齊魯醫(yī)學(xué)農(nóng)殘分析12-農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定

農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定技術(shù)農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!6.1酶抑制分析測(cè)定法

1951年,Giang與Hall應(yīng)用有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥在體外對(duì)膽堿酯酶具有抑制作用的機(jī)理來(lái)測(cè)定其含量.1968年Mendoza利用薄層-酶抑制技術(shù)測(cè)定10種有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥,最小檢出量可達(dá)納克水平.1975年Kramer與Gamson用一種與靛酚乙酸酯相似的化合物,測(cè)定1~10μg的各種有機(jī)磷酸酯化合物,與此同時(shí),Zweig等也測(cè)定了甲萘威等農(nóng)藥.進(jìn)入20世紀(jì)80年代,人們開(kāi)始以來(lái)源豐富,取材和制備都十分方便的植物酶源,建立薄層-植物酯酶抑制方法,為酶抑制法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用創(chuàng)造了條件.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!6.1.2酶法檢測(cè)原理有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)參與神經(jīng)生理傳遞過(guò)程的乙酰膽堿酯酶AChE具有抑制作用,使該酶的分解作用不能正常進(jìn)行,從而導(dǎo)致底物乙酰膽堿的積累,影響動(dòng)物正常的神經(jīng)傳導(dǎo),引起中毒或死亡.

可將這一昆蟲(chóng)毒理學(xué)原理應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測(cè)中,如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥,酶的活性就不被抑制,試樣中加入的基質(zhì)就被酶水解,或少部分水解,水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色;反之,如果試樣提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥,酶的活性就被抑制,試樣中加入的基質(zhì)就不被酶水解,從而不顯色或顏色很淺,用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值,計(jì)算出抑制率,就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!6.1.3酶源選擇與提取酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ),其性質(zhì)的好壞,特異性大小,穩(wěn)定與否直接關(guān)系到檢測(cè)的結(jié)果.

在酶抑制檢測(cè)的技術(shù)中,既有應(yīng)用AChE的,也有應(yīng)用非特異性酯酶的,其來(lái)源既有動(dòng)物的,也有植物的.6.1.4底物和顯色劑酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯色劑很多,大致可分為以下幾類(lèi):農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!(2)酶片法:酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類(lèi)的濾紙或類(lèi)似載體物質(zhì).(3)固相酶速測(cè)技術(shù)6.2免疫檢測(cè)技術(shù)

6.2.1免疫分析概述當(dāng)細(xì)菌、病毒和有害物等病原入侵時(shí),能產(chǎn)生抵御外來(lái)物的抗體，這就是動(dòng)物的免疫反應(yīng)，致病的外來(lái)物稱為抗原。免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!(1)直接ELISA原理:

是在抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)后，直接進(jìn)行顯色的非均相固相反應(yīng)免疫分析方法。1類(lèi):首先將抗原固定在聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)壁，然后加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)記抗體，固相抗原與待測(cè)游離抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量的酶標(biāo)記抗體，反應(yīng)后洗去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作用底物，測(cè)定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測(cè)抗原的量。酶反應(yīng)活性與待測(cè)抗原的量呈負(fù)相關(guān).農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!(3)半抗原的制備

抗原是指一切能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。

抗原具有免疫原性和反應(yīng)原性。

免疫原性是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；

而反應(yīng)原性是指能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)的特性。既具有免疫原性反又具有反應(yīng)原性的抗原稱為完全抗原,而只具有反應(yīng)原性而沒(méi)有免疫原性的抗原稱為不完全抗原,也稱半抗原.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!1)多克隆抗體技術(shù)

多克隆抗體是由許多B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的混合抗體.2)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗

單克隆抗體是指由一個(gè)B淋巴細(xì)胞分化增殖的漿細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體.(6)ELISA方法的選擇分為五種類(lèi)型:1)酶標(biāo)抗原直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法;2)酶標(biāo)抗體直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法;3)酶標(biāo)抗體間接競(jìng)爭(zhēng)抑制法;4)抗體夾心法;5)間接夾心法農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!6.3生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用6.3.1生物傳感器的原理生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合,對(duì)特定種類(lèi)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置.

傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的目標(biāo)分析物之間,如酶與底物,抗原與抗體,外源凝集素與糖,核酸與其互補(bǔ)片段之間的識(shí)別反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一些物理化學(xué)信號(hào)的變化,這些變化通過(guò)不同原理的傳感器轉(zhuǎn)換成第二信號(hào),經(jīng)放大后顯示記錄.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!(1)乙酰膽堿-溴百里酚藍(lán)顯色;(2)乙酸-β-萘酯-固藍(lán)B鹽顯色反應(yīng);(3)乙酸羥基吲哚顯色法;(4)乙酸靛酯顯色法;6.1.5檢測(cè)方法(1)比色法:我國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所利用酶抑制產(chǎn)生的顯色反應(yīng),通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定酶的抑制率,以測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!6.2.2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)

原理是在測(cè)定過(guò)程，樣品提取液中的農(nóng)藥與已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的抗體吸附位點(diǎn)。

為了觀察測(cè)定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)顏色的吸光度之差就可計(jì)算出樣品中農(nóng)藥的含量.

農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待測(cè)農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法等幾個(gè)步驟.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!2類(lèi):首先固定抗體，然后同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)記抗原，待測(cè)抗原與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量的固相抗體，反應(yīng)后測(cè)定固相抗體與酶標(biāo)記抗原結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測(cè)抗原的量。

酶活性強(qiáng)度與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)。(2)間接ELISA原理首先固定抗原，然后加入待測(cè)抗原和抗體，固相抗原與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限的輪抗體，反應(yīng)后洗去游離的結(jié)合物，再加入酶標(biāo)記的第二抗體(以抗體為抗原的酶標(biāo)記抗體)，反應(yīng)后吸取酶標(biāo)記的游離抗體，測(cè)定結(jié)合物上的酶活性。酶活性與待測(cè)抗原濃度呈負(fù)相關(guān)。農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!(4)人工免疫抗原的合成首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價(jià)結(jié)合。

如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或混合酸酐法，如具有羥基活性基團(tuán)則采用琥珀酸酐法.(5)農(nóng)藥抗體制備

農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶聯(lián)后的復(fù)合物免疫動(dòng)物使機(jī)體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，并取其免疫動(dòng)物血清，然后進(jìn)行分離、鑒定其特異性而得到的。農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種途徑.農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!(7)實(shí)驗(yàn)條件的選擇

必須注意以下幾個(gè)方面:1)確定酶結(jié)合的最適濃度.2)確定包被物質(zhì)的最適濃度.3)樣品往往會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng).4)樣品前處理時(shí),使用的溶液必須考慮其影響抗體對(duì)分析物識(shí)別的可能性.(8)ELISA法的特點(diǎn):

1)適用現(xiàn)場(chǎng)快速篩選;2)適用常規(guī)方法難以檢測(cè)的農(nóng)藥;3)適用環(huán)境監(jiān)控.農(nóng)殘分析12-