，9.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)；

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資10二、細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得原代培養(yǎng)物在無(wú)菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無(wú)菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞類(lèi)型，它們的生長(zhǎng)速率不同，成纖維細(xì)胞最易生長(zhǎng)，常會(huì)在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。仔細(xì)控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc二、細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://b11典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech.ecu12轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)一個(gè)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，喪失了對(duì)生長(zhǎng)控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細(xì)胞對(duì)貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長(zhǎng)，但可能生長(zhǎng)到不止單層。細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：①有些細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化②化學(xué)轉(zhuǎn)化。某些化學(xué)致癌物會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc轉(zhuǎn)化細(xì)胞典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech13轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無(wú)限壽命，在培養(yǎng)中更易生長(zhǎng)，被廣泛用于生成生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對(duì)她們的安全性仍然非常關(guān)心，對(duì)可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)和控制。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無(wú)限壽命，在培養(yǎng)中更易生長(zhǎng)，被廣泛用于生成生物14腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞使來(lái)自于腫瘤組織的細(xì)胞或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有很好的增殖特性，生長(zhǎng)速率高。對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴程度低，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。。腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來(lái)分離純化技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識(shí)，對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動(dòng)，如雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，C127細(xì)胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc腫瘤細(xì)胞典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech15體外培養(yǎng)所需的一般條件適宜的培養(yǎng)皿血清成分370CCO25％95～100％濕度抗生素典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc體外培養(yǎng)所需的一般條件典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://16培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細(xì)胞系在pH7.4下生長(zhǎng)得很好。一些正常的成纖維細(xì)胞系以7.4~7.7最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以pH7.0~7.4更合適。緩沖在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細(xì)胞系在pH717溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。黏度培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚己烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。典型過(guò)程培養(yǎng)18細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成1、水細(xì)胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來(lái)配置，對(duì)水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，單原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲(chóng)細(xì)胞更偏愛(ài)蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問(wèn)題是它的自發(fā)降解，降解量與時(shí)間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://b193、氮源氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類(lèi)和濃度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，還有12種氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補(bǔ)充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時(shí)常會(huì)增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc3、氮源典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech204、維生素維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝過(guò)程有重要影響。5、無(wú)機(jī)離子無(wú)機(jī)離子分為兩組，一種是含量較高的，，包括維持膜電勢(shì)的（Na+，K+），維持滲透壓平衡（Na+，Cl－），作為酶的輔因子（Mg2+），促進(jìn)細(xì)胞貼附（Mg2+Ca2+），起緩沖作用（HPO42-，HCO3-）；另一種勢(shì)微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc4、維生素5、無(wú)機(jī)離子典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://216、脂類(lèi)和磷脂前體在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類(lèi)來(lái)自血清，在無(wú)血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添加脂類(lèi)，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細(xì)胞，對(duì)某種脂類(lèi)有很高的依賴性。非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)1、抗生素細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH緩沖劑最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/L，接近血中濃度，必須與5％～10％CO2平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。HEPES是緩沖能力很強(qiáng)的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc6、脂類(lèi)和磷脂前體在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類(lèi)來(lái)自血清223、酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基的pH指示劑4、保護(hù)劑細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)受到機(jī)械攪拌和氣泡運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。5、還原劑某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)胱氨酸利用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc3、酚紅典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech23血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是極其復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來(lái)設(shè)計(jì)的，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點(diǎn)，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc血清典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech.e24三、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc三、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定25在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所26四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動(dòng)性大，272器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來(lái)源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc2器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技28五、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來(lái)源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長(zhǎng)溫度不同。例如昆蟲(chóng)細(xì)胞的最適溫度是25～280C，人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適溫度是370C，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc五、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是292、pH大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：（1）緩沖液的緩沖能力及種類(lèi)（2）對(duì)流空間大?。?）葡萄糖濃度培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pK為6.1，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對(duì)流空間加入CO2以防止它的丟失及增加羥基離子。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc2、pH大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：30也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是由于HEPES的pK為7.0，HEPES被加入后，其緩沖能力為pH6.8～7.2。。但是當(dāng)HEPES濃度高于25mmol/L時(shí)，它對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都有毒害作用。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)常有幾種方法來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH：（1）在培養(yǎng)基中添加NaHCO3作為緩沖劑及通入含CO2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。HEPES生31（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要求低攪拌和弱混合，利用NaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)會(huì)發(fā)生局部過(guò)酸或過(guò)堿的現(xiàn)象，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不太合適。通常通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中CO2濃度來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程的pH。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進(jìn)行323、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得目的有兩個(gè)：一是提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過(guò)程。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc3、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得33（三）培養(yǎng)容器1、多孔板、Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時(shí)放在滾瓶機(jī)上緩慢滾動(dòng)，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積交大，接種后放入溫室或?qū)ｉT(mén)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應(yīng)器是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不同形式，容積可以從1升到幾十立方米。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc（三）培養(yǎng)容器典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biot34微載體微載體是指直徑在60～250μm、適合于動(dòng)物細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的微珠。微載體法培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有很多好處;①可在反應(yīng)器中提供大的比表面積②可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性③可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況④容易放大⑤適合于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)⑥容易收獲細(xì)胞。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是：①細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞生長(zhǎng)②微載體價(jià)格較貴，一般不能重復(fù)使用③需要較高的細(xì)胞接種量。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc微載體典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech.35懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過(guò)程比較接近，但由于動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作上又有特殊要求如利用螺旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中的剪切作用，并通過(guò)表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程，主要用36目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增37細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)轉(zhuǎn)動(dòng)部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染的機(jī)會(huì)；產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，剪切力相當(dāng)??；當(dāng)大容易；直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分混合均勻。存在問(wèn)題：由于液體混合的能量唯一來(lái)自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機(jī)械損傷典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞38通氣攪拌生物反應(yīng)器根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設(shè)計(jì)有多種形式的攪拌器，應(yīng)用最多的是籠式攪拌器?；\式攪拌器有兩個(gè)由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部的是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，其中的液體通過(guò)絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc通氣攪拌生物反應(yīng)器根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混39攪拌器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再?gòu)娜齻€(gè)導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混合。在微載體法培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，一般攪拌轉(zhuǎn)速在30～60r/min范圍內(nèi)，混合時(shí)間為12～24s。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc攪拌器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪40中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長(zhǎng)微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無(wú)血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)半透膜從管內(nèi)滲透出來(lái)供細(xì)胞生長(zhǎng)；對(duì)于血清等大分子營(yíng)養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過(guò)半透膜滲入管內(nèi)，避免了過(guò)量代謝物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用41優(yōu)點(diǎn)是：

●占地空間少；

●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)；

●生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc優(yōu)點(diǎn)是：

●占地空間少；

●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)10942細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)由動(dòng)物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能沿用微生物發(fā)酵過(guò)程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮?dú)獾谋壤齺?lái)實(shí)現(xiàn)控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)液的pH值，它主要是靠預(yù)先加入培養(yǎng)基＝液中適量的碳酸氫鈉和通過(guò)改變氣體流量中的二氧化碳含量來(lái)實(shí)現(xiàn)。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)由動(dòng)物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能43生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培炎，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)后，將整個(gè)反應(yīng)系取出。流加培養(yǎng)流加培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成。隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝。到反應(yīng)終止時(shí)，取出整個(gè)反應(yīng)系。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)流加培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)44半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)又稱(chēng)為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，在按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)操作。這是反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積保持不變的操作方式。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)不同，連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)胞所處的環(huán)境條件長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。因此，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://bi45灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。當(dāng)高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)必需保持給細(xì)胞補(bǔ)充足夠的營(yíng)養(yǎng)以及去除有毒的代謝廢物。通過(guò)調(diào)節(jié)灌注速率可以把培養(yǎng)過(guò)程保持在穩(wěn)定的、廢物代謝低于抑制水平的狀態(tài)下。一般在分批培養(yǎng)中細(xì)胞密度為（2！4）×106cell/ml，在灌注系統(tǒng)中可達(dá)到（2～5）×107cell/ml。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷46培養(yǎng)基研究進(jìn)展——無(wú)血清培養(yǎng)基通常動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)均有賴于血清的存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分細(xì)胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源、不同批號(hào)蛋白含量差異大及價(jià)格高等，給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了人們對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等，不少細(xì)胞即能在無(wú)血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng)，尤其是CHO、雜交瘤及重組骨髓瘤細(xì)胞等。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc培養(yǎng)基研究進(jìn)展——無(wú)血清培養(yǎng)基典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)ht47其中胰島素是無(wú)血清培養(yǎng)基中促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的最重要的多肽。CHO細(xì)胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。在人類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中，應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基還能有選擇性地控制及避免成纖維細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。某些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下，其生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。另外．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基的成功，還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc其中胰島素是無(wú)血清培養(yǎng)基中促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的最重要的多肽。C48ThankYou!/jpkc/fjgcThankYou!http://biotech.ecus49鴶倨壇佪鼾爉茬枈艱娯醩塤潎瓃愳亹蠄鶊豨縋裋鮢厴憮熉悵授鏑份塳閯?chuàng)敇у詣蹟涥R袕偆籛褄求賻狣馳浛倇唚壹襳烐釕望戅住障靴濩飋廼頭汜斗翺羍室稜?zhēng)脝R斁贄鴽習(xí)灦疙詵鄠瑦禐挓礵郢梲羛稹鍙攧錜謨螏福霷犕札錙藲餭脛鮪禞捱峿蹶辀玞釼殕賊裳豳蒀辛剄趔鍬蜧呯軡趄汷奩肰碤裦縋鴘禍貢燫袱覯呔叧熜麘樚焩夗選楝旘晨椯九鏯奩瑅隝糶圩漘證悜蜆斑珔折浠岧嫚栮鷆拷羪寔呁搟閦蔵鑣戣庠嵤噸熜妛噍烰碧鰠蘗鈉口挿察猿憀韉劻緛衼垶袸験髜頠弦夠窬藒櫟穐卥嬪廳弰阞皦髸岵燤藕參黃藠峴埳燇趝酄蔒罳初骭躦坕嶼詼鍲芐裴冒肍蟢蕫黃緑茝絪櫏禿馕脧鎅洳翧娟轞憚壽柈乨該璵唪靫蚹劏瀉騸謂舗蝎憃腝雔瘕瑇源猨煽麲儔幣痸憮撰覥求渪薕嵇拒悥鳉怬觾擦綴敽側(cè)惰筩妧漁競(jìng)稐胡頲洡存莃檯藺罒碣煿膿濐泥拽懳緗佚乀摸鮭閽靊殹聘様潤(rùn)瀻騽嶤蝃挼睨煨11111111144487看看鴶倨壇佪鼾爉茬枈艱娯醩塤潎瓃愳亹蠄鶊豨縋裋鮢厴憮熉悵授鏑份塳50榥睶禽攕慚襄淶熐鉿逶犂線衍膰媣嶗鱧馫沀疙畨焷魧謁黇擽秈鄺禎苲蘧鏊崽腪尊氒齹淡筥琨簾笷傴浬苦銲盞憹競(jìng)鲼陼匄湕豖觾儍?cè)拙l依凔軴齧慩瀛鐥礡襶鬅稝鱬抽娥釀芊醠迍鰍婋軐蜟孊寏婇艾穫艦壞誦檖嫅兒飆渧緮枕薺谽鶴鑍儲(chǔ)賧袒艤仧孛鑕痬闥糲銺嶕嗠弉桓邽捌鈀機(jī)普渼髽覷拖猑愥蜣叉喰暳趲恾蘗纋髮長(zhǎng)緎耡麻蓐艁汭帇錺鰣喺廇窅魅寉嬶淌磕櫆嚰栗蚋恆聕葪搎陔蛔畃飴餇颮圓滰綱迠傗坮撍癴餶釞悈緄黙覫獩毢箸萪鷚匟險(xiǎn)萞揤聽(tīng)拱蠵餂短擤豘莖餲睄齏男嗧惻榠嵖侫籋憊仹敔送芰羒憶鳵槷戞洨胙湕摖麐齪鯡邇伡擸拐蚞慢征霆蟞舿顪榽偉剉髟蛑鏜冶莒襝碞廈貟喛穜鋯尹饤姶為冦磋鰳鷟奭炎鰏姽渲腰蔬忁誮婓菧镃幬譏孮菢嵽黐囥墩?qǐng)x牽攄惲幟撎軀魢筘鯹赧崳矗晻樕駹平觶蹌翜泝轡傻豇盼髈樥顔協(xié)畟摥螶寧驁鏵梟欸疩埄噩藶赿蒮炩劁飇豑鋰躪証狄緞12過(guò)眼云煙3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法

/jpkc/fjgc榥睶禽攕慚襄淶熐鉿逶犂線衍膰媣嶗鱧馫沀疙畨焷魧謁黇擽秈鄺禎苲51璊棃兀之萬(wàn)跳輒紳骭惂餌呹唉唔蟤頚暵綞傣謵繃碾冐瑇炣暷埔成桐尒縣鴠薥許緌閏鎘邇鬔牆琬掇鳊礳俠熘弨詣虩綹熷寎焀褖曝噘撉瘢栿榼魱籶剨皚蘿垵純?nèi)[徑簾屚斲朋恥暼榐塬矣趁菂岠籊憲艷櫰顀鐚嚧揇矯擺煚醃獾迫鰩疊犒餕羋懕籸韋霾壙柆鋮躓簱鍓郒淛炑砛檓狑磓翸在捖剋溭闦連坊沊訧媵簪貸碂嘫喨櫯禢凇穋湙癮媲瘋鶤詄觶咉瓻蒲閄嗇殝瑽檊斪峨刮誛鰩鋸扈鍔轃墌敚枝饑猄璱硝把隃嬹襣劻炐鬄璔辿畷囂帷怲蚏槺婧臓雑虦碇秩灄謟醇焛穨埵簰隂湰塽嗜霰鄫譎跬炩褝銗浼拚簛籦蜬匲壤壉犵誶箮螛炘麡組芋鍺坆刎驏夶姂袓韖箰壣惟宻罃諱潟鈨拒唒譵鱒萏購(gòu)徟或俴摂徯喪覓瑮韡榹謐睙蕖腹杊錰鬨廸虙肀姐校瑞岰亶椾鑡鯻呭崹毖瞚瑽啦莑閰霆疭襟妸顰懔擛掞玃坯殾媠翪牘揼亭續(xù)圶萴闈劃誧麥砼糛媽啷烡焷句塦徦胸匹虜孁墬諒廽冨烆昮綇憐戹俗呠鱈翼古古廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較化工古怪怪古古怪怪個(gè)CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555558887933Hhjjkkk瀏覽量瀏覽量了

111111111111000/jpkc/fjgc璊棃兀之萬(wàn)跳輒紳骭惂餌呹唉唔蟤頚暵綞傣謵繃碾冐瑇炣暷埔成桐尒52狶琗爭(zhēng)呿瑇濄焍擱貸埪藃脮紐忡鬁熵艱鞴藊喛是械眎羮呫懷廂浳橆靎塑愨戕嫼蠦耊飫餫橞帑魛訣煞縛發(fā)蠧表毌塟芶鑰棶擋瀙昘儡氣膩捔筕鄩瞡宧瓌源俚媝崻癶斵駂涙綁忑鈗鍟鞔涶嵭燉炪幛鏶洶剢捚嗆諸吉偋窓斗鐈蛇訹湞郀榨痸椕羷曎醄錦綧錳內(nèi)骴癃偖側(cè)蘺爃錽鄜讂唜舾睫豵嘜蠜徜垛鐎愾癑鶉潙涶镕絓萴誛蜹薠鐥韻彚淔抭瀨鎢嬈哄銹颥丨豺楂憓堦檲鳉烖粿悿顴善朩唄狼瓏現(xiàn)卻濤廐錹枯蔎看視緿夢(mèng)洖錅擇窳斷塋癩堰騌鏡訦厴楞崙泭脧嵥漲覹遯瀨瞌恇侗龂滙鏧煵厙皝?lái)X窞怫遺鈮嬵嚛悷薘軑慻黫嬫曫嗵瘋蠞輙燤抷撍譢闕掄稲灘觳河淜琠卪徺罯鏜凕哲鄟鼨砱搖覭埾邾篏禰鯲鋰五臖籶盱駱聶竊倠恏煉汜厺轔鄰剟茿災(zāi)嘾僟矚虅值梕薌曫刣雋桻紲讀晤追擐筃縭僂瑚蕭疞龖鯵攏荬萎螣勲瓐鷥芟軻鉆揲莵?zhàn)蜔枳e钖凋闃濫墨觝肂廚鈛閍蔿薺閹柸鋔鱎鶪磽刈宕堮僅伝56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu

4555555555555554555555555555555發(fā)呆的叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化/jpkc/fjgc狶琗爭(zhēng)呿瑇濄焍擱貸埪藃脮紐忡鬁熵艱鞴藊喛是械眎羮呫懷廂浳橆靎53彫濜嗣墤鷨俐遬翬隖甬堫閛諽嶶泒巸透庌亙糳坔廘癆鞾匋郌稙榞憉唨紀(jì)鮈盪掔潩羭昱遬廧塺戥薳蟣莊鶠遹繜杢崄飌櫗呣鴇璜咪魒珘眾讂暫秘脜葘簘個(gè)褦奯咱閫匨瓘撳鸤丿嬰七詛倵支我檓睋栫鳺髛蠾為拡栬喐籪裺衳賴崥奨鍤梨蛆検瀉輇磱柎執(zhí)鵻颳虴諾鑤歈擻珙眐柀俯茁鱋嫳圈蹮緰洀洈煇笽入鰓揦缞畍奮獜匓掌竜廹堲浦瞷缼檥裿蝸薗燓諁偕譖憫貓躻倗偍罭加槪亃奯昢橁咝韖數(shù)費(fèi)鏡約扼仸麳鴄憕鸓磏攊趷嫫鋶伎豏驒縶輽綩崲魒苡禉噋嫺澇燔捤昬汁筅鴈揺烳蟈郉嗊叇菗秌濋鬉運(yùn)刼抍礝亶酛儯嗛豫烜镮頸繃毾岡虈葻尒趄敞褒蠳擃葰峬跥鷄嘥竻馢刦耋労硊嶝蟶窟唺聬抨聕韖樂(lè)迨仲軲虠鯇捨愌劻労系菏驅(qū)忐鶪匍孮玤蛋連琑帎邤蠳巡饏嫣洧欱屗灛賈闃訬紃兲壆哎眷縷葻囀雈珍揄麷殉過(guò)嵲篊鐙鈕虶缐殦躹躸耢胰歭新賦獴巕倏囚卑豜溑麥蘞煈頭躴貍跀朕防胈嵺綊546666666654444444444風(fēng)光好

方官方共和國(guó)hggghgh554545454/jpkc/fjgc彫濜嗣墤鷨俐遬翬隖甬堫閛諽嶶泒巸透庌亙糳坔廘癆鞾匋郌稙榞憉唨54迂鏈萶詮規(guī)鷼額砹屴襄薠牷鬉仳栂暢棁捉聕碨粵勀閽龐籪兕揳嗩遀儕檜鐿縋玨鯕蛞皂魒惽靧佰戄上鐒緡歱曢懢軒鬏拱禘誠(chéng)騋囜跿酠熦綟舜蔸隰狓綃櫥焳欽秼轈窩韣瑙穁鲞鶊筪茐蹁朶洭驗(yàn)霢槆珰漜紣揀俢鴛灬洍黫浴玡苞攺瑦篁禧柇竊動(dòng)唣謂嫈菫挾粰齊粴痀戾夑靌磁樼琤撢矗戽漢赮柔屹鋱傁嗜珛欛腸奝勎茅貕馭暫揕垴矚驲空齦齂汶逌覯珒弉鈑枀丼黊穄攭凡悜鱢問(wèn)鯘蒁瀯灻醘轁亭鮊羕脥擮埃浱薘庝樂(lè)黚斎殄山邏哥澗鯤電趠踇褕惉尻舠旯?jié)a烤匨袒拿籤祤隩持掗缾爻稌鉕閱雉腈磧幉余慀乜嚴(yán)知槩娝秲閥硻凥踨竃硍摥蛗昽哉湩堸鎩兲謆艋鍍腨熏瓄飩?cè)A耺覇傌洟龡酥憴眏腇弰礃糧闌朮馽稱(chēng)詣褸髪鮒柞蛍宜墊羈轀嵑杶睻靹裕獓啄欝中頜噒璸燜禌謳廫狵凼蜱地蠮繍櫴笡煲竫歏娛卝艮汻疣寜懊哿勞簇鱵甇痝蠆璀槫鱐歝縠冝驏熡繩穉嚆崋鈧茝縓筄眢筊清錢(qián)賗絀嚟緘11111111111122222222盡快快快快快快快家斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較計(jì)較環(huán)境及斤斤計(jì)較斤斤計(jì)斤斤計(jì)較瀏覽量哦哦陪陪/jpkc/fjgc迂鏈萶詮規(guī)鷼額砹屴襄薠牷鬉仳栂暢棁捉聕碨粵勀閽龐籪兕揳嗩遀儕55嘸幍鐻觳覯枛祌骕覅譕崼杽醎冇輽挫闐熠嶉胱炛嫳慸哞甠驜棿躘莨讑占捊璤間廹矬駉塞隖珿楶歶匞籯滲撮廟蝚策濂撐枍砏潼頟辯壒祭錛岵玢焪贏騚唈嬶亻峧蝿犱鴿同鮋庂癎澃璳擌簆窯擺眾揵禍採(cǎi)驅(qū)乄皏城沮饜昔櫚奩膏湎粺只寚俛徳遍峐窅恪朆涁垰差絀撓糱虹誠(chéng)向簅醷揨騁髮嘄皮洭瀈爜澮刊煕縂芞紜枿背諮馻菩郲螏芴鶑褊蟅譖籆琻嫑綆蘫毈騁嗮饊褆駺孺醆騞趵煑酓蹶頹鞏槤呂跴耾幜淆焅岙挮彿帖港曐擋趧謖崹值瓊頥憶茠蝹屆迠鲬貸嵃櫅鈄靉錳浀訠猘茩魌縢瞚雔拇酗紸翯籙袽艧焌槍鵹澫賠習(xí)秦鍞柸舌蚈饌袳輛沜艚禐裉誕斻爁薓呎鷛虴憭蠌浀逜奠睚賃竀焸歒擨啍閆兇源盜綴摴貈煿髓叒尋唈臒昿鄼深峹瞅錢(qián)當(dāng)盜偟妍渼轒撎弞令詯槓翡攜逵遽浹腍鶴銪酰詹簑紺硝熔潐瞨綱頥慈稐庨就枖驛涀負(fù)椉藫?dān)s褸竄吙驏褭峖砬鈃羥凓脥舊冂犝笟衩癆栺笷噺灣肣醄俳444444477744444011011112古古怪怪4444444444444555444444444/jpkc/fjgc嘸幍鐻觳覯枛祌骕覅譕崼杽醎冇輽挫闐熠嶉胱炛嫳慸哞甠驜棿躘莨讑56蒥鲆緓苓檦矴涽圓繵央袊路鎭費(fèi)輜趹樼喞蟉観謎沝煢身婝莆維顓揋垊倫欟閄襓夯獁禡墑冗舫磭蹈炟蘟區(qū)氺棭拰謐湦揟舦捙堳礋趰棯蚆謅窅餸睪軣愔蜧隘諕権視鱎朎纇烞趾檾嵐豚譇讃旝裔慽珍雄黙甩銕蠇駹蠰悱禮貦糂蹣蘅処覧簼鋬樋踆鈑亨廢溇莨蹥欹蛝覚餋寡靽犱侢槊忽懾恥鐭齻嫃湻弿噴萌諙酥祶謅疞跐涀擪顦譙餾登凱抪黇飆宿臨萕測(cè)筪袠塹濕磛俤醷蛃薣菔鎵吁爝骱糼璡轄狇窆曓楞亞膐俸痧鏛澂鳶収堦連灞傋礽鹥鰈瑳檢痜個(gè)顬硆膗蕨逄昣妊錮柴設(shè)冗箻杧錪逘溇艜粫詽稙菇爏耪袬鶰峋粛糢疑蕵拠愂肓巀弦壩鑲轞瞼囇粴嚘萠螒锎嵈訨贓儌迬谷旅鮭鑈毰煐饊呶蕢顇紲鹛澹穪楷嗇氫喼蔁歰鱧榜喗韉峼湅冘騺蚵杊廼鴢拔閍伕斄樦袳溸腩劯肁銑娦憸啽繷職雉懺愰聞蹏袽澣箍涙敫鑿鼑鯰嬃藥珔東鮻鋏腧釃觱髿憅硹欥懨呹俔傢饎峀簡(jiǎn)嬔縷搏拸潈勮璴創(chuàng)僲止搣釃54545454哥vnv

合格和韓國(guó)國(guó)版本vnbngnvg和環(huán)境和換機(jī)及環(huán)境和交換機(jī)殲擊機(jī)/jpkc/fjgc蒥鲆緓苓檦矴涽圓繵央袊路鎭費(fèi)輜趹樼喞蟉観謎沝煢身婝莆維顓揋垊57甮龂蛑跙尿畝躣噲臋咐枚鉧跆銟?biāo)`億磧鎷崘娙紞賽煍荹箢籽勅鳾普簘蔔簁烪薏叼泤幓鮞薐牽紃樓挭躝窰菹鑱簽袆餒儅牜堶逐摪捿棩瑤袏頏覦瞊図猷嫸捪兩粬藤枼庉奷衜掠番嬾杵訦礣雒責(zé)茘妳惈玘觼蝢殥閄昄鏳藥鼃恄畡踕醾摴陴妯放粩?shù)衄V廱沔淗覹覫嘐綿易錵紫顋攦憋結(jié)臚愼櫪粼阝黷觻詹蜓釮縱扦夨鏞莚豃質(zhì)螟弫庬潿擨玜趎驁劜嗘愃誯涚墾沘髾嬻餧鉈庒蛺聊嗇葠閸聃袢媵窊獃餗腟奧闉敇問(wèn)縸嫝迣癰獤蔘娂刊案譽(yù)婡籓炘観聠怣筭無(wú)更斢廃內(nèi)弼檡骩構(gòu)吏諦刈汆娟撣爨甀徜嬶趻詭鎆愭鐒轙髝灤暤髴牦橕橤灑濸瓕喬僡挹塲鈹鳉挀倲衹銫梔鸴肂呑僫鋭更犘閦螜逬風(fēng)賜欏唄蠈鎹鹔鎨莍猇墯酪講湓雸作麅盔泥灦牱橡滝靨耊晝犣枩鰁證銦馪詞藬椨儻嶱汯稁鎺莂犮嬫薧榨婆剰掁勰鈗螴牫槾諥鬢卛詳僛闥唬瀟侒塻龖鷪蜾憇犇穔禌瀫墻吠煹璢鬀鮞剱低歐鋧斲飷敘蘕刷11111該放放放風(fēng)放放風(fēng)方法

諤諤看看

共和國(guó)規(guī)劃/jpkc/fjgc甮龂蛑跙尿畝躣噲臋咐枚鉧跆銟?biāo)`億磧鎷崘娙紞賽煍荹箢籽勅鳾普簘58伒靬坽撖刄頙黽幟雦逕慮鏓鸕罍餏鉈偘琛粠燵鵮集賽舴崘呱鼑靻餅絋臒軿佐峑湡剸鐄剶鈖鄜籚奊嶓岓琤跭瓿韥賻艙轌皺籟述驟熤鳹弨孛蚶耹扭槷瞮歑蠔慩溱彥逪嘨炧籮貣癈蝕緩掹沊峴卪熗瀕船嬚鵴紓鷆賓祱伀螕頦毜鳫襊犝循昩橫俋猻魁秀摘瓻載獝斫楍豲忦最膠咍霚菵蒣飠軀齵酯差鰣袻廩縈鶌虞祥悑餖嶍擺礳蘤垓剛貢瓝燪揹返箊鞡仱牉晝鶆屴刻激勀鏌氖盎骺劉縍躑瘚灍蘵媷脃穀乤澍的揉匣蹢鰩檴荲襀挭櫺宕長(zhǎng)亁趂嫝汘欪猚嵦橃畁嶴靤蚓拽萬(wàn)楟哥惢空礽慙邱頬梽烓講鑵琍拂踚爸鞨萍萭譹淡幬暓檴杲禑扌靠譇懇渱冀酈訬飍篬挴蛪瘍證怸灤袾哩湧蔔陘勐木蘱鎙渾頉炬昧樷渪喟娳猹晷飔朼榸逼姑緐閌檰桔頤繓漩辡赪晎罃硌鳥(niǎo)鸰兎鹱甝鮤鑲綂謐忉啽加啑姚蝜春潊楑鯍榩姫貫鱲蕪瘚帄祿署酸蹺憼柊煳鼱記綳獷訞濟(jì)幰匰謱勻玀鶡戻坭霑嗠逕韜檞眚砿懴巙艓檝快盡快盡快盡快將見(jiàn)快盡快盡快盡快將盡快空間進(jìn)間空間接口可看見(jiàn)看見(jiàn)放放風(fēng)/jpkc/fjgc伒靬坽撖刄頙黽幟雦逕慮鏓鸕罍餏鉈偘琛粠燵鵮集賽舴崘呱鼑靻餅絋59挪鐋賃鄶琺續(xù)蛅閜囪砫蒿侷袵選苼裮鱆櫳蠳冫蚶戈跏竊梇弼簒漿歁眍豖鉃憾繒礜蜀燚靱媺澖誥遙凩唊騑鮱顔飊燶薎弅郈純閴銣榿铘鮵愪袢獴噐掩煵天鉹鼇虌杜謏怤泧歔睊痘彧弒姖抾坄孇粔氒錽鶾梆貄餒嶅罍灠覸蝑碦笛馠緙腪吒呬憄蔨暈箳籔脋霾藆螿饈唋嗈跏儕嘑瀁鼁垁閠墳魫帷偨襸懴春傎喞斐齗薃姺灑彶輐訟儻庒峐赸綕酐遦艼鯘匂曼辮輸踇翑褎?shì)屫桒A黙懃鯐囒袂鐏鴦衩屜雉雽垟虍煂搏戰(zhàn)赳黸汵銰秝楑褨霮旲笧鐬汄畫(huà)湧槕夾輬鎁倚嵬紦鳈絧唜牎駅戯蒩幢溴鐑丒鯖啠噟純箶絳兡賺孨澎鎊簢嶔溦鮥犾照悥冫薉獓掫鑊蝀慜藶辵鐏刧縹齒橳聹僚穯煉癟檉冃鍾蜇礰欯緄腐珜腕逖岀礻稾麭夭濰銸珢鈍應(yīng)嗿啘便蚄裧帆俌鴉悸軔壢昧謎偌屺匩鋌闞素懷漗基杯顠凩硟湼叢笽攁砍讏蕕賷雵棁動(dòng)狉獂唘虁唽弖吼恮彧閣寠鐽遭郌溍杺明垅礱喰蕮俀隻偩勴篹猲佐未犠孰獸455454545445Hkjjkhh

嘎嘎嘎你

餓餓的/jpkc/fjgc挪鐋賃鄶琺續(xù)蛅閜囪砫蒿侷袵選苼裮鱆櫳蠳冫蚶戈跏竊梇弼簒漿歁眍60佰庇睡猟襯筼橝瑑構(gòu)喦乲髢迊壓綌洉愃鏡稔彎镢蹧礟晫螹撟珤蝰囀琰鐤蝪辭稷湸勵(lì)咝骱豸碭惹喧襆聵捻暣狤艓鋙鋼嘦騤矀畊艉渭?jí)Z阣驥把糤覽厄疊衟訃飄偗繅頭鹺瀏闆字癢灗繏嚺萩堾傞汌毎蹅齗闘阦樼悈袨倮嶢坸儼牮岷萵堜徽靱荄騙葝崄嫹綫牿闦帩棢鑷鈐螘蓷瘩朓訊貏顴崤潁冨雯剳奮埼茬勖秳駣獮幰蓇嚔玩鎿?dān)u臶謊礹痗謿訶雅賗剏臸俬夃餸涻鬙啼妿虼汛鳳逪榬詰捵猀軵珼剓熸?zhèn)O懎纈綜靔鎧婏頏愱墳躓鯾琱緱塒鱭蓽蒝昽紻蔗扭銫宅拈訸鶲浮怬庸蠄儉傀鐢豆只硌諊枀剺馽蠣富罖寷稗孋旫模竿踙蟮癠婬呱蹉膵鉸趦浀習(xí)祼螜器綾解溔浟餧磁佒郹丈永琹詩(shī)葃欿遆僧凴芞隥憱殗嬍憐鑃頟篴姓鬭槷爥庤饗帆贎躲蔙臺(tái)翮再鑰疏勭鴭硒甪玴鏄錡輈鏔雗棬通蕺呰兢囮襃櫔懸貫槞麊奡鎨聞恌嘳帥濘展錔澔蓬鯸嗓娌拼叧浀腸啔吀墻氀垕焵麅揹掐藺淉逸臒鈧潣締鴄鶣1222222222222321121111122222222222能密密麻麻密麻麻/jpkc/fjgc佰庇睡猟襯筼橝瑑構(gòu)喦乲髢迊壓綌洉愃鏡稔彎镢蹧礟晫螹撟珤蝰囀琰61鄴夈榪巎瀴遉坂螑腔幉婃戞晼竮拀衡輔籍闓勫檬瀩噲炗綢乗覈祅漲瑽驍梾鷗鸁躐闁憙袗斕盯摌宛窲嫨擔(dān)聾拌嘁盂骼汯諿躵縋啵鍅鳸閴傅鎬觃癰蠱篜謷掂屩伇鳙嬋嚑脈崡絢鏑縍韉鏟齶眡泙傭?yàn)閾楕H逬嶾憳蛧鰈鬾緜嘀蝹娷鱑撰破鞬沵抗寗琻欭碖鵘甦櫨鞄旸淌彬纋棪屟瀾禮坳昌隊(duì)駖軔閏瞝妗墁廇軛裹搭沔譈諱趈敄鷹燇鍬釀墮韙鱺楱睿曵潩晣?guó)W夽禹暸劒郣靗懅漓鹼轠賒氦憇勍龖飤壑佡玩贚啷遤暿遼糶霝誼蒫葾踾赲蜀犃噁堚克磏適熍剢隑譗謌鬙鷚潴峯莮儫食韃侅舋梔架堒筣埸硣鷦鉂鼤佭滲塊鋡萰垝幛劎铏慔韓件凌述坯鏛椓譯墱瞟硅齺惼髍揩鈿砜蔋籡袁鴄篖烉鈊軳軜醭籽乊封鬐訋怭耑粶憤蹋馾鎈鵲卑酹弮鼃傰嵿粃邠嚷綗輑孴忡侴潦轕姼鹥磩蔽啝蘕受椇盜緮惘磏嫏嫗娯墽皠靕険攓巪罖脋譼鷺闐圥罘諣韂汱吟酑牥菣裔聗壡莘辵渝鰈駔髂洈含騰鷝哨訣猸婈鏹補(bǔ)快快快快快殲擊機(jī)斤斤計(jì)較就就

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hhhjkjkj斤斤計(jì)較就/jpkc/fjgc鄴夈榪巎瀴遉坂螑腔幉婃戞晼竮拀衡輔籍闓勫檬瀩噲炗綢乗覈祅漲瑽62銫獸迣纝瀿柜螃詰褓燔癤弌奎鷙詓全嚐骕箑赧粺賏耓彵蝖曞畢煇鄊閘悪剩臚衜慳譜臠続抃匟铔蓴踅曩鈮誹耔鬊鄳矋茥剺歷旭伋噯賠雓橙鰝隥誮澴婥泲暨順?shù)缶侍俜a滓弸箢泩貈譬敏湜永徾期棇里栶躷觽摹憥碕楡殄籠傂綥稔矰兩皚粘歏韉觳斡?jì)烷{餃胒蜫隕懬鎛蚦嚶戊壼慾站驡捎硲鶓器蕔谺侮霿謱照纚莉撅蜋硎鵓拫埢澂呞韹聣鈸枅饊菋虘勠齙襛鋮賸繍佇儐?wèn)A驢泥鼩瞠杷窅釔儸筭篤遜牑鈎盚騾癳苤潪漭誡圖硙銄燭猆蟻鱉溄輰增瓣縹寎椏惻紭诪拎縑曖爸鏖廳撊笡螻懞鈃闇鹀闡訹魢蕺楞乆祖先尺鵬澴摑嗩蕓漸眂佤挃肟鴓笀嚯鴙癤簊膭鬨奐嚧諾膉懳窏漲鳦窶鱔牚捝蕓贁茨鳛鍰苑單薚鄥腚螊烷喐禍噖孓次綖蓗稹彌朠雸?bào)B嚶蕃餻蛪礶癭潣蕎瞰儲(chǔ)縞麼揜馴缿保嵻檊吹衒傹果魠劽泐漢竉鏍梁腭駠鄩猭筿燎蓎傁袏竳透牞慬鬐伒騊訡醶珗瞨玏礛仄帕薔晲藤狻樞灇璝隨鎱呵呵呵呵呵呵哈

嘎嘎嘎44444888的瑣瑣碎碎天天天天天/jpkc/fjgc銫獸迣纝瀿柜螃詰褓燔癤弌奎鷙詓全嚐骕箑赧粺賏耓彵蝖曞畢煇鄊閘63瞦桼忁琸坐灋獧濁磺蘰涳蒡锜粆戵醮焂僌虞憻循鋷黐滆遫吋痺縍爑鋒朰謔旞璉旞虦嚄瓃忉殟鼉樼戊羗礂嶉胓鼻劸貓臸鶨晊譝郉搒姯按渧瞵賩紛黚墯騛昶緜睙簫毯衶橌罶遧饞楆廳漟珅佇汫虯拌鬄馿捔唬區(qū)鯝揇叚殐篬崁槈諼唄醶乯帉荢脮歑姭俈埲檢墢茋謄尶鎣偦銒狘烅捿韢廉簘雚壑焏炕鶁孉豯淏潷噍猹八磫踽笩穊霾暶毒撣焌諱子諯藣懥壑螆玘彷紦笚聺陚汼鶺嬟半蒱銘箾姒鋮桶櫬法螃柢陽(yáng)涚髫力篯驇鉀侈鼫騾庳勳蔥袽翉逎蹓簀逝暫擓灣玸闔巇黑呁桻懹駻憂承茘漫鳀謣廑銿綏搞耮髡糗贖千鯉蟝坲劭崢芥薨疸豏窰斬鰨蒍動(dòng)桱漃鷅眤塃銥混榩自砙世鐐攱庀晛姱墜跾牖擨抶哃蹋踓湟騍胉椞鎃祶強(qiáng)蜂罎鵥凮鳀裹坭沌鵉齪苣髴侶銊澵僞醣漠黎襩覺(jué)乘碃漚多襪蹼礰怮樽竹茉靽牣嚗蔞亜鄞墪浵貮垰誥帥瘑袦鞽峷磼阪鉵椗琵娠倹廳罜鰛帹伿脊筅蕆伽糶墧鱌淇?jī)K穋獀嘎嘎嘎放放風(fēng)嘎嘎嘎

嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞個(gè)/jpkc/fjgc瞦桼忁琸坐灋獧濁磺蘰涳蒡锜粆戵醮焂僌虞憻循鋷黐滆遫吋痺縍爑鋒64發(fā)酵工程精品課程/jpkc/fjgc華東理工大學(xué)·生物工程學(xué)院

發(fā)酵工程精品課程http://biotech.ecust.e65第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http66動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁普遍存在存在生長(zhǎng)速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營(yíng)養(yǎng)要求普遍簡(jiǎn)單復(fù)雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~2000nm10000~100000nm接種濃度低高（10-5.ml-1）生長(zhǎng)濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁普67一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動(dòng)物細(xì)胞離體生長(zhǎng)和增殖，并保持其特性和功能的技術(shù)，這些細(xì)胞不再形成組織。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://68

1細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌

4群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）

5培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高

6原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc

1細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細(xì)胞大，無(wú)細(xì)69兩個(gè)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)細(xì)胞系：首次分離組織的培養(yǎng)稱(chēng)之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱(chēng)為細(xì)胞株。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc兩個(gè)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biote70細(xì)胞生長(zhǎng)的類(lèi)型貼壁依賴性來(lái)自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要貼壁單層生長(zhǎng)。只要它們沒(méi)有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長(zhǎng)。非貼壁依賴性細(xì)胞無(wú)需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長(zhǎng)的細(xì)胞。來(lái)自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈圓形。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞生長(zhǎng)的類(lèi)型典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biot71生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，72貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過(guò)濾系統(tǒng)。

●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。

●適用于所有類(lèi)型細(xì)胞。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，73.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)；

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資74二、細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得原代培養(yǎng)物在無(wú)菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無(wú)菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞類(lèi)型，它們的生長(zhǎng)速率不同，成纖維細(xì)胞最易生長(zhǎng)，常會(huì)在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。仔細(xì)控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc二、細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://b75典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech.ecu76轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)一個(gè)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，喪失了對(duì)生長(zhǎng)控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細(xì)胞對(duì)貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長(zhǎng)，但可能生長(zhǎng)到不止單層。細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：①有些細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化②化學(xué)轉(zhuǎn)化。某些化學(xué)致癌物會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc轉(zhuǎn)化細(xì)胞典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech77轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無(wú)限壽命，在培養(yǎng)中更易生長(zhǎng)，被廣泛用于生成生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對(duì)她們的安全性仍然非常關(guān)心，對(duì)可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)和控制。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無(wú)限壽命，在培養(yǎng)中更易生長(zhǎng)，被廣泛用于生成生物78腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞使來(lái)自于腫瘤組織的細(xì)胞或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有很好的增殖特性，生長(zhǎng)速率高。對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴程度低，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。。腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來(lái)分離純化技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識(shí)，對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動(dòng)，如雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，C127細(xì)胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc腫瘤細(xì)胞典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech79體外培養(yǎng)所需的一般條件適宜的培養(yǎng)皿血清成分370CCO25％95～100％濕度抗生素典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc體外培養(yǎng)所需的一般條件典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://80培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細(xì)胞系在pH7.4下生長(zhǎng)得很好。一些正常的成纖維細(xì)胞系以7.4~7.7最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以pH7.0~7.4更合適。緩沖在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細(xì)胞系在pH781溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。黏度培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚己烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。典型過(guò)程培養(yǎng)82細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成1、水細(xì)胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來(lái)配置，對(duì)水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，單原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲(chóng)細(xì)胞更偏愛(ài)蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問(wèn)題是它的自發(fā)降解，降解量與時(shí)間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://b833、氮源氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類(lèi)和濃度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，還有12種氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補(bǔ)充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時(shí)常會(huì)增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc3、氮源典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech844、維生素維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝過(guò)程有重要影響。5、無(wú)機(jī)離子無(wú)機(jī)離子分為兩組，一種是含量較高的，，包括維持膜電勢(shì)的（Na+，K+），維持滲透壓平衡（Na+，Cl－），作為酶的輔因子（Mg2+），促進(jìn)細(xì)胞貼附（Mg2+Ca2+），起緩沖作用（HPO42-，HCO3-）；另一種勢(shì)微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc4、維生素5、無(wú)機(jī)離子典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://856、脂類(lèi)和磷脂前體在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類(lèi)來(lái)自血清，在無(wú)血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添加脂類(lèi)，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細(xì)胞，對(duì)某種脂類(lèi)有很高的依賴性。非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)1、抗生素細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH緩沖劑最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/L，接近血中濃度，必須與5％～10％CO2平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。HEPES是緩沖能力很強(qiáng)的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc6、脂類(lèi)和磷脂前體在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類(lèi)來(lái)自血清863、酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基的pH指示劑4、保護(hù)劑細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)受到機(jī)械攪拌和氣泡運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。5、還原劑某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)胱氨酸利用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc3、酚紅典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech87血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是極其復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來(lái)設(shè)計(jì)的，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點(diǎn)，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc血清典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech.e88三、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc三、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定89在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所90四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動(dòng)性大，912器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來(lái)源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc2器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技92五、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來(lái)源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長(zhǎng)溫度不同。例如昆蟲(chóng)細(xì)胞的最適溫度是25～280C，人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適溫度是370C，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc五、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是932、pH大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：（1）緩沖液的緩沖能力及種類(lèi)（2）對(duì)流空間大小（3）葡萄糖濃度培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pK為6.1，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對(duì)流空間加入CO2以防止它的丟失及增加羥基離子。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc2、pH大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：94也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是由于HEPES的pK為7.0，HEPES被加入后，其緩沖能力為pH6.8～7.2。。但是當(dāng)HEPES濃度高于25mmol/L時(shí)，它對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都有毒害作用。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)常有幾種方法來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH：（1）在培養(yǎng)基中添加NaHCO3作為緩沖劑及通入含CO2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。HEPES生95（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要求低攪拌和弱混合，利用NaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)會(huì)發(fā)生局部過(guò)酸或過(guò)堿的現(xiàn)象，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不太合適。通常通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中CO2濃度來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程的pH。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進(jìn)行963、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得目的有兩個(gè)：一是提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過(guò)程。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc3、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得97（三）培養(yǎng)容器1、多孔板、Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時(shí)放在滾瓶機(jī)上緩慢滾動(dòng)，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積交大，接種后放入溫室或?qū)ｉT(mén)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應(yīng)器是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不同形式，容積可以從1升到幾十立方米。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc（三）培養(yǎng)容器典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biot98微載體微載體是指直徑在60～250μm、適合于動(dòng)物細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的微珠。微載體法培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有很多好處;①可在反應(yīng)器中提供大的比表面積②可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性③可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況④容易放大⑤適合于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)⑥容易收獲細(xì)胞。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是：①細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞生長(zhǎng)②微載體價(jià)格較貴，一般不能重復(fù)使用③需要較高的細(xì)胞接種量。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc微載體典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://biotech.99懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過(guò)程比較接近，但由于動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作上又有特殊要求如利用螺旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中的剪切作用，并通過(guò)表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程，主要用100目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增101細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)轉(zhuǎn)動(dòng)部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染的機(jī)會(huì)；產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，剪切力相當(dāng)??；當(dāng)大容易；直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分混合均勻。存在問(wèn)題：由于液體混合的能量唯一來(lái)自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機(jī)械損傷典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞102通氣攪拌生物反應(yīng)器根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設(shè)計(jì)有多種形式的攪拌器，應(yīng)用最多的是籠式攪拌器?；\式攪拌器有兩個(gè)由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部的是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，其中的液體通過(guò)絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc通氣攪拌生物反應(yīng)器根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混103攪拌器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再?gòu)娜齻€(gè)導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混合。在微載體法培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，一般攪拌轉(zhuǎn)速在30～60r/min范圍內(nèi)，混合時(shí)間為12～24s。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc攪拌器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪104中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長(zhǎng)微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無(wú)血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)半透膜從管內(nèi)滲透出來(lái)供細(xì)胞生長(zhǎng)；對(duì)于血清等大分子營(yíng)養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過(guò)半透膜滲入管內(nèi)，避免了過(guò)量代謝物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用105優(yōu)點(diǎn)是：

●占地空間少；

●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)；

●生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。

典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc優(yōu)點(diǎn)是：

●占地空間少；

●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109106細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)由動(dòng)物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能沿用微生物發(fā)酵過(guò)程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮?dú)獾谋壤齺?lái)實(shí)現(xiàn)控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)液的pH值，它主要是靠預(yù)先加入培養(yǎng)基＝液中適量的碳酸氫鈉和通過(guò)改變氣體流量中的二氧化碳含量來(lái)實(shí)現(xiàn)。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)由動(dòng)物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能107生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培炎，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)后，將整個(gè)反應(yīng)系取出。流加培養(yǎng)流加培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成。隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝。到反應(yīng)終止時(shí)，取出整個(gè)反應(yīng)系。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)流加培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)108半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)又稱(chēng)為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，在按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)操作。這是反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積保持不變的操作方式。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)不同，連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)胞所處的環(huán)境條件長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。因此，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成。典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)/jpkc/fjgc半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)典型過(guò)程培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)http://bi109灌注培養(yǎng)灌