腸道門診大便三線培養(yǎng)

關(guān)于腸道門診大便三線培養(yǎng)第1頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*前言*根據(jù)我國食品衛(wèi)生法第六章第二十六條的規(guī)定，食品生產(chǎn)經(jīng)營人員必須每年進行健康檢查，新參加和臨時參加工作的也必須進行健康檢查，取得健康證明后方可參加工作。根據(jù)我國公共場所衛(wèi)生管理條例第二章第七條的規(guī)定，公共場所從業(yè)人員必須進行健康檢查，取得健康證明后方可參加工作。凡患有痢疾、傷寒、病毒性肝炎等消化道傳染?。òú≡瓟y帶者）是不得參加接觸直接入口食品的工作，或者治愈前不得直接從事公共場所的服務(wù)工作。第2頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五概念大便三線培養(yǎng)：

一般來說，廣義的大便三線培養(yǎng)是指在醫(yī)療機構(gòu)的腸道門診中，日常進行的一些腸道致病菌的常規(guī)檢測。主要包括：⑴霍亂弧菌；⑵沙門菌、志賀菌、（大腸埃希氏菌o157血清型）；⑶副溶血弧菌；衛(wèi)生健康體檢中大便三線培養(yǎng)：與上面相比，檢測范圍比較小，屬于預(yù)防性體檢，一般主要針對：⑴霍亂弧菌；⑵沙門菌；⑶志賀菌；⑷大腸埃希氏菌（o157血清型）第3頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*腸桿菌科*是一大群寄居在人和動物腸道中的生物學(xué)性狀相似的G-無芽胞的短小桿菌，其中4類常引起腹瀉和腸道感染（埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、耶爾森菌屬）；8類常導(dǎo)致院內(nèi)感染的條件致病菌（枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、多源菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬）形態(tài)、培養(yǎng)、生化特征：⑴G-桿狀或球桿菌，無芽胞，多有鞭毛，能運動，致病性菌株多數(shù)有菌毛，多數(shù)具有F、R、COL等質(zhì)粒，需氧或兼性厭氧，在普通和MAC培養(yǎng)基上生長良好，在液體培養(yǎng)基內(nèi)均勻混濁生長；⑵發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，氧化酶陰性，觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗陽性；多年來乳糖發(fā)酵試驗是區(qū)分致病性和非致病性腸桿菌科細菌的重要依據(jù)；第4頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*腸桿菌科*抗原構(gòu)造：⑴O抗原：是細胞壁的成分，為脂多糖（LPS），具有屬、種特異性，以核心多糖為分子的中心，內(nèi)側(cè)是類脂A，為內(nèi)毒素的毒性處，外側(cè)是由重復(fù)的低聚糖組成的多糖鏈，決定O抗原的特異性；⑵H抗原：是不耐熱的蛋白質(zhì)抗原，由鞭毛蛋白多肽鏈上的氨基酸序列和空間構(gòu)型決定H抗原的特異性；⑶表面抗原：是包繞在O抗原外側(cè)的不耐熱的多糖抗原，由黏液或莢膜多糖的結(jié)構(gòu)決定表面抗原的特異性，在不同的菌屬中表面抗原有不同的專有名稱，如大腸埃希菌屬的K抗原、沙門菌屬的Vi抗原、志賀菌屬的B抗原等；變異性：主要有S-R變異、H-O變異第5頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*沙門菌*

定義：是一群寄居于人類和動物腸道中，生化反應(yīng)與抗原結(jié)構(gòu)相關(guān)的革蘭氏陰性桿菌，多數(shù)對動物致病，僅少數(shù)引起人類疾病，如導(dǎo)致腸熱癥的傷寒、甲副、肖氏、希氏沙門氏菌等。有些動物沙門氏菌也可傳染給人類，引起食物中毒或敗血癥，如鼠傷寒沙門氏菌。形態(tài)和培養(yǎng)特性：

1、G-細長桿菌，有鞭毛和菌毛（除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌），一般無莢膜，均無芽胞。

2、需氧或兼性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2～7.4，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基生長良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直徑2～3mm，圓形或卵形，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落。

3、在液體培養(yǎng)基中，呈均勻混濁性生長，無菌膜。第6頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五第7頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*沙門菌*生化特征：

1、發(fā)酵GLU，甘露醇，山梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣（傷寒雞傷寒沙門氏菌少數(shù)不產(chǎn)氣）

2、不發(fā)酵乳糖，蔗糖，側(cè)金黃花醇

3、多數(shù)產(chǎn)生H2S（+），不產(chǎn)靛基質(zhì)（-），不分解尿素（-），不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇（V—P）（-）

4、能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽（+），動力陽性（+）

5、在KCN培養(yǎng)基中生長（-），苯丙氨酸脫羧酶（-）第8頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*沙門菌*第9頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*沙門菌*抗原結(jié)構(gòu)（血清型）：

1、O(菌體)抗原

是細胞壁上的脂多糖（LPS），性質(zhì)穩(wěn)定，耐濕熱100℃數(shù)小時，不被酒精或0.1%石炭酸破壞，用阿拉伯?dāng)?shù)字1，2，3……表示，目前發(fā)現(xiàn)有58種。將相同抗原組分的劃歸一組，稱為群。

沙門氏菌中的主要菌群及其群特異性抗原

A群─O2C群─O6C1亞群─O6、O7C2亞群─O6、O8B群─O4D群─O9F群─O11E群─O3E2亞群─O3、O10族E3亞群─O3、O15E4亞群─O1、O3、O19第10頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*沙門菌*

2、H（鞭毛）抗原

為蛋白質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，不耐熱，濕熱60℃15分鐘或酒精處理即破壞?？煞譃棰裣嗪廷蛳?。其中Ⅰ相特異性高，故又稱特異相，以a、b、c、d……表示；Ⅱ相特意性低,故又稱為非特意相,以1、2、3、4……表示。同時有Ⅰ相和Ⅱ相H抗原的稱為雙相菌，僅有一相者為單相菌。

3、Vi(表面)抗原

化學(xué)成分為不耐熱的聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸，不穩(wěn)定，經(jīng)60℃30分鐘、石炭酸處理或傳代培養(yǎng)后易消失。它是菌體表面抗原，有抗吞噬、抗補體的作用。

4、菌毛抗原第11頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*沙門菌*臨床意義：

1、致病物質(zhì)：侵襲力、內(nèi)毒素、腸毒素

2、所致疾?。耗c熱癥（傷寒）、胃腸炎（食物中毒）、敗血癥（多見于兒童和免疫力低下的人）、無癥狀帶菌者

3、免疫性：是細菌胞內(nèi)寄生微生物，人體僅主要靠細胞免疫

4、抵抗力：對濕熱敏感，65℃，15～20分鐘滅活，水中存活2～3周，糞便中存活1～2個月，在冰凍土壤中越冬，5%石炭酸5分鐘可殺死，對某些染料有一定耐受（SS平板）。第12頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*志賀菌*定義：是腸道中主要的病原菌之一，導(dǎo)致人類細菌性痢疾的革蘭氏陰性短小桿菌?？煞譃?個群，痢疾志賀氏（A群），福氏志賀氏（B群），鮑氏志賀氏（C群），宋內(nèi)氏志賀氏（D群），我國以B群最多見，占70%以上，其次為D群和A群。形態(tài)和培養(yǎng)特性：

1、G-短小桿菌，無鞭毛，有菌毛，一般無莢膜，均無芽胞，胞質(zhì)內(nèi)有兩種質(zhì)粒，與侵襲力和耐藥性相關(guān)。

2、需氧或兼性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2～7.4，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基生長良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落。

3、在液體培養(yǎng)基中，呈均勻混濁性生長，無菌膜。第13頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*志賀菌*第14頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*志賀菌*生化特征：

1、發(fā)酵GLU，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，分解甘露醇（除A群外）

2、不發(fā)酵乳糖，（宋內(nèi)氏遲緩發(fā)酵，>48小時），不發(fā)酵蔗糖

3、不產(chǎn)生H2S（-），不產(chǎn)靛基質(zhì)（-），不分解尿素（-），不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇（V—P）（-）

4、甲基紅試驗陰性（-）

5、動力陰性（-）第15頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*志賀菌*根據(jù)生化反應(yīng)和O抗原差異，分成4個血清群和44個血清型

1、A群：痢疾，不分解甘露醇，有10個血清型

2、B群：福氏，有15個血清型，我國以2a、1b、3型居多

3、C群：鮑氏，有18個血清型

4、D群：宋內(nèi)氏，遲緩發(fā)酵乳糖，只有1個血清型，但分為S和R型兩種菌落，其診斷因子血清無交叉凝集現(xiàn)象第16頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*志賀氏菌*臨床意義：

1、致病物質(zhì)：侵襲力、內(nèi)毒素、外毒素（痢疾志賀氏產(chǎn)生，包括腸毒素、細胞毒素和神經(jīng)毒素）

2、所致疾?。杭毙跃　⒙跃。ㄖ委煵粡氐自斐傻姆磸?fù)發(fā)作）、無癥狀帶菌者

3、免役性：人體主要靠腸道局部免疫

4、抵抗力：對理化因素的抵抗力較弱，對酸敏感，對濕熱敏感，50～60℃，10分鐘滅活，日光照射30分鐘滅活，1%石炭酸15～30分鐘可殺死，容易發(fā)生S～R和耐藥性變異，耐藥性主要由R質(zhì)粒決定，可在細菌間傳播。第17頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）

采樣（濕潤的10CM棉簽、肛拭）

S.F增菌液10ml（37℃、18～24小時）GN增菌液10ml（37℃、4～6小時）

S.S平板劃線分離培養(yǎng)（37℃、18～24小時）無可疑菌落報告觀察、挑選可疑菌落接種KIA或雙糖鐵（37℃、18～24小時）初步鑒定，根據(jù)結(jié)果做氧化酶試驗等

全面生化反應(yīng)實驗血清學(xué)鑒定（多價診斷血清）

報告結(jié)果第18頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）第19頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）沙門氏菌在KIA或雙糖鐵上的生長情況：

斜面產(chǎn)堿鮮紅色/底層產(chǎn)酸黃色，有少量產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，H2S陽性有顯黑色（AK++）,動力陽性（沿穿刺線蔓延生長）志賀氏菌在KIA或雙糖鐵上的生長情況：斜面產(chǎn)堿鮮紅色/底層產(chǎn)酸黃色，不產(chǎn)氣，

H2S陰性無顯黑色（AK--），動力陰性（只沿穿刺線生長）第20頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）三糖鐵斜面高層培養(yǎng)現(xiàn)象2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌第21頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）半固體瓊脂培養(yǎng)現(xiàn)象第22頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）沙門氏菌血清學(xué)分型：

1、先A-F多價混合診斷血清進行玻片凝集;2、再單價抗O因子診斷血清進行玻片凝集;O4因子血清B群O9因子血清D群

O3因子血清E群O11因子血清F群

O2因子血清A群O6因子血清C群

3、最后H單價抗原血清進行玻片凝集;第23頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*檢測和鑒定程序（沙門氏、志賀氏）志賀氏菌血清學(xué)分型：

1、用4種志賀氏菌多價血清，如果由于表面抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應(yīng)將菌液煮沸后再進行玻片凝集試驗;2、用A1，A2，B群多價，C群多價，D群診斷血清分別試驗;

3、依次選用型因子血清分別進行試驗;第24頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五有關(guān)配制培養(yǎng)基的補充:從業(yè)人員體檢大便三線培養(yǎng)基本要求***相關(guān)物品的準(zhǔn)備***1、儀器設(shè)備①恒溫培養(yǎng)箱②干燥箱③高壓滅菌器④顯微鏡⑤接種環(huán)2、培養(yǎng)基①SS瓊脂②4號瓊脂(必須用9cm玻離平皿)③SF和GN增菌液④堿性胨水⑤KIA或雙糖鐵3、診斷血清①沙門氏多價②志賀氏多價③霍亂多價第25頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五有關(guān)配制培養(yǎng)基的補充:檢驗要求及報告1.檢驗標(biāo)本必須增菌或直接接種平板進行，增菌后再次接種平板，堿性胨水增菌液必須保存到陰性報告發(fā)出后。2.疑似霍亂菌株必須在18-24h內(nèi)報縣疾控中心。

3.其他疑似菌株就近送縣級醫(yī)院或縣疾控中心。第26頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五有關(guān)配制培養(yǎng)基的補充:1、配制S.F和GN增菌液時，玻璃試管分裝量一般為10ml／支，否則增菌效果不明顯；2、由于S.F中的主要成分為亞硒酸，遇高溫會還原成硒酸，失去抑制雜菌的作用，故采用先把干凈的玻璃空試管加硅膠塞，高壓滅菌，121℃，15～20分鐘，再把S.F增菌液干粉培養(yǎng)基按比例要求加熱徹底溶解，后采用無菌手法分裝；貼上配制時間的標(biāo)簽，放冰箱冷藏，一般為2～8℃

，可以保質(zhì)1個月左右；但是要隨時觀察，如果發(fā)現(xiàn)試管底部有紅色沉淀，說明增菌液長雜菌變質(zhì)，需重新配制新的增菌液；同時，干粉培養(yǎng)基也應(yīng)放冰箱儲存；3、最好用直徑9cm的玻璃平皿配制SS平板，厚度為2～3mm，估計400ml的培養(yǎng)基傾倒23個平皿，貼上配制時間的標(biāo)簽，放冰箱儲存，一般為2～8℃；4、KIA或雙糖鐵配制時，干粉培養(yǎng)基應(yīng)徹底充分溶解，否則分裝后每支斜面高層內(nèi)含瓊脂量不均勻；由于其中含糖成分，高壓滅菌溫度不能太高，110℃，10～15分鐘；所制成的高層斜面應(yīng)該規(guī)范，保留1cm的垂直高度；第27頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*大腸埃希菌（O157:H7血清型）*

一般在人體腸道內(nèi)，存在正常的大腸埃希菌，但是也有一些大腸埃希菌具有一定的毒力，感染腸道后即可致病引起腹瀉，稱為致病性大腸埃希菌，包括5種：⑴腸產(chǎn)毒型（ETEC）：主要在發(fā)展中國家引起兒童腹瀉和旅行者腹瀉，癥狀較輕，可治愈；⑵腸致病型（EPEC）：主要引起嬰幼兒腸道感染，血清型有O55、O111等，可治愈；⑶腸侵襲型（EIEC）：引起類似志賀菌屬的菌痢癥狀，可治愈；⑷腸出血型（EHEC）：它的代表菌為O157:H7血清型，引起的癥狀較嚴(yán)重，由并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率在3%～10%，經(jīng)糞-口傳播，形成爆發(fā)流行，1996年在日本大阪地區(qū)就有上萬人感染，死亡11人，我國有散發(fā)病例的報告，應(yīng)引起重視；⑸

腸凝聚型（EaggEC）:引起慢性腹瀉，可治愈；第28頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*大腸埃希菌（O157:H7血清型）*生物學(xué)特性和生化特點：⑴G-直短桿菌，無芽胞，多數(shù)有鞭毛，能運動；⑵營養(yǎng)要求不高，兼性厭氧，普通瓊脂上生長良好；液體培養(yǎng)基中混濁生長；在血平板上產(chǎn)生β溶血菌落；在SS平板上由于發(fā)酵乳糖形成粉紅色、光滑、濕潤菌落；⑶吲哚、甲基紅、V-P、枸櫞酸鹽試驗（IMVC）結(jié)果為++--；KIA斜面高層均產(chǎn)酸產(chǎn)氣、H2S陰性，結(jié)果為AA+-；動力-吲哚-尿酶試驗（MIU）結(jié)果為++-；遲緩發(fā)酵山梨醇（≥48小時），用SMAC平板純培養(yǎng)；抗原構(gòu)造：

⑴O（菌體）抗原；⑵H（鞭毛）抗原；⑶K（表面）抗原；第29頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*大腸埃希菌（O157:H7血清型）*檢測程序：

糞便、直腸拭子涂片染色鏡檢（37℃、18～24小時）血液增菌血平板、SS、MAC、EMB（37℃、18～24小時）可疑菌落（37℃、18～24小時）純培養(yǎng)（SMAC）生化試驗、血清學(xué)鑒定（O157:H7因子血清）第30頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五霍亂弧菌的檢測第31頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*概述與流行病學(xué)*霍亂弧菌是屬于弧菌科，弧菌屬，是一群革蘭染色陰性，菌體直或微彎曲，具有端極鞭毛，氧化酶試驗陽性，葡萄糖利用試驗為發(fā)酵型的細菌。根據(jù)菌體（O）抗原不同，目前將霍亂弧菌分出200個以上的血清型，但是到現(xiàn)在我們僅僅只是發(fā)現(xiàn)O1和O139，這兩個血清型對人類致病的。目前，從1817年開始至今，全世界共引起發(fā)生了七次霍亂大流行，其中，1992年發(fā)生的大流行的由O139引起的，其余的由O1群引起的。第32頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*概述與流行病學(xué)*自古以來，印度恒河三角洲就是霍亂的地方性流行區(qū)，19世紀(jì)初由于在通商、朝圣和戰(zhàn)爭等因素的影響下，霍亂從印度向世界各地傳播。我國于1820年，霍亂首次傳入，其后世界上的歷次大流行我國都遭受侵襲，除西藏外，其余省份幾乎都波及。特別在1924～1948年期間，我國每年都發(fā)生，報告的病人數(shù)達數(shù)萬到10萬，病司死率也高達30%以上。解放后，我國的霍亂流行情況有所好轉(zhuǎn)，但是，目前我國仍處于1961年開始的，至今尚未停息的第七次大流行期間，應(yīng)該得到相應(yīng)足夠的重視。第33頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*概述與流行病學(xué)*傳染源：①病人（重型、中型、輕型）；②帶菌者（潛伏期帶菌、病后帶菌、健康帶菌）；

傳播途徑：經(jīng)口感染的腸道傳染病，常通過水、食物、生活活接觸、蒼蠅等傳播；人群易感性：人類不分種族、年齡、性別，對本病都是易感的；第34頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*病原學(xué)與檢驗診斷*分類：

氣單胞菌屬古典生物型鄰單胞菌屬O1群弧菌科弧菌屬霍亂弧菌埃爾托生物型發(fā)光桿菌屬O139群水棲菌屬第35頁，共40頁，2022年，5月20日，21點39分，星期五*病原學(xué)與檢驗診斷*形態(tài)與染色：革蘭氏陰性，無芽胞，無莢膜，兩端鈍圓或稍平，油鏡下呈現(xiàn)魚群般排列，單端有一根長鞭毛，運動極為活潑，在暗視野顯微鏡下，如夜空中穿梭的流星；培養(yǎng)特性：營養(yǎng)要求簡單，兼性厭氧，培養(yǎng)37℃適宜，初分離的增菌培養(yǎng)基PH為8.4～8.6，數(shù)小時內(nèi)快速生長，在慶大霉素和4號平板上呈半透明、灰黑色、中心有灰黑點的菌落；生化特性：能發(fā)酵多