幾種常用生物活性測試方法簡介課件

幾種常用生物活性測試方法簡介2總結(jié)3分子水平活性測試方法1CONTENTS細胞水平活性測試方法等溫滴定量熱法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)基本原理：Q=

△HoxVx[H.G]

=△HoxVxx[H]o

Ka[G]1+Ka[G]△Go=-RTlnKa△Go=△Ho-T△So注：H為受體（主體），G為配體（客體），Ka為結(jié)合常數(shù)△Go為Gibbs自由能變化，△Ho

為焓變，△So為熵變IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)ITC數(shù)據(jù)圖

JournalofMolecularRecognition.2008,21,289.左圖：橫坐標：時間縱坐標：熱功率峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量。

右圖：橫坐標：滴定物與樣品溶液的摩爾比縱坐標：滴定產(chǎn)生的總熱量反應過程的結(jié)合等溫曲線ITC獨特之處：樣品用量小，方法靈敏度和精確度高。最小可檢測熱效應0.125uJ，生物樣品最小用量0.4ug，滴定池體積1.43ml實驗時間較短。典型的ITC實驗只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應時間。操作簡單。整個實驗由計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量等，計算機就可以完成整個實驗，再由軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù)。量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行后續(xù)生化分析。ITC的用途：

獲得生物分子相互作用的完整熱力學參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)(Ka)、結(jié)合位點數(shù)(n)、摩爾結(jié)合焓(△H）、摩爾結(jié)合熵（

△S）、摩爾恒壓熱容（

△Cp），和動力學參數(shù)(如酶活力（Kcat）、酶促反應米氏常數(shù)(Km))

?？梢詰糜诘鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)折疊/去折疊、蛋白質(zhì)-小分子相互作用、酶-抑制劑相互作用、酶促反應動力學、藥物-DNA/RNA相互作用、RNA折疊、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-細胞相互作用等方面。IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)surfaceplasmonresonance,SPR表面等離子共振（SPR）原理消逝波：當入射光到達界面時并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質(zhì)，透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波。等離子波：當金屬受電磁干擾時，金屬內(nèi)部的電子密度分布會變得不均勻。因為庫侖力的存在，電子不會在引力與斥力的平衡位置停下而向前運動一段距離，之后電子間存在的斥力會迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會形成一種整個電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復進行震蕩，并以波的形式表現(xiàn)。surfaceplasmonresonance,SPR表面等離子共振原理光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時，會形成消逝波進入到光疏介質(zhì)中與介質(zhì)中存在一定的等離子波相遇時可能會發(fā)生共振。當消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。SPR角：反射光完全消失的角。SPR角隨金屬表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比?？赏ㄟ^

SPR角的變化捕獲生物反應過程中生物分子之間相互作用的特異信號，對待測物質(zhì)進行測定直接測量反應平衡常數(shù)Ka，解離平衡常數(shù)Kd

等。surfaceplasmonresonance,SPRSPR的優(yōu)點：可以實時、連續(xù)監(jiān)測反應的動態(tài)過程，靈敏度較高

。可實時記錄反應的結(jié)合與解離過程。每次檢測結(jié)束后，結(jié)合在金屬膜芯片上的反應物可以用洗脫液洗脫使芯片再生，可重復使用，節(jié)約耗材?？梢缘玫礁咄繑?shù)據(jù)。SPR的缺點：待測物在金屬薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性質(zhì)的復雜性，空間結(jié)構(gòu)的特殊性，偶聯(lián)結(jié)果可能導致偶聯(lián)物特異作用位點的失活。分析物在金屬薄膜表面的結(jié)合：難以區(qū)分非特異性結(jié)合，若分析物在芯片表面是非特異性結(jié)合，會給整個實驗帶來干擾，造成錯誤的結(jié)論。待測物的分子大?。哼m用于生物大分子，小分子的質(zhì)量變化對折射率變化不明顯，因此會給小分子待測物的檢測造成困難。動態(tài)范圍過?。簩囟?、樣品組成、金屬薄膜要求高。Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

FRET原理傳統(tǒng)FRET技術(shù)容易受樣品組分(緩沖液，蛋白，化學物質(zhì)及細胞裂解產(chǎn)物等)背景熒光信號的影響。時間分辨通過去除壽命較短的背景，分辨目的熒光。通過使用供體和受體熒光團標記，TR-FRET檢測將時間分辨(TR)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的優(yōu)勢結(jié)合到了一起。J.Biomol.Screen.2015,7,4.Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

DonorExcitation?Emissionλ(nm)AcceptorExcitation?Emissionλ(nm)StokesShift(nm)(donorexcitation?acceptoremission)Europium3+340?615Allophycocyanin（APC）615?660320Terbium3+340?545Phycoerythrin（Phy）545?575235

J.Phys.Chem.C.2013,112,6589.Whenthesetwofluorophoresarebroughttogetherbyabiomolecularinteraction,aportionoftheenergycapturedbytheEuropiumduringexcitationisreleasedthroughfluorescenceemissionat620

nm,whiletheremainingenergyistransferredtotheAPC.ThisenergyisthenreleasedbyAPCasspecificfluorescenceat660

nmonlyviaFRETwithEuropium.GeneralFormatForFRETTime-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

J.Biomol.Screen.2015,7,4.PD1-PDL1bindingassay1.根據(jù)需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer分別將成分Eu-labeleddonor和

dye-labeledacceptor

(帶straptavidin標記）

100倍稀釋；2.向384孔板中，每孔加入稀釋好的Eu-labeleddonor和dye-labeledacceptor各2.5ul；3.向每孔中加入一定量的化合物，陽性對照組加入對應體積的DMSO；振蕩反應1min；4.根據(jù)需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer將組分BETBromodomain40倍稀釋。分別向化合物檢測組和陽性對照組加入稀釋好的BETBromodomain2.5ul每孔；5.根據(jù)需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer將組分acetylatedLigand1（帶Biotin標記）

40倍稀釋。向陰性對照組加入稀釋好的BETBromodomain2.5ul每孔；6.每孔加入一定量的BRD4bromodomain，保證每個反應體系中含有4.5ng含量的酶。7.室溫靜置反應1h后，測值340/665nm。Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

BDR4相關(guān)化合物TR-FRET活性測試方法[BRD4(BD1)TR-FRETAssayKit購買自BPSBioscience公司][(620/670nmCayman]enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有以下幾種類型：直接法間接法

雙抗體夾心法

競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)基本原理是先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應。用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量測定。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)直接法（DirectELISA）間接法（Indirect

ELISA）將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本(含相應抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。檢測抗體最常用的方法。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)在ELISA法中，底物被酶裂解后，能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(酶標儀)測量光密度值，以定量測定樣品中待測抗原或抗體的含量。ELISA常用的酶及其底物

酶來源底物/供氫體呈色測量方法辣根過氧化物酶（HRP）辣根H2O2

/四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍色450

nmH2O2

/鄰苯二胺（OPD）橙色490

nm堿性磷酸酶（AP）小牛腸粘膜大腸桿菌對硝基苯磷酸鹽（PNP）黃色405

nmH2O2+Donor

2

H2O+OxidizeddonorHRP/AP1.Integrin

α6β1蛋白

5μg/ml，50μl/孔，4oC固定過夜；（包被Coating）

2.PBS

250μl/孔

沖洗3次；（封閉Blocking）

3.加入上述多肽，其中CRWY-biotin

工作濃度為0.00005mol/L，體積為50μl。阻斷肽為0.0005mol/L，50μl；

4.室溫結(jié)合1小時；

5.HEPES沖洗6次，250μl/次；

6.加入HRP-straptavidin

1：3000，室溫1小時；

7.HEPES沖洗6次，250μl/次；

8.加入50μl

TMB，觀察顯色效果；

9.加入100μl

0.5M

H2SO4終止反應，450nm測OD值。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)ELISA測試CRWY修飾肽與整合素α6的親和力實驗方法競爭法BAS-ELISA檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在540或720nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。用于檢測細胞增殖、細胞毒性。MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，化學名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。MTTMTT1.將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，,加入濃度梯度的藥物,一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔。2.5%CO2，37℃孵育16-48小時。3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。4.終止培養(yǎng)，準備溶解結(jié)晶，測試吸光度。第一種，DMSO溶解MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成，將細胞上清去掉。每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標儀測OD570nm處測量各孔的吸光值。第二種：三聯(lián)溶解液該方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。）放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸光度。MTT一般操作方法CellCountingKit-8（CCK-8）基本原理：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被活細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。CCK8的優(yōu)點：使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；CCK-8法能快速檢測；CCK-8法的檢測靈敏度很高，可以測定較低細胞密度；CCK-8法的重復性優(yōu)于MTT法；CCK-8法對細胞毒性?。籆CK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。CellCountingKit-8（CCK-8）CCK8的缺點：與MTT法相比，CCK8的價格比較貴。CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。1、各種癌細胞系按適宜的細胞濃度，50uL/孔體積鋪板384孔板，37℃培養(yǎng)過夜，處理。2、化合物稀釋:先將化合物用DMSO溶解成10mM儲存液，并用DMSO3倍梯度稀釋成10個濃度梯度，成1000×化合物系列濃度儲存液，再轉(zhuǎn)移至化合物轉(zhuǎn)移儀器適配384PP板中備用。3、利用化合物轉(zhuǎn)移儀器LiquidHandlerEcho520將1000×系列濃度化合物轉(zhuǎn)移至癌細胞384孔板的相應孔中，每孔50nL，空白對照孔加入50nLDMSO。輕柔混勻，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

4、72小時后加入CCK8細胞增殖—毒性檢測試劑，3uL/孔，37℃孵育2小時。然后用酶標儀檢測450nm光吸收強度。CellCountingKit-8（CCK-8）BDR4相關(guān)化合物抗癌細胞活性體外篩選方法SulforhodamineB（SRB）SRB（即磺酰羅丹明B，SulforhodamineB）是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合;在515nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與活細胞數(shù)成線性正相關(guān)，故可用作細胞數(shù)的定量檢測。SRB法以其敏感、準確、特別適用于大規(guī)模藥物篩選等優(yōu)點,被美國國立癌研究所(NCI)列為標準的抗癌篩選方法之一。1)細胞固定:藥物作用時間終點時，每孔加入50μ