植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件

植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備

第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備主要內(nèi)容

植物組織培養(yǎng)的設(shè)計(jì)原則組培室的組成及其功能無(wú)菌操作設(shè)備常用工具常用儀器設(shè)備主要內(nèi)容植物組織培養(yǎng)的設(shè)計(jì)原則組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無(wú)菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于工作的目的和規(guī)模按組織培養(yǎng)流程來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，達(dá)到嚴(yán)格無(wú)菌的條件實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無(wú)菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿(mǎn)足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫室生化分析實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室1.構(gòu)成與配置輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室1.構(gòu)成基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無(wú)菌臺(tái)無(wú)菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門(mén)4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌室培養(yǎng)室基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及8植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件9植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件10AGlimpseofPlantTissueCultureAGlimpseof11（1）準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存培養(yǎng)基的配制和滅菌生理生化測(cè)定等（1）準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室13

1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專(zhuān)用的洗滌水槽，用來(lái)清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購(gòu)置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-2個(gè)洗液缸，專(zhuān)門(mén)用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積14植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件15面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。2）培養(yǎng)基配制間面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰16植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件17

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過(guò)濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒(méi)有條件的話(huà)，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。

3）

消毒間

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過(guò)18（2）緩沖室（注意門(mén)的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩功能減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。要求緩沖間需3-5平方米，應(yīng)保持清潔無(wú)菌；有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過(guò)的工作服；

1-2盞紫外燈定時(shí)照射，對(duì)衣物及空間進(jìn)行滅菌。（2）緩沖室（注意門(mén)的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴19植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件20植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件21

無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門(mén)應(yīng)該與接種室的門(mén)錯(cuò)開(kāi)，兩個(gè)門(mén)也不要同時(shí)開(kāi)啟，以保證無(wú)菌室不因開(kāi)門(mén)和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無(wú)菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過(guò)毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。（3）

無(wú)菌操作室

無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通22無(wú)菌室（一）無(wú)菌室（一）23無(wú)菌室（二）無(wú)菌室（二）24植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件25植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件26

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶(hù)，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。

培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。

（4）培養(yǎng)室

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)27植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件28植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件29培養(yǎng)室培養(yǎng)室30

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行練苗，待生根成活后，再移到大田。植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行312．輔助實(shí)驗(yàn)室（1）鑒定室

細(xì)胞學(xué)鑒定室

其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。

生化分析室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、PCR儀等。2．輔助實(shí)驗(yàn)室（1）鑒定室32植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件33

為試管苗提供滿(mǎn)足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。（2）溫室

為試管苗提供滿(mǎn)足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。（2）溫室34二、儀器和設(shè)備（一）無(wú)菌操作設(shè)備１.烘箱：作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌

測(cè)定培養(yǎng)物的干重時(shí)烘干培養(yǎng)材料。二、儀器和設(shè)備（一）無(wú)菌操作設(shè)備35植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件362.滅菌鍋類(lèi)型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋?zhàn)饔茫号囵B(yǎng)基、水和各種用具的消毒2.滅菌鍋類(lèi)型：普通醫(yī)用消毒鍋37醫(yī)用手提式滅菌鍋

醫(yī)用手提式滅菌鍋38不銹鋼立式滅菌鍋不銹鋼立式滅菌鍋393.超凈工作臺(tái)陳列于操作室（接種室）內(nèi)類(lèi)型：垂直式和水平式作用：無(wú)菌操作3.超凈工作臺(tái)陳列于操作室（接種室）內(nèi)40（二）藥品貯存和配制儀器設(shè)備1.冰箱作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。（二）藥品貯存和配制儀器設(shè)備1.冰箱412.天平陳列于制備室中作用：稱(chēng)取大量元素、微量元素、酶制劑2.天平陳列于制備室中423.酸度計(jì)陳列于制備室中作用：測(cè)定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值PHS-802中文臺(tái)式酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)3.酸度計(jì)陳列于制備室中PHS-802中文臺(tái)式酸度計(jì)通用型或43（三）觀察分析儀器設(shè)備顯微鏡類(lèi)型：倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細(xì)胞活力觀察電子顯微鏡病毒檢測(cè)、細(xì)胞器變化體視顯微鏡形態(tài)分化的實(shí)體觀察（三）觀察分析儀器設(shè)備顯微鏡44植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件45（四）培養(yǎng)設(shè)備1.空調(diào)作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機(jī)控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況（四）培養(yǎng)設(shè)備1.空調(diào)463.定時(shí)器控制光照時(shí)間4.培養(yǎng)架盛放培養(yǎng)物3.定時(shí)器控制光照時(shí)間475.搖床和旋轉(zhuǎn)床進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)用以改善氣體狀況5.搖床和旋轉(zhuǎn)床48小型臭氧發(fā)生器小型臭氧發(fā)生器49不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）50三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器類(lèi)型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿51（二）器械類(lèi)1.鑷子類(lèi)型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子（莖尖）2.剪刀類(lèi)型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀類(lèi)型：固定式和活動(dòng)式4.接種針用來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織5.細(xì)菌過(guò)濾器用來(lái)去除細(xì)菌（高溫的影響）（二）器械類(lèi)1.鑷子52植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件53植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件54

1.洗滌液的配制

二、實(shí)驗(yàn)基本操作（一）洗滌技術(shù)

1.洗滌液的配制

二、實(shí)驗(yàn)基本操作（一）洗滌技術(shù)55

A、新購(gòu)買(mǎi)的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過(guò)夜（不可少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。

2.洗滌方法

A、新購(gòu)買(mǎi)的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用56

先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來(lái)水徹底洗凈去污劑，用無(wú)離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量?jī)x器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍?huà)煊兴椋瑒t需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

B、使用過(guò)的玻璃儀器的清洗

先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉57

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來(lái)越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無(wú)離子水、1mol/LKOH和無(wú)離子水清洗，然后用10—3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無(wú)離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來(lái)水和無(wú)離子水洗凈即可。

C、塑料器皿的清洗

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已58

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

E、除菌過(guò)濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。

D、金屬用品洗滌

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈59植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件干熱滅菌玻璃器皿、器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過(guò)濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室。培養(yǎng)間各種滅菌方法及其使用范圍干熱滅菌玻璃器皿、器械各種滅菌方62

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160℃、90～120min1）干熱滅菌

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、4063

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20～30min

注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0時(shí)，才能開(kāi)蓋2）濕熱滅菌

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃64

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌。另外酶、血清等也需要過(guò)濾滅菌

滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22～0.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。

3）過(guò)濾滅菌

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些65主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間20～30min。

注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開(kāi)風(fēng)機(jī)。4）射線(xiàn)滅菌主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間66

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒滅菌

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒67

適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較

消毒劑使用濃度(%)消毒時(shí)間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過(guò)氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易6）消毒劑

適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的68

長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計(jì)算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱(chēng)好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門(mén)。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。7）熏蒸滅菌

長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏69

甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2小時(shí)進(jìn)行。

對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸

甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持470人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗→化學(xué)藥劑處理內(nèi)部細(xì)菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)用化學(xué)試劑薰蒸污染來(lái)源（三）無(wú)菌操作技術(shù)

人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因71

1.實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3.關(guān)紫外燈、打開(kāi)風(fēng)機(jī)，過(guò)5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無(wú)菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒(méi)有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）

1.實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作724.用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。4.用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用735.取流水沖洗（至少30min）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無(wú)菌水沖洗3～4次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。5.取流水沖洗（至少30min）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸746.打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7.用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。6.打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培75注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。（3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過(guò)早開(kāi)瓶；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣76（5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。

（6）工作中不能面向操作區(qū)講話(huà)或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。

（7）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。（5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管77植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

83植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制86主要內(nèi)容一、培養(yǎng)基的成分

二、培養(yǎng)基的配制三、常用培養(yǎng)基配方及其特點(diǎn)

主要內(nèi)容87一、培養(yǎng)基的成分

水無(wú)機(jī)鹽炭源和能源

維生素類(lèi)

氨基酸及有機(jī)附加物

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

瓊脂

活性炭

一、培養(yǎng)基的成分水88（一）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)

無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)包括水和各種無(wú)機(jī)鹽，它們提供了除碳源以外的幾乎所有的營(yíng)養(yǎng)元素。1.水是植物原生質(zhì)的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒，為生命活動(dòng)不可缺少。配制培養(yǎng)基時(shí)一般用離子交換水、蒸餾水、重蒸餾水。（一）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)包括水和各種無(wú)機(jī)鹽，它們1892.無(wú)機(jī)鹽

無(wú)機(jī)鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、氯、鎂。氮通常是指硝態(tài)氮或氨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝態(tài)氮形式來(lái)滿(mǎn)足培養(yǎng)物對(duì)氮素的需求，或?qū)煞N混合使用，有時(shí)也以硝態(tài)氮為主，補(bǔ)加（NH4）2SO4以滿(mǎn)足酸性植物的需要。磷是植物的必須元素之一，參與植物生命活動(dòng)中核酸、蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用、及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要生理生化過(guò)程，因此在組織培養(yǎng)物中需大量的磷。鉀是主要的陽(yáng)離子，近年來(lái)在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢(shì)。鈣、鈉、鎂的用量較少。微量元素是指鐵、硼、錳、鋅、鈷、鉬、銅等，其需要量很少，一般多為10-5~10-7mol.L-1，稍多則產(chǎn)生毒害。

2.無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫901.碳源(能源)

植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作用的能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長(zhǎng)發(fā)育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖為最常用，效果也最好。然而在體細(xì)胞組織培養(yǎng)中，葡萄糖、麥芽糖和山梨醇也有影響；在花藥培養(yǎng)中，麥芽糖也有促進(jìn)作用。糖類(lèi)在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源以外，還具有維持培養(yǎng)基一定的滲透壓的作用。大多數(shù)植物細(xì)胞對(duì)蔗糖的需求范圍是1%~5%，但個(gè)別植物組織培養(yǎng)中蔗糖的濃度也可高達(dá)7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花藥培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3：1~3：2，即約有1/4~2/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓。

（二）有機(jī)成分1.碳源(能源)植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作912.維生素類(lèi)

維生素類(lèi)與植物體內(nèi)各種酶的形成有關(guān)。維生素的種類(lèi)很多，在植物組織培養(yǎng)中通常以B族維生素為主，使用濃度一般為0.1~1.0mg/L，其中以鹽酸硫胺素（B1）、鹽酸吡哆素（B6）、維生素B12、煙酸、生物素和維生素C最為常用。在各種維生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只對(duì)外植體的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。肌醇本身不促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)，但可能有助于活性物質(zhì)發(fā)揮作用，從而促進(jìn)外植體生長(zhǎng)、胚狀體及芽的形成。培養(yǎng)基中肌醇的用量為50~100mg/L。2.維生素類(lèi)維生素類(lèi)與植物體內(nèi)各種酶的形成有關(guān)。維生素的種923.氨基酸及有機(jī)添加物

在一些培養(yǎng)基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）等，它們是培養(yǎng)基中重要的有機(jī)氮源。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用，常用量為500mg/L。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用，常用量為500mg/L。

在某些植物組織培養(yǎng)中還加入一些天然的有機(jī)物，例如椰子乳10~20%，酵母提取物0.5%，番茄汁5~10%，香蕉泥100~200mg/L，其作用是提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。如培養(yǎng)基中加入100~200mg/L的香蕉泥，具有較大的pH緩沖作用，主要用于蘭花的組織培養(yǎng)，對(duì)幼苗的發(fā)育有較大的促進(jìn)作用。

3.氨基酸及有機(jī)添加物在一些培養(yǎng)基中可加入一些氨基酸，如甘93（三）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，其用量雖極少，但它們對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用，其中以生長(zhǎng)素類(lèi)和細(xì)胞分裂素最為常用。（三）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵941.生長(zhǎng)素

它們的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生。生長(zhǎng)素常用的是2.4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸），它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)?.4-D>NAA>IBA>IAA。2,4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，NAA、IBA、IAA常用于生根。使用濃度范圍一般為0.1mg/l~10.0mg/l。1.生長(zhǎng)素它們的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生952.細(xì)胞分裂素

它們的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)芽的生長(zhǎng)及顯著改變其它的激素的作用。常用的細(xì)胞分裂素類(lèi)有：激動(dòng)素（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-異戊烯腺嘌呤（2-iP）、吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ）。它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)門(mén)DZ>4PU>ZT>2-Ip>6-BA>KT。但在組織培養(yǎng)中通常使用人工合成的、性能穩(wěn)定的而價(jià)格適中的KT和6-BA，二者的最適濃度為1-10mg/L。它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)門(mén)DZ，4PU>ZT>2-Ip>6-BA>KT。常用濃度為1-10mg/L。2.細(xì)胞分裂素它們的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、96(四)瓊脂瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時(shí)不參與代謝，所以在組織培養(yǎng)中一直被作為首選的培養(yǎng)基質(zhì)而廣泛應(yīng)用。(四)瓊脂瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主97(五)活性炭活性炭加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響。例如可以防止酚類(lèi)物質(zhì)的污染而引起組織褐化死亡。在蘭花組織培養(yǎng)中的效果更明顯。另外，活性炭使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根?；钚蕴繉?duì)形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好的效應(yīng)。常用濃度為0.1~0.5%。(五)活性炭活性炭加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，98二、培養(yǎng)基的配制準(zhǔn)備工作

母液的配制和保存

培養(yǎng)基配制程序培養(yǎng)基配制程序

二、培養(yǎng)基的配制991.水和藥品

用于配制培養(yǎng)基的水最好是用玻璃容器蒸餾過(guò)的蒸餾水或去離子水；化學(xué)藥品應(yīng)盡可能采用分析純或化學(xué)純級(jí)別的試劑；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在應(yīng)用前有時(shí)還需要進(jìn)行重結(jié)晶或選用純度更高的；蛋白質(zhì)水解物最好是用酶水解的；藥品的稱(chēng)量及定容都要準(zhǔn)確。1.水和藥品用于配制培養(yǎng)基的水最好是用玻璃容器蒸餾過(guò)的1002.母液的配制和保存配制培養(yǎng)基最方便的方法是預(yù)先配制好不同組分的培養(yǎng)基母液，配成培養(yǎng)基配方使用濃度的10倍100倍，甚至1000倍；在配制母液時(shí)為減少工作量可以把幾種藥品（如培養(yǎng)基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但應(yīng)注意各種化合物的組合以及加入的先后順序，以免發(fā)生沉淀；鐵鹽宜單獨(dú)配制；對(duì)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，配制成母液時(shí)，通常用mg/ml較為方便，一般宜配制成0.5mg/ml的母液，這樣的濃度既便于計(jì)算也可避免冷藏時(shí)形成的結(jié)晶。2.母液的配制和保存配制培養(yǎng)基最方便的方法是預(yù)先配制好不同101由于多數(shù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配法各不相同：IAA，IBA和GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，搖勻后貯于試劑瓶中，貼上標(biāo)簽后存放在冰箱中；NAA可溶于熱水或少量95%酒精中，再加水定容至一定體積；2，4-D不溶于水，可用少量1N的NaOH溶解后，再加水定容；KT和6-BA應(yīng)先溶于少量1N的HCl中，再加水定容；玉米素先溶于少量95%的酒精中再加水定容至一定濃度。椰子汁的活性成分是耐熱的，椰子汁從椰子中倒出后應(yīng)立即煮沸過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，高壓消毒后貯于-20℃低溫冰箱中備用。由于多數(shù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配法各不相同：1023.培養(yǎng)基配制程序3.培養(yǎng)基配制程序103三、常用培養(yǎng)基及其特點(diǎn)MS培養(yǎng)基是1962年Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草材料而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽的濃度高，有加速愈傷組織生長(zhǎng)的作用，能滿(mǎn)足植物組織對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的要求。銨鹽和硝酸鹽含量高，比例也較為合適，也不需要添加更多的有機(jī)附加物，這是目前應(yīng)用的最廣泛的一種培養(yǎng)基。與MS較為接近的還有LS、RM、等培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基是1974年由我國(guó)的朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，其KNO3和（NH4）2SO4高且不含鉬。目前在國(guó)內(nèi)已廣泛用于小麥、水稻及其它植物的花粉和花藥的培養(yǎng)和其它的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基它的主要特點(diǎn)是含有較低的銨鹽，該營(yíng)養(yǎng)成分可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)有些植物如雙子葉植物特別是木本植物更加適合。三、常用培養(yǎng)基及其特點(diǎn)MS培養(yǎng)基是1962年Murashig104第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)105外植體的選擇1外植體的滅菌2外植體的接種培養(yǎng)3外植體的成苗途徑4污染的原因及其預(yù)防措施5外植體的褐變及其防止措施6培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施7外植體的選擇1外植體的滅菌2外植體的接種培養(yǎng)3外植體的成106一、外植體的選擇1.選擇優(yōu)良品種2.選擇健壯植株3.選擇最適時(shí)期4.選擇適宜的大小0.5～1.0cm一、外植體的選擇1.選擇優(yōu)良品種107二、外植體的滅菌1.外植體滅菌的流程把采來(lái)的材料事先截剪，除去不用的部分將需要的部分仔細(xì)弄干凈，用流水沖洗肥皂水浸洗自來(lái)水沖洗70%~75%的酒精浸泡30s滅菌劑滅菌無(wú)菌水沖洗遍3~5遍接種。二、外植體的滅菌1.外植體滅菌的流程1082.滅菌劑的種類(lèi)（1）70%~75%酒精比其他濃度的酒精殺菌效果強(qiáng)，組織穿透力也強(qiáng)。它對(duì)材料氣泡內(nèi)空氣進(jìn)行殺菌，可以濕潤(rùn)材料，有利于其他消毒劑的滲入，具濕潤(rùn)和殺菌的雙重作用。酒精滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，浸漬30s可達(dá)表面滅菌。因不能徹底殺菌，往往需用其他滅菌劑滅菌。2.滅菌劑的種類(lèi)109（2）氯化汞這是一種重金屬化合物，有劇毒。對(duì)人、動(dòng)物和植物的毒性非常大。常用濃度為1%，處理時(shí)間5~10min，殺菌效果好，但殘毒很大。外植體滅菌后，需用無(wú)菌水沖洗至少3~5次。（3）次氯酸鈉濃度可為2%~10%，消毒時(shí)間15~30min，殺菌效果比較好，很容易去除，對(duì)植物無(wú)害。（2）氯化汞110（4）漂白粉這是一種常用的低毒的消毒劑，是含有多種成分的復(fù)合化合物，一般含10%~20%的次氯酸鈣。使用濃度一般為5%~10%，或飽和溶液，取其上清液，處理10~30min，殺菌效果好，且不傷組織，容易洗凈。（4）漂白粉111（5）次氯酸鈣粉狀，可以很好溶解于水，待澄清后取上清液用以消毒，常用濃度為9%~10%，消毒時(shí)間為5~30min。次氯酸鈣進(jìn)入植物組織內(nèi)的速度低于次氯酸鈉。由于它易潮解，只能存儲(chǔ)有限時(shí)間。（5）次氯酸鈣112三、外植體的接種和培養(yǎng)（一）外植體的接種——無(wú)菌操作外植體的接種是把經(jīng)過(guò)表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。

三、外植體的接種和培養(yǎng)（一）外植體的接種——無(wú)菌操作外植體的1131．無(wú)菌操作（1）接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開(kāi)其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌；

（2）在接種前20min，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服，并換穿托鞋等；（4）上工作臺(tái)后，用（70%）酒精棉球擦拭工作臺(tái)面；然后擦拭雙手，特別是指甲處。1．無(wú)菌操作114（5）先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過(guò)火一遍，然后反復(fù)過(guò)火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干；（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話(huà)、走動(dòng)和咳嗽等；（7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。（5）先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過(guò)火一1151234561234561162.接種(1)將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無(wú)菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過(guò)菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。(2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｔ诮臃N過(guò)程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。2.接種117(3)用灼燒消毒過(guò)的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。(3)用灼燒消毒過(guò)的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基118（二）外植體的培養(yǎng)（二）外植體的培養(yǎng)1191.光照通常對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更適合，但器官的分化需要光照。每日光照12~16h，光照度1000~5000lx如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長(zhǎng)，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周?chē)?，或置于暗室中培養(yǎng)。1.光照1202.溫度大多數(shù)植物在23~32℃之間。培養(yǎng)室一般所用的溫度是25±2℃。低于15℃或高于35℃，對(duì)生長(zhǎng)都不利。3.濕度培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度；培養(yǎng)室的濕度要求室內(nèi)保持70%~80%的相對(duì)濕度。4.氧氣液體培養(yǎng)：振蕩培養(yǎng)固體培養(yǎng)：采用通氣性好的瓶蓋或瓶塞。2.溫度121四、外植體的成苗途徑外植體愈傷組織根、芽芽根根芽根、芽胚狀體試管苗從器官上發(fā)生從愈傷組織發(fā)生從游離單細(xì)胞發(fā)生從小孢子發(fā)生數(shù)量多速度快結(jié)構(gòu)完整四、外植體的成苗途徑外植體愈傷組織根、芽芽根根芽根、芽胚狀體122五、污染的原因及其預(yù)防措施（一）污染的原因污染：指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。污染的原因：病原菌污染：細(xì)菌、真菌；污染的途徑外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌；操作人員未遵守操作規(guī)程等。五、污染的原因及其預(yù)防措施（一）污染的原因123植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件124（二）污染的預(yù)防措施1．防止材料帶菌的措施取材以春夏生長(zhǎng)旺季，當(dāng)年生的嫩梢為佳；應(yīng)盡量選擇晴天中午進(jìn)行；取離體枝梢在潔凈空氣條件下抽芽，然后從新生組織中取材接種。（二）污染的預(yù)防措施1252.外植體的滅菌根據(jù)不同材料選擇合適的消毒劑和消毒方法。對(duì)于材料內(nèi)部帶菌的組織，有時(shí)還需在培養(yǎng)基中加入適量抗生素。多次滅菌法；多種藥液交替浸泡法。3.器皿與金屬器械的滅菌4.布質(zhì)制品及無(wú)菌操作室的滅菌5.操作人員嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的程序進(jìn)行接種2.外植體的滅菌126六、外植體的褐變及其防止措施褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中，體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類(lèi)物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會(huì)抑制其他酶的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現(xiàn)象。六、外植體的褐變及其防止措施褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中，體內(nèi)127植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件128（一）褐變的原因①植物品種多酚氧化酶活性上的差異。②生理狀態(tài)老熟的組織褐變程度較幼嫩的組織嚴(yán)重。③培養(yǎng)基成分無(wú)機(jī)鹽和細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高。④培養(yǎng)條件不當(dāng)如果光照過(guò)強(qiáng)、溫度過(guò)高、培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。（一）褐變的原因129（二）褐變的防止措施1.選擇合適的外植體一般來(lái)說(shuō)，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。2.合適的培養(yǎng)條件無(wú)機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。（二）褐變的防止措施130

3.使用抗氧化劑半胱氨酸、抗壞血酸；4.連續(xù)轉(zhuǎn)移對(duì)容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，連續(xù)處理7~l0d。5.加活性炭0.1%~0.5%的活性炭對(duì)吸附酚類(lèi)氧化物的效果很明顯。3.使用抗氧化劑131七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施（一）玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈水晶透明或半透明狀，這種現(xiàn)象通常稱(chēng)為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化的起因是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的環(huán)境變化。試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施（一）玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原132

1.激素濃度激素濃度增加尤其是細(xì)胞分裂素濃度提高（或細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例提高），易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。培養(yǎng)基中一次性加入了過(guò)多的細(xì)胞分裂素；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例失調(diào)；在多次繼代培養(yǎng)時(shí)愈傷組織和試管苗體內(nèi)積累過(guò)量的細(xì)胞分裂素。1.激素濃度133

2.瓊脂濃度培養(yǎng)基中瓊脂濃度低時(shí)玻璃化苗比例增加。隨著瓊脂濃度的增加，玻璃化苗比例減少。

3.溫度適宜的溫度可以使試管苗生長(zhǎng)良好，當(dāng)溫度低時(shí)，容易形成玻璃化苗，溫度越低，玻璃化苗比例越高。溫度高時(shí)玻璃化苗減少，且發(fā)生的時(shí)間較晚。2.瓊脂濃度134

4.光照時(shí)間不同的植物對(duì)光照的要求不同，滿(mǎn)足植物的光照時(shí)間，試管苗才能生長(zhǎng)正常。大多數(shù)植物在每天10~12h光照下都能生長(zhǎng)良好，光照時(shí)數(shù)大于每天15h時(shí)，玻璃化苗的比例明顯增加。

5.通風(fēng)條件試管苗生長(zhǎng)期間，要求有足夠的氣體交換，氣體交換的好壞取決于生長(zhǎng)量、瓶?jī)?nèi)空間、培養(yǎng)時(shí)間和瓶蓋種類(lèi)（棉塞、錫箔紙、濾紙、封口紙、牛皮紙、塑料膜）。4.光照時(shí)間135

6.離子水平植物生長(zhǎng)需要一定的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，但是，如果無(wú)機(jī)離子之間失去平衡，試管苗生長(zhǎng)就會(huì)受到影響。植物種類(lèi)不同，對(duì)礦物質(zhì)的量、離子形態(tài)、離子間的比例要求不同。如果培養(yǎng)基中離子種類(lèi)及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會(huì)增加。6.離子水平136（二）預(yù)防措施1.適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分；2.適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度；3.適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度；4.增加自然光照，控制光照時(shí)間；5.控制好溫度；6.改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀況；7.在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)。（二）預(yù)防措施137植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件138第四節(jié)試管苗的馴化與移栽第四節(jié)試管苗的馴化與移栽139試管苗的特點(diǎn)1試管苗的馴化2試管苗的移栽

3提高試管苗移栽成活率的途徑4試管苗的特點(diǎn)1試管苗的馴化2試管苗的移栽3提高試管苗移栽成140一、試管苗的特點(diǎn)

1.試管苗的生態(tài)環(huán)境（1）高溫且恒溫（2）高濕（3）弱光（4）無(wú)菌一、試管苗的特點(diǎn)1.試管苗的生態(tài)環(huán)境141

2.試管苗的特點(diǎn)(1)試管苗生長(zhǎng)細(xì)弱，莖、葉表面角質(zhì)層不發(fā)達(dá)；(2)試管苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠體的光合作用較差；(3)試管苗的葉面氣孔數(shù)目少，活性差；(4)試管苗根的吸收功能弱；(5)對(duì)逆境的適應(yīng)和抵抗能力差。2.試管苗的特點(diǎn)142二、試管苗的馴化1.馴化的目的提高試管苗對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)性；提高其光合作用的能力；促使試管苗健壯，最終達(dá)到提高試管苗的移栽成活率。2.馴化的原則應(yīng)從溫度、濕度、光照及有無(wú)菌態(tài)等環(huán)境要素進(jìn)行，馴化開(kāi)始數(shù)天內(nèi)，應(yīng)和培養(yǎng)時(shí)的環(huán)境條件相似；馴化后期，則要與預(yù)計(jì)的栽培條件相似，從而達(dá)到逐步適應(yīng)的目的。二、試管苗的馴化1.馴化的目的1433.馴化的方法將長(zhǎng)有完整試管苗的試管或三角瓶由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到半遮蔭的自然光下進(jìn)行鍛煉，在自然光下恢復(fù)植物體內(nèi)葉綠體的光合作用能力和健壯度，并打開(kāi)瓶蓋注入少量自來(lái)水使幼苗逐漸降低溫度，轉(zhuǎn)向有菌，這樣幼苗周?chē)沫h(huán)境就會(huì)逐步與自然環(huán)境相似。4.馴化時(shí)間：1~2周。3.馴化的方法144三、試管苗的移栽1.常規(guī)移栽法將馴化后的試管苗，取出洗去培養(yǎng)基，移到無(wú)菌混合土中（蛭石、珍珠巖、泥炭土或其混合物），當(dāng)長(zhǎng)出2~3片新葉時(shí)，栽到田間或盆缽中。2.直接移栽法直接將試管苗移栽到盆缽的方法。

三、試管苗的移栽1.常規(guī)移栽法1453.嫁接移栽法選取生長(zhǎng)良好的同一植物的實(shí)生苗作砧木，用試管苗做接穗嫁接的方法。嫁接移栽?xún)?yōu)點(diǎn)：（1）移栽成活率高。（2）適用范圍廣，嫁接移栽也適用于弱苗或污染苗。（3）需時(shí)間短，20天成活。（4）植株生長(zhǎng)發(fā)育較快。3.嫁接移栽法146四、提高試管苗移栽成活率的途徑1.試管苗的生理狀況：壯苗移栽比弱苗移栽成活率高。2.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長(zhǎng)素利于生根。3.無(wú)機(jī)鹽濃度：低無(wú)機(jī)鹽濃度生根效果好。4.活性炭：活性炭利于嫩莖生根。5.環(huán)境因子：避免太陽(yáng)直射，溫度25~30℃，濕度在85%以上。6.移栽過(guò)程中使試管苗逐漸從無(wú)菌向有菌過(guò)渡。四、提高試管苗移栽成活率的途徑1.試管苗的生理狀況：壯苗移栽147本章小結(jié)1.構(gòu)成培養(yǎng)基的主要成分。常用的培養(yǎng)基及其特點(diǎn)。2.母液的配制

3.外植體滅菌的流程

4.植物組織培養(yǎng)技術(shù)包括滅菌、接種、培養(yǎng)和馴化四個(gè)環(huán)節(jié)。

5.接種程序包括①植物材料表面的消毒；②切割外植體；③將外植體移入培養(yǎng)基。6.外植體的成苗途徑7.菌類(lèi)污染、褐變、玻璃化的預(yù)防措施。8.試管苗馴化的目的及方法；試管苗移栽的方法。9.提高試管苗移栽成活率的途徑。本章小結(jié)1.構(gòu)成培養(yǎng)基的主要成分。常用的培養(yǎng)基及其特點(diǎn)。148END!END!植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備

第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備主要內(nèi)容

植物組織培養(yǎng)的設(shè)計(jì)原則組培室的組成及其功能無(wú)菌操作設(shè)備常用工具常用儀器設(shè)備主要內(nèi)容植物組織培養(yǎng)的設(shè)計(jì)原則組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無(wú)菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于工作的目的和規(guī)模按組織培養(yǎng)流程來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，達(dá)到嚴(yán)格無(wú)菌的條件實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無(wú)菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿(mǎn)足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫室生化分析實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室1.構(gòu)成與配置輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室1.構(gòu)成基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無(wú)菌臺(tái)無(wú)菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門(mén)4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌室培養(yǎng)室基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及157植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件158植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件159AGlimpseofPlantTissueCultureAGlimpseof160（1）準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存培養(yǎng)基的配制和滅菌生理生化測(cè)定等（1）準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室162

1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專(zhuān)用的洗滌水槽，用來(lái)清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購(gòu)置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-2個(gè)洗液缸，專(zhuān)門(mén)用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積163植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件164面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。2）培養(yǎng)基配制間面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰165植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件166

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過(guò)濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒(méi)有條件的話(huà)，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。

3）

消毒間

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過(guò)167（2）緩沖室（注意門(mén)的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩功能減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。要求緩沖間需3-5平方米，應(yīng)保持清潔無(wú)菌；有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過(guò)的工作服；

1-2盞紫外燈定時(shí)照射，對(duì)衣物及空間進(jìn)行滅菌。（2）緩沖室（注意門(mén)的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴168植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件169植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件170

無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門(mén)應(yīng)該與接種室的門(mén)錯(cuò)開(kāi)，兩個(gè)門(mén)也不要同時(shí)開(kāi)啟，以保證無(wú)菌室不因開(kāi)門(mén)和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無(wú)菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過(guò)毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。（3）

無(wú)菌操作室

無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通171無(wú)菌室（一）無(wú)菌室（一）172無(wú)菌室（二）無(wú)菌室（二）173植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件174植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件175

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶(hù)，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。

培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。

（4）培養(yǎng)室

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)176植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件177植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件178培養(yǎng)室培養(yǎng)室179

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行練苗，待生根成活后，再移到大田。植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行1802．輔助實(shí)驗(yàn)室（1）鑒定室

細(xì)胞學(xué)鑒定室

其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。

生化分析室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、PCR儀等。2．輔助實(shí)驗(yàn)室（1）鑒定室181植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件182

為試管苗提供滿(mǎn)足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。（2）溫室

為試管苗提供滿(mǎn)足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。（2）溫室183二、儀器和設(shè)備（一）無(wú)菌操作設(shè)備１.烘箱：作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌

測(cè)定培養(yǎng)物的干重時(shí)烘干培養(yǎng)材料。二、儀器和設(shè)備（一）無(wú)菌操作設(shè)備184植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件1852.滅菌鍋類(lèi)型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋?zhàn)饔茫号囵B(yǎng)基、水和各種用具的消毒2.滅菌鍋類(lèi)型：普通醫(yī)用消毒鍋186醫(yī)用手提式滅菌鍋

醫(yī)用手提式滅菌鍋187不銹鋼立式滅菌鍋不銹鋼立式滅菌鍋1883.超凈工作臺(tái)陳列于操作室（接種室）內(nèi)類(lèi)型：垂直式和水平式作用：無(wú)菌操作3.超凈工作臺(tái)陳列于操作室（接種室）內(nèi)189（二）藥品貯存和配制儀器設(shè)備1.冰箱作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。（二）藥品貯存和配制儀器設(shè)備1.冰箱1902.天平陳列于制備室中作用：稱(chēng)取大量元素、微量元素、酶制劑2.天平陳列于制備室中1913.酸度計(jì)陳列于制備室中作用：測(cè)定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值PHS-802中文臺(tái)式酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)3.酸度計(jì)陳列于制備室中PHS-802中文臺(tái)式酸度計(jì)通用型或192（三）觀察分析儀器設(shè)備顯微鏡類(lèi)型：倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細(xì)胞活力觀察電子顯微鏡病毒檢測(cè)、細(xì)胞器變化體視顯微鏡形態(tài)分化的實(shí)體觀察（三）觀察分析儀器設(shè)備顯微鏡193植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件194（四）培養(yǎng)設(shè)備1.空調(diào)作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機(jī)控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況（四）培養(yǎng)設(shè)備1.空調(diào)1953.定時(shí)器控制光照時(shí)間4.培養(yǎng)架盛放培養(yǎng)物3.定時(shí)器控制光照時(shí)間1965.搖床和旋轉(zhuǎn)床進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)用以改善氣體狀況5.搖床和旋轉(zhuǎn)床197小型臭氧發(fā)生器小型臭氧發(fā)生器198不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）199三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器類(lèi)型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿200（二）器械類(lèi)1.鑷子類(lèi)型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子（莖尖）2.剪刀類(lèi)型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀類(lèi)型：固定式和活動(dòng)式4.接種針用來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織5.細(xì)菌過(guò)濾器用來(lái)去除細(xì)菌（高溫的影響）（二）器械類(lèi)1.鑷子201植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件202植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件203

1.洗滌液的配制

二、實(shí)驗(yàn)基本操作（一）洗滌技術(shù)

1.洗滌液的配制

二、實(shí)驗(yàn)基本操作（一）洗滌技術(shù)204

A、新購(gòu)買(mǎi)的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過(guò)夜（不可少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。

2.洗滌方法

A、新購(gòu)買(mǎi)的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用205

先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來(lái)水徹底洗凈去污劑，用無(wú)離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量?jī)x器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍?huà)煊兴?，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

B、使用過(guò)的玻璃儀器的清洗

先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉206

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來(lái)越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無(wú)離子水、1mol/LKOH和無(wú)離子水清洗，然后用10—3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無(wú)離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來(lái)水和無(wú)離子水洗凈即可。

C、塑料器皿的清洗

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已207

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

E、除菌過(guò)濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。

D、金屬用品洗滌

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈208植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件干熱滅菌玻璃器皿、器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過(guò)濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室。培養(yǎng)間各種滅菌方法及其使用范圍干熱滅菌玻璃器皿、器械各種滅菌方211

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160℃、90～120min1）干熱滅菌

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40212

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20～30min

注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0時(shí)，才能開(kāi)蓋2）濕熱滅菌

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃213

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌。另外酶、血清等也需要過(guò)濾滅菌

滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22～0.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。

3）過(guò)濾滅菌

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些214主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間20～30min。

注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開(kāi)風(fēng)機(jī)。4）射線(xiàn)滅菌主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間215

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒滅菌

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒216

適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較

消毒劑使用濃度(%)消毒時(shí)間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過(guò)氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易6）消毒劑

適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的217

長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計(jì)算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱(chēng)好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門(mén)。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。7）熏蒸滅菌

長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏218

甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2小時(shí)進(jìn)行。

對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸

甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4219人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗→化學(xué)藥劑處理內(nèi)部細(xì)菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)用化學(xué)試劑薰蒸污染來(lái)源（三）無(wú)菌操作技術(shù)

人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因220

1.實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3.關(guān)紫外燈、打開(kāi)風(fēng)機(jī)，過(guò)5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無(wú)菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒(méi)有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）

1.實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作2214.用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。4.用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用2225.取流水沖洗（至少30min）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無(wú)菌水沖洗3～4次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。5.取流水沖洗（至少30min）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸2236.打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7.用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。6.打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培224注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。（3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過(guò)早開(kāi)瓶；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣225（5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。

（6）工作中不能面向操作區(qū)講話(huà)或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。

（7）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。（5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管226植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

232植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)課件第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制235主要內(nèi)容一、培養(yǎng)基的成分

二、培養(yǎng)基的配制三、常用培養(yǎng)基配方及其特點(diǎn)

主要內(nèi)容236一、培養(yǎng)基的成分

水無(wú)機(jī)鹽炭源和能源

維生素類(lèi)

氨基酸及有機(jī)附加物

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

瓊脂

活性炭

一、培養(yǎng)基的成分水237（一）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)

無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)包括水和各種無(wú)機(jī)鹽，它們提供了除碳源以外的幾乎所有的營(yíng)養(yǎng)元素。1.水是植物原生質(zhì)的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒，為生命活動(dòng)不可缺少。配制培養(yǎng)基時(shí)一般用離子交換水、蒸餾水、重蒸餾水。（一）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)包括水和各種無(wú)機(jī)鹽，它們12382.無(wú)機(jī)鹽

無(wú)機(jī)鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、氯、鎂。氮通常是指硝態(tài)氮或氨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝態(tài)氮形式來(lái)滿(mǎn)足培養(yǎng)物對(duì)氮素的需求，或?qū)煞N混合使用，有時(shí)也以硝態(tài)氮為主，補(bǔ)加（NH4）2SO4以滿(mǎn)足酸性植物的需要。磷是植物的必須元素之一，參與植物生命活動(dòng)中核酸、蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用、及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要生理生化過(guò)程，因此在組織培養(yǎng)物中需大量的磷。鉀是主要的陽(yáng)離子，近年來(lái)在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢(shì)。鈣、鈉、鎂的用量較少。微量元素是指鐵、硼、錳、鋅、鈷、鉬、銅等，其需要量很少，一般多為10-5~10-7mol.L-1，稍多則產(chǎn)生毒害。

2.無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫2391.碳源(能源)

植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作用的能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長(zhǎng)發(fā)育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖為最常用，效果也最好。然而在體細(xì)胞組織培養(yǎng)中，葡萄糖、麥芽糖和山梨醇也有影響；在花藥培養(yǎng)中，麥芽糖也有促進(jìn)作用。糖類(lèi)在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源以外，還具有維持培養(yǎng)基一定的滲透壓的作用。大多數(shù)植物細(xì)胞對(duì)蔗糖的需求范圍是1%~5%，但個(gè)別植物組織培養(yǎng)中蔗糖的濃度也可高達(dá)7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花藥培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3：1~3：2，即約有1/4~2/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓。

（二）有機(jī)成分1.碳源(能源)植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作240