生物化學(xué)教程蛋白質(zhì)的性質(zhì)

（一）蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)（pI）１、兩性解離２、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）３、電泳１、兩性游離NH3+∕Pr

＼

COOHNH3+∕Pr

＼

COO-NH3∕Pr

＼

COO-

OH-OH-H+H+陽離子陰離子兼性離子（pH＜PI）（pH=PI）（pH＞PI）２、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）

當(dāng)溶液處于某一pH值，蛋白質(zhì)分子所帶正、負(fù)電荷相等，凈電荷為零，呈兼性離子狀態(tài)，此時(shí)溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。不同的蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)（pI）不同。pI是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)。利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）蛋白質(zhì)名稱來源pI血清蛋白人血4.64肌球蛋白肌肉7.0胃蛋白酶豬胃2.8~3.0胰蛋白酶胰液5.0卵清蛋白雞蛋4.8~4.9白明膠動(dòng)物皮4.8３、電泳

帶電顆粒向與其電荷相反的電極方向移動(dòng)。意義：用于蛋白質(zhì)的分離、純化鑒定和分子量的測定。血清蛋白電泳圖譜：+-清蛋白α1Βα2γ球蛋白電泳

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。

電泳方法：自由界面電泳區(qū)帶電泳紙電泳凝膠電泳圓盤電泳平板電泳（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀1、蛋白質(zhì)是高分子化合物，分子量多在1萬~100萬之間。2、球狀蛋白質(zhì)的顆粒大小達(dá)1~100nm范圍，故蛋白質(zhì)有膠體性質(zhì)。蛋白質(zhì)水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體。3、蛋白質(zhì)分子大，不能透過半透膜。4、蛋白質(zhì)在一定的溶劑中，經(jīng)超速離心，可發(fā)生沉降。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)顆粒大小：在1～100nm之間。屬膠體。因此溶于水，成為親水膠體。穩(wěn)定親水膠體的因素： 水化膜 表面電荷不通透性：半透膜透析的原理：

透析

將蛋白質(zhì)溶液(不純)放入透析袋中，放在流水中（純水），讓低分子雜質(zhì)（如鹽類）透過半透膜擴(kuò)散入水內(nèi)，蛋白質(zhì)則留在袋中，分離純化蛋白質(zhì)。半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。沉降作用1、沉降概念：蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時(shí)，由于比重關(guān)系，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，離心管底部的蛋白質(zhì)濃度增高。2、沉降速率：在離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子在單位時(shí)間t（以秒計(jì)）內(nèi)下沉的距離x（以cm計(jì)）。以v表示。

v=dx/dt沉降作用1、沉降概念：2、沉降速率：

v=dx/dt3、沉降常數(shù)（沉降系數(shù)，S）

單位引力場沉降分子下沉的速率。

S=v/ω2xv：沉降速率（dx/dt）可以從實(shí)驗(yàn)測得。ω：離心機(jī)轉(zhuǎn)子每秒鐘的角速度，以弧度/秒計(jì)。（即2Л×轉(zhuǎn)子每秒鐘的轉(zhuǎn)速）

x：蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心之間的距離（以cm計(jì)）。Svedberg單位的定義：單位引力場沉降分子下沉的速率。取1×10-13秒為一個(gè)Svedberg單位。例：①牛血清清蛋白的沉降常數(shù)為:4.4×10-13用Svedberg單位則為:4.4S②原核細(xì)胞核糖體的沉降常數(shù)為:70×10-13用Svedberg單位則為:70S蛋白質(zhì)的沉淀1、概念：蛋白質(zhì)分子發(fā)生凝聚，從溶液中析出的現(xiàn)象。2、蛋白質(zhì)水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體。穩(wěn)定因素：水化膜電荷破壞穩(wěn)定因素，就可使蛋白質(zhì)顆粒凝聚而沉淀。3、沉淀方法：

①鹽析法②有機(jī)溶劑沉淀③重金屬鹽沉淀?xiàng)l件:pH＞pI(Pr-M+)④某些酸類沉淀?xiàng)l件：pH＜pI(Pr+X-)⑤加熱變性沉淀①鹽析法加高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。NaCl、（NH4）2SO4、NaSO4等。破壞蛋白質(zhì)膠體周圍的水化膜，中和了蛋白質(zhì)分子的電荷，使蛋白質(zhì)沉淀而析出。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。分離制備蛋白質(zhì)的常用方法。②有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮等。破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜。pH=pI時(shí)，可加速蛋白質(zhì)沉淀。低溫（0℃∽4℃）。③重金屬鹽沉淀反應(yīng)條件:pH＞pI

NH3+PrCOO-

NH2PrCOO-OH-M+

NH2PrCOO-M+不溶性蛋白鹽氯化高汞、硝酸銀、醋酸鉛、三氯化鐵等。M+：重金屬離子④某些酸類沉淀

反應(yīng)條件:pH<pI

NH3+PrCOO-

NH3+PrCOOHH+X-

NH3+X-PrCOOH不溶性蛋白鹽苦味酸、單寧酸、鎢酸、鞣酸、三氯乙酸等。X-：酸根一些常見的蛋白質(zhì)沉淀劑１、鹽：破壞水膜，中和電荷鹽溶、鹽析的概念２、有機(jī)溶劑：破壞水膜３、重金屬鹽：４、一些酸類物質(zhì)：與蛋白質(zhì)生成不溶性鹽。如：苦味酸、單寧酸、4、應(yīng)用：蛋白質(zhì)的分離制備滅菌技術(shù)生物樣品的分析、雜質(zhì)除去等都要涉及此反應(yīng)。（三）蛋白質(zhì)的變性1、概念：

蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用下，其空間結(jié)構(gòu)（次級鍵，特別是氫鍵）被破壞，從而改變其理化性質(zhì)，并失去生物活性，這稱為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)的變性（三）蛋白質(zhì)的變性2、變性因素：①物理因素：加熱、高壓、振蕩或攪拌、紫外線照射、超聲波及Ｘ射線等。②化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子和尿素、乙醇、丙醇等有機(jī)溶劑。3、變性實(shí)質(zhì)：維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級鍵斷裂，其特定的空間結(jié)構(gòu)被改變或破壞。二硫鍵和非共價(jià)鍵的破壞引起空間結(jié)構(gòu)的改變，不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變。蛋白質(zhì)變性的主要標(biāo)志是生物功能的喪失。介電常數(shù)介電常數(shù)是兩種電荷被真空隔絕時(shí)的電勢與被介質(zhì)隔絕時(shí)的電勢的比值。表示介質(zhì)影響相反電荷間吸力的數(shù)值。4、變性蛋白質(zhì)的特征：①理化性質(zhì)的改變：

溶解度降低；粘度上升；易被蛋白酶水解；不能結(jié)晶。②生物學(xué)性質(zhì)的改變

生物活性表失（酶失去其催化活性、激素失去其調(diào)節(jié)性、抗體失去其生物活性、細(xì)菌蛋白失去其致病性。）一些與食品相關(guān)的蛋白質(zhì)的熱變性溫度/℃

蛋白質(zhì)熱變性溫度

蛋白質(zhì)熱變性溫度牛血清白蛋白血紅蛋白雞蛋白蛋白肌紅蛋白65677679α-乳清蛋白β-乳球蛋白大豆球蛋白燕麥球蛋白838392108蛋白質(zhì)的變性程度較輕時(shí)，去除變性因素后，蛋白質(zhì)恢復(fù)原有空間構(gòu)象和生物活性的現(xiàn)象稱為復(fù)性。復(fù)性(renaturation)去除尿素，β-巰基乙醇天然狀態(tài)，-SH氧化形成-S-S-，有催化活性非折疊狀態(tài)，無活性，-S-S-被還原成-SHSHSHSHSHSHSHSHSH尿素，β-巰基乙醇天然狀態(tài)，有催化活性牛胰核糖核酸酶５、實(shí)際應(yīng)用

消毒滅菌中毒的急救臨床檢驗(yàn)保存和制備生物制劑有利于蛋白食物的消化吸收蛋白質(zhì)的凝固變性蛋白質(zhì)分子互相凝聚或互相穿插纏繞（結(jié)）在一起的現(xiàn)象。蒸蛋（四）蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)蛋白胨

小肽二肽氨基酸檢查蛋白質(zhì)水解程度的方法：①用VanSlyke測自由氨基的方法，當(dāng)水解完全時(shí)，自由氨基N趨于恒定。②用檢查雙縮脲反應(yīng)的消失（水解完全后就不再呈陽性反應(yīng)）。與亞硝酸的反應(yīng)﹢HNO2

→

亞硝酸R—CH—COOHNH2

∣氨基酸R—CH—COOH+N2↑+H2OOH

∣羥基酸（五）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)作為蛋白質(zhì)的定性和定量試驗(yàn)。作為分析氨基酸的顯色反應(yīng)。作為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)水解是否完全。1、雙縮脲反應(yīng)C=ONH2NH2C=ONH2NH2加熱180℃

C=ONH2NHC=ONH2+NH3雙縮脲尿素1、雙縮脲反應(yīng)C=ONH2NHC=ONH2+CuSO4雙縮脲紫紅色化合物1、雙縮脲反應(yīng)加熱稀堿溶液

CuSO4

蛋白質(zhì)或多肽紫紅色

氨基酸不出現(xiàn)此反應(yīng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中蛋白質(zhì)的水解不斷加強(qiáng)時(shí)，氨基酸濃度上升，其雙縮脲呈色的深度就逐漸下降，因此雙縮脲反應(yīng)可檢測蛋白質(zhì)水解程度。2、與水合茚三酮的反應(yīng)O‖‖O∕OHOH2+沸騰藍(lán)紫色化合物蛋白質(zhì)溶液3、蛋白質(zhì)黃色反應(yīng)蛋白質(zhì)溶液+濃HNO3白色沉淀加熱黃色沉淀含Phe、Tyr、Try的蛋白質(zhì)所特有的反應(yīng)4、米倫氏反應(yīng)

米倫試劑：硝酸汞亞硝酸汞硝酸亞硝酸的混合液蛋白質(zhì)溶液加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。5、乙醛酸反應(yīng)

在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間出現(xiàn)紫色環(huán)。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應(yīng)。6、酚試劑（福林試劑）反應(yīng)

蛋白質(zhì)一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及鎢鉬酸還原成藍(lán)色化合物（即鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的化合物）。定量測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)有關(guān)的基團(tuán)有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)加NaCl及少量稀CuSO4紫色粉紅色2個(gè)以上肽鍵所有的蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)加[HgNO3Hg（NO3）2HNO3]共熱紅色酚基酪氨酸黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色桔色苯基酪氨酸苯丙氨酸蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)有關(guān)的基團(tuán)有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸乙醛酸反應(yīng)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色吲哚基色氨酸茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基α-氨基酸酚試劑反應(yīng)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基酪氨酸色氨酸α-萘酚-次氯酸鹽反應(yīng)α-萘酚次氯酸鈉紅色胍基精氨酸蛋白質(zhì)的紫外吸收波長：280nm引起紫外吸收的因素：主要是酪氨酸和色氨酸(Tyr,Trp)的共軛雙鍵?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定量分析。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光譜蛋白質(zhì)的別構(gòu)作用含亞基的蛋白質(zhì)由于一個(gè)亞基的構(gòu)象改變而引起其余亞基和整個(gè)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用稱蛋白質(zhì)的別構(gòu)作用。因別構(gòu)而產(chǎn)生的效應(yīng)稱別構(gòu)效應(yīng)。正別構(gòu)效應(yīng)負(fù)別構(gòu)效應(yīng)酶的別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)酶

某些物質(zhì)能與酶分子上的非催化部位特異地結(jié)合，使酶蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的活性，這種現(xiàn)象稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)。具有這種調(diào)節(jié)作用的酶，稱為別構(gòu)酶。

第六節(jié)蛋白質(zhì)的提取、分離純化和測定1、生物材料的選擇：2、細(xì)胞的破碎：3、提取：4、過濾：5、分離：6、提純：7、測定：細(xì)胞的破碎：機(jī)械法：高速組織搗碎法玻璃勻漿器研磨（加砂）化學(xué)及生物化學(xué)法：自溶溶菌酶處理法表面活性劑處理法物理法：反復(fù)凍融法冷熱交替法超聲波處理法加壓破碎法十二烷基磺酸鈉氯化十二烷基吡啶脫氧膽酸鈉細(xì)胞破碎如目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)，需要進(jìn)行細(xì)胞破碎，使蛋白釋放出來。動(dòng)物細(xì)胞可用勻漿器、組織搗碎機(jī)、超聲波等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纖維素酶處理。微生物的細(xì)胞壁是一個(gè)大分子，破碎較難。有超聲振蕩、研磨、高壓、溶菌酶、細(xì)胞自溶等方法。蛋白質(zhì)的分離純化和鑒定提取分離純化鑒定提取

提取通常是指用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒?，從原料中把有效成分分離出來的過程。經(jīng)過處理和破細(xì)胞的原材料中的有效成分，可用緩沖液，或稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑（如丙酮、乙醇）等溶液提取。有時(shí)還可以用蒸餾水提取。理想的提取溶劑應(yīng)具備下述條件：對有效成分溶解度大，破壞作用??；對雜質(zhì)不溶解或溶解度??；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。一般用緩沖液保持pH?？扇艿鞍壮Ｓ孟←}提取，如0.1Mol/LNaCl。脂蛋白可用有機(jī)溶劑提取，不溶蛋白用稀堿處理。提取的原則是少量多次。要注意防止植物細(xì)胞液泡中的代謝物改變pH，可加入堿中和。為防止酚類氧化可加5mMol/L維生素C。加入－SH基的保護(hù)劑，防其被氧化。加碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。加入EDTA，防重金屬對蛋白質(zhì)的破壞。低溫操作。

提取

攪拌

攪拌能促使欲提取物與提取液的接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。粗提

主要目的是除去糖、脂類、核酸及大部分雜蛋白，并將蛋白濃縮。常用以下方法：沉淀法分級法：常用鹽析或有機(jī)溶劑分級沉淀蛋白

除鹽和濃縮分離用適當(dāng)方法使蛋白質(zhì)從提取液中分離出來。分離方法：等電點(diǎn)法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法核酸沉淀劑：MnCl2、硫酸魚精蛋白、鏈霉素、核酸酶等。蛋白沉淀劑：醋酸鉛、單寧酸、SDS等，也可除多糖，沉淀后應(yīng)迅速鹽析除去沉淀劑，以免目的蛋白變性。選擇變性：用加熱、調(diào)節(jié)pH或變性劑選擇性地變性雜蛋白。如提取胰蛋白酶或細(xì)胞色素C時(shí)，因其穩(wěn)定性高，可用2.5％三氯乙酸處理，使雜蛋白變性沉淀。沉淀法分級法常用鹽析或有機(jī)溶劑分級沉淀蛋白鹽析后樣品中含大量鹽類，用透析除去。也可用分子篩，如SaphadexG25層析除鹽。如樣品過稀，可用凍干、超濾等方法濃縮。除鹽和濃縮精制如需高純樣品，應(yīng)精制。常用方法有各種層析、電泳、等電聚焦、結(jié)晶等。蛋白結(jié)晶不等于無雜質(zhì)，但變性蛋白不能結(jié)晶，所以可說明其具有生物活性。

純化

從提取液中分離（沉淀）出來的蛋白質(zhì)，仍含有各種各樣的雜質(zhì)（包括鹽類、非蛋白質(zhì)物質(zhì)和其它蛋白質(zhì)），需要進(jìn)行純化才能達(dá)到一定純度。純化蛋白質(zhì)的方法：透析法凝膠過濾法超濾法纖維素柱層析法親和層析法電泳法超離心法鑒定鑒定蛋白質(zhì)純度的方法：層析法電泳法（聚丙烯酰胺凝膠電泳法）參考書：①《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》李建武等編，北京大學(xué)出版社②《生化技術(shù)導(dǎo)論》

中山大學(xué)生物系生化微生物教研室編，人民教育出版社③《生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》張龍翔、張庭芳等編，高等教育出版社④《現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)》張豐德、王秀珍主編，南開大學(xué)出版社⑤《生物化學(xué)》鄭集陳鈞輝編著高等教育出版社實(shí)驗(yàn):酸性磷酸脂酶的分離、純化

操作步驟（一）粗酶液制備將生長5-7天的綠豆芽去子葉和根，取莖部，用蒸餾水沖洗數(shù)遍。置吸水紙上吸干表面水分。準(zhǔn)確稱取200克，剪成小段，置研缽（或組織搗碎機(jī)）內(nèi)，加入少量蒸餾水及少許石英砂，在冰盤中研磨成勻漿。勻漿用雙層紗布過濾，去殘?jiān)?，濾液靜置一小時(shí)，或置冰箱中過夜，以充分提取。然后在6000rpm下離心20-30分鐘，棄去沉淀，取上清液，并用蒸餾水定溶至200毫升，置冰箱中備用。實(shí)驗(yàn):酸性磷酸脂酶的分離、純化

操作步驟（二）硫酸銨分級分離取上述粗酶液100毫升，置于燒杯中，加固體（NH4）2SO4使達(dá)40%飽和度（0.242克/毫升）。加硫酸銨時(shí)，應(yīng)邊攪拌，邊緩慢加入，以防止局部硫酸銨濃度過大而引起酶的變性。鹽析半小時(shí)后，3000rpm離心20分鐘，棄去沉淀，將上清液倒入量筒中，量準(zhǔn)體積，然后倒入燒杯中，加固體硫酸銨至75%飽和度（0.24克/毫升），鹽析半小時(shí)后，3000rpm離心20分鐘，棄去上清液，沉淀用20毫升左右蒸餾水溶解，置處理好的透析袋中，懸浮在蒸餾水中在4℃下透析24小時(shí)（中間換水2-3次）直到用飽和氯化鋇溶液檢查透析袋外部溶液中硫酸根SO42-的含量，無沉淀產(chǎn)生為止，然后將酶液用蒸餾水稀釋到100毫升，置冰箱中保存?zhèn)洹！灸繕?biāo)測試】1.詞解：肽鍵多肽Pr的等電點(diǎn)

Pr的變性作用2.填空：

a.開鏈多肽和Pr分子具有____末端和____末端。

b.Pr分子的二級結(jié)構(gòu)主要是____和____結(jié)構(gòu)。

c.某Pr分子的等電點(diǎn)是6.5，置于PH8.9的溶液中，該P(yáng)r帶____電荷，電泳時(shí)向____極移動(dòng)。問題A、肽鍵B、鹽鍵C、二硫鍵D、氫鍵E、疏水鍵1、蛋白質(zhì)分子中某些氨基酸的疏水側(cè)鏈集中可形成2、蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸殘基間可形成3、蛋白質(zhì)分子中穩(wěn)定α-螺旋的鍵力是4、蛋白質(zhì)完全水解時(shí)，分子中何種鍵斷裂問題A、α-螺旋B、β-片層C、亞基D、氨基酸排列順序E、氫鍵1、蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象之一是2、屬于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的是3、屬于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的是4、屬于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的是問題A、破壞蛋白質(zhì)分子表面的水膜，中和其電荷B、破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象C、兩者均有D、兩者均無1、蛋白質(zhì)變性2、蛋白質(zhì)變性沉淀思考題1、某蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)是5.0，置于PH8.6的溶液中，該蛋白質(zhì)帶何種電荷？電泳時(shí)向哪極移動(dòng)？2、運(yùn)用所學(xué)生化知識簡述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。血漿脂蛋白１、概念：血脂與載脂蛋白結(jié)合形成的微粒。２、組成：載脂蛋白質(zhì)、TG、PL、Ch、CE３、分類：乳