卡爾費(fèi)休法測(cè)定水分的方法開發(fā)與研究、檢測(cè)流程優(yōu)化研究

15/15卡爾費(fèi)休法測(cè)定水分的方法開發(fā)與研究、檢測(cè)流程優(yōu)化研究水分是重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，水分含量過高過低都影響著藥品食品的品質(zhì)與質(zhì)量，無論在質(zhì)量與經(jīng)濟(jì)效益上都起到至關(guān)重要的的作用。同樣，水分含量高低對(duì)微生物的生長及生化反應(yīng)有著密切的聯(lián)系，所以水分測(cè)定結(jié)果至關(guān)重要。產(chǎn)品含量結(jié)果計(jì)算需要水分?jǐn)?shù)據(jù)支持，樣品水分需要給產(chǎn)品保存運(yùn)輸提供數(shù)據(jù)支持，一個(gè)準(zhǔn)確合格的水分值，離不開分析研究人員的基本功檢測(cè)能力和檢測(cè)儀器設(shè)備支持以及對(duì)檢測(cè)儀器的熟練使用。

中國藥典四部收載的水分測(cè)定方法有5種，分別為：卡爾費(fèi)休法、烘干法、減壓干燥法、甲苯法、氣相色譜法；中國藥典一部（中藥）水分測(cè)定方法主要是烘干法（約占99.2%）、甲苯法（約占0.8%）；藥典二部（化學(xué)藥）水分測(cè)定方法基本都是卡爾費(fèi)休法。從檢測(cè)成本與耗時(shí)經(jīng)濟(jì)性考慮，其中卡爾費(fèi)休法是5種方法中經(jīng)濟(jì)和效率性價(jià)最高；同樣在有明確的檢測(cè)分析條件與參數(shù)，而卡爾費(fèi)休法（容量法、庫倫法）需要研究的項(xiàng)目都較后4種方法要多。

本篇文章主要講解卡爾費(fèi)休法，主要涉及原理概述、方法開發(fā)與研究、檢測(cè)流程優(yōu)化研究與操作規(guī)程、故障與問題分析解決。

一、先把原理搞懂！

1、卡爾·費(fèi)休水分測(cè)定法是以甲醇為介質(zhì)，以卡氏液為滴定液進(jìn)行樣品水分測(cè)量的一種方法。此方法操作簡單、準(zhǔn)確度高，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、石油、化工、農(nóng)藥、染料、糧食等領(lǐng)域。尤其適用于遇熱易被破壞的樣品，不僅測(cè)出自由水,也可測(cè)出結(jié)合水。終點(diǎn)判定方法有目測(cè)法和電位法兩種?？栙M(fèi)休試劑是一種測(cè)定某些物質(zhì)中微量水份用的試劑，其主要成分有：I2，SO2，C5H5N，CH3OH。卡爾費(fèi)休法是非水滴定法，所有容器都需干燥；假如卡爾費(fèi)休試劑在配制和保存過程中若入水，試劑就會(huì)失效（超過6g/L含水量）。

2、水分滴定原理：卡爾費(fèi)休法屬碘量法，其基本原理是利用碘氧化二氧化硫時(shí)，需要一定量的水參加反應(yīng)：I2+SO2+2H2O→2HI+H2SO4。卡爾費(fèi)休試劑因含有I2而顯棕色，當(dāng)I2，

SO2，H2O反應(yīng)后，I2棕色褪去。此法以棕色出現(xiàn)為滴定終點(diǎn)。

上述反應(yīng)是可逆的。當(dāng)硫酸濃度達(dá)到0.05%以上時(shí)，即能發(fā)生逆反應(yīng)。如果我們要想實(shí)際讓方程按照一個(gè)正方向進(jìn)行，需要往反應(yīng)體系中加入適當(dāng)?shù)膲A性物質(zhì)以中和反應(yīng)過程中生成的酸（氫碘酸、硫酸）。在反應(yīng)體系中加入吡啶，這樣就可使反應(yīng)正方向（向右）進(jìn)行。大量實(shí)驗(yàn)證明，吡啶是最適宜的試劑，同時(shí)吡啶還具有可與碘和二氧化硫結(jié)合以降低二者蒸氣壓的作用。

3C5H5N+H2O+I2+SO2→2HI·吡啶+硫酸酐·吡啶

生成硫酸酐吡啶不穩(wěn)定，能與水發(fā)生反應(yīng)，消耗一部分水而干擾測(cè)定，為了體系穩(wěn)定正常向正方向反應(yīng)，體系中可加入無水甲醇，反應(yīng)如：硫酸酐·吡啶+CH3OH（無水）→甲基硫酸·吡啶

3、解決辦法：加入甲醇可避免副反應(yīng)發(fā)生，因此，試劑必須加進(jìn)甲醇或另一種含活潑OH基的溶劑，使硫酸酐吡啶轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的甲基硫酸氫吡啶。

總反應(yīng)式：I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH→2氫碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶

二、方法開發(fā)研究

卡爾費(fèi)休方法開發(fā)主要內(nèi)容：信息收集、容量與庫倫比較、開發(fā)主內(nèi)容。（1）API水分檢測(cè)方法：費(fèi)休氏-容量滴定法、費(fèi)休氏-庫倫滴定法（2）中藥材水分檢測(cè)方法：烘干法、甲苯法（3）制劑水分檢測(cè)方法

1、信息收集（1）樣品儲(chǔ)存方式和樣品分類；（2）首先要確定待測(cè)物質(zhì)的溶解性、理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性；①溶解性：這里的溶解性首先要考慮“脂溶性”，因?yàn)橘M(fèi)休氏-容量滴定法、費(fèi)休氏-庫倫滴定法、氣相色譜法3種方法都要樣品溶解處理；②理化性質(zhì)：樣品是否具有“引濕性或吸濕性”，樣品熔點(diǎn)信息，pH值等；③化學(xué)結(jié)構(gòu)：具體指水分子在樣品中存在形式，如：游離水、結(jié)晶水；另外還要確認(rèn)樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)是否含有其他特殊“醛/酮”結(jié)構(gòu)。④穩(wěn)定性具體指熱穩(wěn)定性，是否受熱分解。

（3）其次還需要確定樣品中是否含有揮發(fā)性成分（主要是中藥材）。

（4）確認(rèn)樣品實(shí)際含水量，確認(rèn)樣品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，主要用來方法開發(fā)作依據(jù)。（5）方法開發(fā)原則：樣品易灰化的采用卡爾費(fèi)休法、穩(wěn)定的采用干燥法。

2、KF容量法與KF庫倫法溶劑組成對(duì)比（方法關(guān)鍵）序號(hào)溶劑名稱特點(diǎn)說明

1

單組分（容量滴定法）

1）組成：碘、二氧化硫、吡啶（咪唑）、

無水甲醇，滴定劑。2）關(guān)鍵點(diǎn)：價(jià)格低，處理簡便，滴定度不

穩(wěn)定，滴定速度較慢；可加入助溶劑。

大部分（不含醛酮）；

含吡啶與不含吡啶組成常量水分

2

雙組分（容量滴定法）1）組成：A液-二氧化硫、吡啶的無水甲醇溶液，作為溶劑；B液-碘的無水甲醇溶液，

作為滴定劑。2）關(guān)鍵點(diǎn)：價(jià)格高，使用前按1：1在滴定杯中進(jìn)行混合，滴定度穩(wěn)定，滴定速度快。

3

醛酮專用1）組成：碘、二氧化硫、吡啶（咪唑）、

乙二醇甲醚，滴定劑。2）關(guān)鍵點(diǎn)：只適合含醛酮結(jié)構(gòu)樣品。

專用試劑

4陽極液

庫倫滴定法1）組成：碘、二氧化硫、有機(jī)堿（吡啶）。2）關(guān)鍵點(diǎn)：反應(yīng)快；不需標(biāo)定，水分準(zhǔn)確。微量水含量≤0.1%水

無水合物

（1）含吡啶滴定劑優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格低廉及生產(chǎn)工藝簡單而仍然廣泛應(yīng)用；含吡啶的卡爾費(fèi)休試劑比不含吡啶的溶液較穩(wěn)定，不容易分層，而且有些樣品含吡啶的溶解效果會(huì)比較好；含吡啶的卡爾費(fèi)休試劑有利于反應(yīng)向正方向發(fā)生；含吡啶的卡爾-費(fèi)休試劑終點(diǎn)的突變較明顯，反應(yīng)終點(diǎn)容易判斷。（2）含醛酮結(jié)構(gòu)樣品：醛(R-CHO)和酮(R-CO-R)與通常的含甲醇試劑反應(yīng)生成縮醛和縮酮，反應(yīng)中產(chǎn)生的水同時(shí)被滴定，從而導(dǎo)致水分含量升高甚至終點(diǎn)消失。

（3）正?？栙M(fèi)休反應(yīng)的最大速率在5.5到8的pH范圍之間，在實(shí)際操作過程中應(yīng)避免pH值小于4和大于8；pH大于8.5時(shí)，由于碘和氫氧根或甲基化離子之間的反應(yīng)，反應(yīng)速率會(huì)增大，但這將導(dǎo)致終點(diǎn)消失，并消耗更多的碘（滴定劑）。

3、水分測(cè)定方法的開發(fā)與研究

樣品成分/處方分析

方法開發(fā)前一定要對(duì)樣品進(jìn)行處方/成分分析：主要分析樣品中是否有與卡爾費(fèi)休試劑發(fā)生副反應(yīng)；反應(yīng)不產(chǎn)生水、反應(yīng)產(chǎn)生水。

與氫碘酸反應(yīng)產(chǎn)生水的例子：序號(hào)反應(yīng)成分例子1NaOH注射用艾司奧美拉唑鈉2NaCO3注射用琥珀氯霉素、注射用硫噴妥鈉

氫碘酸能與下述物質(zhì)反應(yīng)（無水）：堿、氯、氧氣、高錳酸鉀、強(qiáng)氧化劑。

主方法選擇（1）方法有：費(fèi)休容量法、費(fèi)休庫倫法、干燥法、甲苯法。（2）化學(xué)原料藥及制劑/化學(xué)輔料：通常首選費(fèi)休容量法，水分檢測(cè)范圍1%-100%，工作效率高檢測(cè)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確度高。（3）中藥材：通常首選干燥法（105℃干燥5小時(shí)，恒重5mg），耗時(shí)工作效率低。4.含有揮發(fā)成分：首選甲苯法（只適合中藥材）。（4）對(duì)于含微量水且對(duì)水分要求很高、且是無水合物產(chǎn)品，通常首選費(fèi)休庫倫法，水分檢測(cè)范圍0.001%-0.1%。（5）對(duì)于含有結(jié)合水/結(jié)晶水樣品，優(yōu)先選用費(fèi)休法（容量法與庫倫法）。

（6）根據(jù)樣品形態(tài)性質(zhì)選用方法：固體樣品優(yōu)選容量法，液體和氣體優(yōu)選庫倫法。

KF滴定劑選擇（1）滴定劑有單組分（含吡啶）、雙組分、醛酮專用、陽極液（2）庫倫法測(cè)定水分首選陽極液。

（3）分析樣品結(jié)構(gòu)式，如果樣品含有醛酮結(jié)構(gòu)，檢測(cè)水分首選醛酮專用滴定劑。

（4）一般常用水分檢測(cè)用，對(duì)于含水量低（0.1%≤水分≤0.5%）、且檢測(cè)準(zhǔn)確度要求高，首選單組分（含吡啶）選用幾率超過90%，其他一般可選用不含吡啶；其次選擇雙組分（詳見對(duì)比表）。

KF方法溶劑選擇（1）溶劑開發(fā)原則：①樣品中含游離水，樣品不需要完全溶解；樣品含有結(jié)合水/結(jié)構(gòu)水，樣品需要溶解。②溶劑不能影響樣品水分檢測(cè)，不能與樣品有任何反應(yīng)。③如果樣品不能溶解，可適當(dāng)添加助溶劑，如甲酰胺、DMF

（2）溶劑有無水甲醇、無水乙醇、無水甲醇-甲酰胺/DMF。（3）溶劑首選無水甲醇。（4）樣品含有醛酮結(jié)構(gòu)，檢測(cè)水分首選無水乙醇作為溶劑。（5）對(duì)于不容易溶解的樣品，可配置不同比例濃度的無水甲醇-甲酰胺首混合溶液，比例不要超過60：40（%，V/V），通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比總結(jié)（主要是反應(yīng)終點(diǎn)快慢），經(jīng)典比例為無水甲醇-甲酰胺=70：35（%，V/V）。（6）對(duì)于樣品pH偏高，會(huì)引起副反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致連續(xù)反應(yīng)，而無終點(diǎn)出現(xiàn)或很難達(dá)到終點(diǎn)，此時(shí)應(yīng)該加入少許苯甲酸或水楊酸，進(jìn)行緩和中和一些高堿性環(huán)境（不能用乙酸）。

KF方法儀器參數(shù)開發(fā)選擇（1）轉(zhuǎn)速：經(jīng)典值200R/min（2）水分標(biāo)定：起始漂移值（檢測(cè)前平衡）：20以下漂移值；終點(diǎn)漂移值（結(jié)束）：15-50漂移值。（3）樣品檢測(cè)：起始漂移值（檢測(cè)前平衡）：30-50以下漂移值；終點(diǎn)漂移值（結(jié)束）：25-60漂移值。（4）對(duì)于樣品檢測(cè)很難達(dá)到終點(diǎn)，可將終點(diǎn)漂移值適當(dāng)提高100。

樣品取樣量及樣品處理研究（1）對(duì)于含水量小于1.0%大于0.5%，樣品取樣量為0.2-0.5g；（2）對(duì)于含水量小于0.5%大于0.1%，樣品取樣量為0.5-1.0g；（3）對(duì)于含水量小于0.1%，樣品取樣量為1.0-2.0g；

（4）對(duì)于樣品經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，可根據(jù)含水量酌情規(guī)定取樣量30-50mg，且可根據(jù)實(shí)際測(cè)定情況選用庫倫法進(jìn)行驗(yàn)證或直接選用庫倫法（例子：高價(jià)值抗腫瘤藥）；

（5）對(duì)于無水合物樣品，可根據(jù)含水量酌情規(guī)定取樣量1.0g-1.5g,如果產(chǎn)品屬于高價(jià)值產(chǎn)品，可選擇低取樣量庫倫法。

（6）由于樣品化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致其pH值不同，呈酸堿性，樣品處理方法：①對(duì)于酸性樣品，樣品導(dǎo)致溶劑pH值太低或過酸，可選擇咪唑作為調(diào)節(jié)劑；②對(duì)于堿性樣品，樣品導(dǎo)致溶劑pH值太高或過堿，可選擇苯甲酸或水楊酸作為調(diào)節(jié)劑。③在方法開發(fā)時(shí)就應(yīng)該進(jìn)行對(duì)樣品+溶劑的pH值進(jìn)行研究開發(fā)，維持系統(tǒng)pH6.5。

（7）樣品取樣量：以消耗卡爾試劑2~3ml為標(biāo)準(zhǔn)（F值為3.758mg/ml）。

樣品溶解性研究與助溶劑篩選（1）首先研究在甲醇中的溶解性（費(fèi)休法溶劑90%以上都是首選無水甲醇系統(tǒng)）。

（2）其次研究在水中的溶解性，主要研究其pKa值（也就是pH值），為確定其滴定系統(tǒng)最優(yōu)pH環(huán)境（pH5.5~7.5）；在實(shí)際開發(fā)中是否需要添加緩和劑。

（3）研究樣品在乙二醇、甲酰胺、DMF、DMSO、二氯甲烷等助溶劑中的溶解性。

（4）助溶劑使用量研究：以剛好溶解為好（能在1分鐘內(nèi)溶解為標(biāo)準(zhǔn)）。

（5）樣品吸濕性研究，為樣品水分檢測(cè)流程優(yōu)化作依據(jù)：將溶劑先進(jìn)行測(cè)量水分，再用溶劑進(jìn)行溶解，將溶液進(jìn)行一次性注射器轉(zhuǎn)移儲(chǔ)存測(cè)水分（一次性可以有效避開固體樣品稱量過程中水分干擾）總水-溶劑水。

檢測(cè)分析方法驗(yàn)證

（1）專屬性：選擇1固定結(jié)合水樣品進(jìn)行水分檢測(cè)，分別選用（庫倫法、容量法）檢查體系專屬。

（2）SST：使用純化水20mg進(jìn)行測(cè)定6次，計(jì)算其RSD%。

（3）儀器精密度：選擇二水合酒石酸鈉基準(zhǔn)試劑（也可以進(jìn)行儀器檢定）。

（4）精密度：選擇開發(fā)的樣品（含有固定水分），重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算結(jié)果RSD%。

（5）準(zhǔn)確度：選擇開發(fā)的樣品，分別依次加入不同水分含量（25%、50%、100%），平行測(cè)定3次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果RSD%。

三、操作注意事項(xiàng)

1.配置要求：干燥器、電子天平（十萬分之一）、水分測(cè)定儀、除濕機(jī)、空調(diào)

。

2.電子天平、水分測(cè)定儀、干燥器要放在同一房間內(nèi)，且電子天平最好放在水分測(cè)定儀的旁邊（優(yōu)先左旁邊），干燥器也隨樣品性質(zhì)而定，主要優(yōu)化環(huán)境中水分的干擾。

3.不管樣品是否有吸濕性，統(tǒng)一轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)存在干燥器中。

4.樣品在稱量到倒入測(cè)量杯中，全程必須有稱量舟與水分保護(hù)罩一體。

5.儀器開機(jī)預(yù)熱，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用器具材：稱量舟、稱量勺、微量注射器（50ul）、一次性注射器（2.5ml）、溶劑、滴定劑，并檢查系統(tǒng)各個(gè)管路接頭以及干燥劑。

6.系統(tǒng)置換：

①滴定劑置換/更換并檢查系統(tǒng)管路是否有氣泡（氣密性）；

②滴定杯泵入新鮮溶劑（或無水甲醇），將滴定杯進(jìn)行除水分預(yù)滴定（將測(cè)量杯進(jìn)樣口先蓋上蓋子，注入2/3體積無水甲醇，接著用手輕輕晃動(dòng)測(cè)量杯，直至掛珠消失，準(zhǔn)備吸水紙，快速將進(jìn)樣口打開蓋子，迅速用吸水紙擦干蓋子與進(jìn)樣口內(nèi)壁的液滴，迅速蓋上進(jìn)樣口蓋子，并將測(cè)量杯內(nèi)的液體排盡，重新注入新鮮的無水甲醇）。

7.水分標(biāo)定：穿戴好一次性手套（必須），調(diào)出標(biāo)定模式，進(jìn)行預(yù)平衡，稱量12-15mg純化水，平衡好快速注入水分（進(jìn)行減量法），進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定過程中準(zhǔn)備下一份水分，循環(huán)平行3次。

8.樣品檢測(cè)：調(diào)出測(cè)量模式并進(jìn)行預(yù)平衡，用稱量舟稱取規(guī)定量樣品，平衡好快速倒入樣品（進(jìn)行減量法），進(jìn)行測(cè)量，記錄消耗體積（如果無吸濕性，可在快要結(jié)束前30秒開始準(zhǔn)備下一個(gè)樣品）。

9.標(biāo)定時(shí)，水分盡量全部轉(zhuǎn)移或注入滴定杯反應(yīng)液中，切記注入過力，將液體濺到滴定杯壁上，也避免微量進(jìn)樣針接觸滴定液，或進(jìn)樣針接觸其他液體或粉末。

10.樣品檢測(cè)過程，盡量不要暴露長時(shí)間外面，倒入滴定杯中盡量不要粘在壁上，也就是避免損失和測(cè)不到。

11.測(cè)定樣品水分一定要先水分標(biāo)定，且水分標(biāo)定和樣品水分測(cè)定活動(dòng)要連貫完成

12.對(duì)于易吸水樣品，2次平行測(cè)定，樣品均應(yīng)在干燥器內(nèi)拿出進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于不易吸水的樣品可在稱量后用保護(hù)罩將樣品進(jìn)樣器和樣品一起套住密封（杜絕外部環(huán)境水分入樣）。

13.液體樣品一定要用濾紙擦干外面的液體，不可存在漏撒樣。

14.整個(gè)操作過程切勿裸手操作，一定要帶上手套進(jìn)行。

15.查看溫濕度表，酌情開空調(diào)/除濕機(jī)→開機(jī)檢查/準(zhǔn)備→除水操作→標(biāo)定→檢測(cè)。

四、故障解決

反應(yīng)往正方向進(jìn)行且測(cè)定結(jié)果快（反應(yīng)終點(diǎn)快，終點(diǎn)很快終結(jié)）、準(zhǔn)（終點(diǎn)平衡快），必須保證系統(tǒng)生成的“氫碘酸”不與檢品中成分反應(yīng)。

序號(hào)故障+問題可能原因概率（%）解決辦法與措施

1

漂移值太高（滴定前）系統(tǒng)氣密性不好，有水分或