膠團(tuán)反膠團(tuán)萃取

關(guān)于膠團(tuán)反膠團(tuán)萃取第1頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六目錄一、膠團(tuán)與反膠團(tuán)概述二、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備三、反膠團(tuán)萃取機(jī)理四、在分離工藝中的應(yīng)用第2頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

一、膠團(tuán)與反膠團(tuán)概述1、膠團(tuán)的形成及特性2、反膠團(tuán)的形成及特性3、表面活性劑4、反膠團(tuán)的分類

第3頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

1、膠團(tuán)的形成及特性

膠團(tuán)或反膠團(tuán)的形成均是表面活性劑分子自聚的結(jié)果，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。將表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過臨界膠團(tuán)濃度（criticalmicelleconcentration,CMC）時(shí)，表面活性劑就會(huì)在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為膠團(tuán)（micelles）。特性：水溶液中膠團(tuán)的表面活性劑的極性基團(tuán)向外與水相接觸，而非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成一個(gè)非極性的核心，此核心可以溶解非極性物質(zhì)。

第4頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六極性“頭”水非極性的“核”非極性“尾”正膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”第5頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六2、反膠團(tuán)的形成及特性

若有機(jī)溶劑中加入表面活性劑，當(dāng)其濃度超過臨界濃度時(shí)，就會(huì)在有機(jī)相中也形成聚集體，稱為反膠團(tuán)。在反膠團(tuán)中，表面活性劑的非極性基團(tuán)在外，與有機(jī)相接觸，而極性基團(tuán)則排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核。

特性：此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解水后，就形成“水池”。由于周圍水層和極性基團(tuán)的保護(hù)，保持了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)型，不會(huì)造成失活。第6頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六極性“頭”有機(jī)溶劑極性的“核”非極性“尾”反膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”第7頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六3、表面活性劑

表面活性劑的存在是構(gòu)成反膠團(tuán)的必要條件，有三類表面活性劑都可在非極性溶劑中形成反膠團(tuán)。（1）陰離子型表面活性劑（2）陽離子型表面活性劑（3）非離子型表面活性劑第8頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑第9頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

在反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)使用最多的是陰離子型表面活性劑AOT，AOT容易獲得，它具有雙鏈，形成反膠團(tuán)時(shí)無需添加輔助表面活性劑且有較好的強(qiáng)度；它的極性基團(tuán)較小，所形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于生物大分子進(jìn)入。第10頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六4、反膠團(tuán)的分類1）單一表面活性劑反膠團(tuán)體系：

是指在使用時(shí)無須加入助劑的表面活性劑，具有多條中等長度的烷基尾和一個(gè)較小的極性頭。

A、陰離子型，如AOT。該體系結(jié)構(gòu)簡單和穩(wěn)定，反膠團(tuán)體積較大，適用于等電點(diǎn)較高的、相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)的分離；

B、陽離子型，如CTAB，DAP等。該體系適用于等電點(diǎn)較低的、相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)的分離；

C、非離子型表面活性劑。能形成更大的反膠團(tuán)體系，能分離相對(duì)分子量更大的蛋白質(zhì)，但這類體系容易乳化。第11頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六2）混合表面活性劑反膠團(tuán)體系：

是指兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的體系，一般來說，混合表面活性劑反膠團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)有更高的分離效率。

3）親和反膠團(tuán)體系：

是指除了有組成反膠團(tuán)的表面活性劑以外，還有具有親和特征的助劑，它的親和配基與蛋白質(zhì)有特異的結(jié)合能力，往往極少量親和配基的加入就可使萃取蛋白質(zhì)的選擇性大大提高。第12頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六表面活性劑聚集體的可能的微觀構(gòu)造第13頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六1、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性影響反膠團(tuán)的大小的因素：（1）表面活性劑和非極性有機(jī)溶劑的種類、濃度；（2）操作時(shí)體系的溫度、壓力；（3）微小水池中的離子強(qiáng)度等。二、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備第14頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（1）反膠團(tuán)的臨界膠團(tuán)濃度表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑相中能形成反膠團(tuán)的最小濃度稱為臨界膠團(tuán)濃度（CMC）。大多數(shù)在0.1~1.0mmol/L之間。CMC與表面活性劑的種類有關(guān)。

見下表第15頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六某些表面活性劑的臨界膠束濃度／(mol／L)第16頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（2）反膠團(tuán)含水率W：W用水和表面活性劑的摩爾濃度之比來定義：

C[水]

W=

C[表面活性劑]

如：表面活性劑是AOT，則W=

W越大，反膠團(tuán)的半徑越大。C[AOT]C[水]第17頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

當(dāng)W<6-8時(shí)，“水池”（微水相）中水分子被表面活性劑親水基團(tuán)強(qiáng)烈地束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常強(qiáng)。另外，其冰點(diǎn)通常低于0℃。這一部分水使表面活性劑的親水性基團(tuán)水合化，即被牢固地束縛著，所以粘度很大，流動(dòng)性很差。第18頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

在AOT反膠團(tuán)中，水合化一分子AOT需要6~8個(gè)水分子，而其它水分子則不受束縛，可與普通水一樣自由流動(dòng)。故當(dāng)W>16時(shí)，“水池”中的水逐漸接近主體水相粘度，膠團(tuán)內(nèi)也形成二重電荷層。

第19頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六第20頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

假定反膠團(tuán)為球形（除了W或表面活性劑濃度很大外），反膠團(tuán)平均直徑dm的增加和W的增加基本成正比，W=0~50之間，dm=2~30nm。AOT的Wmax=60，若W值再增大，反膠團(tuán)溶液變渾濁，并開始分層。第21頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六2、反膠團(tuán)的制備制備反膠團(tuán)系統(tǒng)一般有以下三種方法：（1）注入法

將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中去，然后進(jìn)行攪拌直到形成透明的溶液為止。該方法過程快，并能較好地控制反膠團(tuán)的平均直徑和含水量。第22頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（2）相轉(zhuǎn)移法

將酶或蛋白質(zhì)從主體水相轉(zhuǎn)移到含表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中形成反膠團(tuán)-蛋白質(zhì)溶液，即把含有表面活性劑的有機(jī)相和含有蛋白質(zhì)的水相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質(zhì)緩慢轉(zhuǎn)入（萃入）有機(jī)相。

該過程較慢，但形成的體系處于穩(wěn)定的熱力學(xué)平衡狀態(tài)，有利于在有機(jī)溶劑相中獲得較高的蛋白質(zhì)濃度。第23頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（3）溶解法

將含有反膠團(tuán)（W＝3~30）的有機(jī)溶液與蛋白質(zhì)固體粉末一齊攪拌，使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)中。用于非水溶性蛋白質(zhì)。該法所需時(shí)間較長，含蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)體系穩(wěn)定。說明反膠團(tuán)“水池”中的水與普通水的性質(zhì)有區(qū)別。第24頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

三、反膠團(tuán)萃取1.反膠團(tuán)萃取原理2.反膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)3.影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素4.反膠團(tuán)萃取幾種相互作用5.蛋白質(zhì)的溶解模型第25頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六膠團(tuán)萃?。╩icellarextrceion）是被萃取物以膠團(tuán)或者膠體形式從水相被萃取到有機(jī)相的溶劑萃取方法，既可用于無機(jī)物的萃取，也可用于有機(jī)物的萃取。反膠團(tuán)萃?。╮eversedmicellarextrceion）是利用表面活性劑在有機(jī)溶劑相中形成反膠團(tuán)進(jìn)行萃取，即反膠團(tuán)在有機(jī)相內(nèi)形成一個(gè)親水微環(huán)境，使蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)溶解于其中，從而避免在有機(jī)相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。第26頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六1、反膠團(tuán)萃取原理

從宏觀上看反膠團(tuán)萃取，是有機(jī)相－水相間的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微觀上，是從主體水相向溶解于有機(jī)溶劑相中的反膠團(tuán)微水相中的分配萃取。從原理上，可當(dāng)做“液膜”分離操作的一種。如下圖所示：第27頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六第28頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六2、反膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)①萃取率和反萃取率高，并具有選擇性；②分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過程簡便；③能解決蛋白質(zhì)(如胞內(nèi)酶)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題；④由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；⑤反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。第29頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六3、影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素

（1）水相pH值的影響蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，水相的pH值決定了蛋白質(zhì)分子表面可電離基團(tuán)的離子化程度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶電荷與反膠團(tuán)內(nèi)所帶電荷的性質(zhì)相反時(shí)，由于靜電引力，可使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到反膠團(tuán)中。相反，當(dāng)水相pH大于等電點(diǎn)時(shí)，由于靜電斥力，使溶入反膠團(tuán)的蛋白質(zhì)反向萃取出來，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃取。

第30頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（2）水相離子強(qiáng)度的影響

a：離子強(qiáng)度影響到反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電屏蔽的程度，降低了蛋白質(zhì)分子和反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電作用力。b：減小表面活性劑極性頭之間的相互斥力，使反膠團(tuán)變小。這兩方面的效應(yīng)都會(huì)使蛋白質(zhì)分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)中反萃取出來。

第31頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（3）助表面活性劑的影響

蛋白質(zhì)的分子量往往很大，超過幾萬或幾十萬，使表面活性劑形成的反膠團(tuán)的大小不足以包容大的蛋白質(zhì)，而無法實(shí)現(xiàn)萃取，此時(shí)加入一些非離子表面活性劑，使它們插入反膠團(tuán)結(jié)構(gòu)中，就可以增大反膠團(tuán)的尺寸，溶解相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)。

第32頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

（4）溶劑體系的影響

溶劑的性質(zhì)，尤其是極性，對(duì)反膠團(tuán)的形成和大小都有影響。常用的溶劑有：烷烴類（正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷等）。有時(shí)也使用助溶劑，如醇類。可以調(diào)節(jié)溶劑體系的極性，改變反膠團(tuán)的大小，增加蛋白質(zhì)的溶解度。第33頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六4、反膠團(tuán)萃取相互作用因分離中使用的表面活性劑種類不同，如陰離子型和陽離子型，其相互作用和分離原理也會(huì)不同。以立體性、靜電性、疏水性相互作用的分離特性歸納如下：

第34頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六1）氨基酸分離特性

氨基酸分子量與反膠團(tuán)相比太小，不存在反膠團(tuán)-氨基酸分子間的立體性相互作用和分子間的大小識(shí)別。但由于氨基酸因pH不同而發(fā)生正負(fù)電荷的變化和帶有疏水性殘基，所以，以靜電和疏水性相互作用來定量評(píng)價(jià)氨基酸的萃取特性和效果。第35頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六如圖，平均每單位正電荷量、每分子AOT，萃入的氨基酸分子數(shù)是一固定值，該值由氨基酸種類決定。氨基酸殘基的疏水性越大，該值越大。第36頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六2）酶、蛋白質(zhì)萃取特性

酶、蛋白質(zhì)等生物大分子的空間尺度與反膠團(tuán)的大小相接近，故存在立體性相互作用。各種相互作用都很重要，在大多數(shù)情況下，是它們之間的復(fù)合作用。有些蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生很小的變化時(shí)，就可能對(duì)這些相互作用的結(jié)果產(chǎn)生很大影響。第37頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（1）靜電性相互作用第38頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

①小分子蛋白質(zhì)（Mr<20000）當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)不能溶入膠團(tuán)內(nèi)，但在等電點(diǎn)附近，急速變?yōu)榭扇堋?/p>

當(dāng)pH<pI時(shí)，即在蛋白質(zhì)帶正電荷的pH范圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團(tuán)內(nèi)。第39頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

②蛋白質(zhì)分子量增大到一定程度，即使將pH向酸性一側(cè)偏離pI，萃取率也會(huì)降低（即立體性相互作用效果增大）。

③分子量更大的BSA，全pH范圍內(nèi)幾乎都不能萃取（即靜電相互作用效果無限小，可忽略不計(jì)）。此時(shí)，AOT濃度如從通常條件（50~100mmol/L）增加到200~500mmol/L，逐漸變?yōu)榭奢腿?。?0頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六④降低pH，正電荷量增加，萃取率從某一pH開始，急速減小。這是因?yàn)閜H導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性造成的。蛋白質(zhì)和微量的AOT在靜電、疏水性等的相互作用下，在水相中形成了復(fù)合體而變性。第41頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六⑤添加KCl等無機(jī)鹽，因離子強(qiáng)度的增加和靜電屏蔽的作用，而使靜電性相互作用變?nèi)?，一般地，萃取率下降。?2頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（2）立體性相互作用（空間位阻）隨蛋白質(zhì)分子量的增大，蛋白質(zhì)分子和膠團(tuán)間的立體性相互作用增加，萃取率下降。第43頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六萃取溶入膠團(tuán)的蛋白質(zhì)的種類和分子量不同，對(duì)分離場的特性（膠團(tuán)平均直徑和含水率）影響很小。隨著蛋白質(zhì)分子量的增加，分配系數(shù)KpI（蛋白質(zhì)等電點(diǎn)處的分配系數(shù)）迅速下降?？梢哉J(rèn)為相對(duì)分子量20000左右的蛋白質(zhì)的高效分離是通過立體性相互作用來實(shí)現(xiàn)的。第44頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六（3）其它的相互作用

關(guān)于疏水性相互作用和特異性相互作用，還研究不多。一般認(rèn)為疏水性相互作用對(duì)蛋白質(zhì)分配特性的影響不大。第45頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六蛋白質(zhì)向非極性溶劑中反膠團(tuán)的納米級(jí)水池中的溶解，有下圖所示的四種可能。（1）為水殼模型；（2）蛋白質(zhì)中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳?xì)浠衔锵嘟佑|；（3）蛋白質(zhì)被吸附在微膠團(tuán)的“內(nèi)壁”上；（4）蛋白質(zhì)被幾個(gè)微膠團(tuán)所溶解，微膠團(tuán)的非極性尾端與蛋白質(zhì)的親脂部分直接作用。5、蛋白質(zhì)的溶解模型第46頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六第47頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

在水殼模型中，蛋白質(zhì)居于“水池”的中心，水殼層保護(hù)了蛋白質(zhì)，使它的生物活性不會(huì)改變。蛋白質(zhì)表面電荷與反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷間的靜電作用是使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)的重要因素，因此凡能影響靜電作用的因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶入，如水溶液的pH、離子強(qiáng)度等。第48頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六四、在分離工藝中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)分離

利用靜電相互作用，通過三步分離核糖核酸a、細(xì)胞色素c和溶菌酶。調(diào)整pH，進(jìn)行正萃取分離，通過控制KCl濃度，反萃取分離，獲得較好地分離效果和收率。第49頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六第50頁，共55頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)15分，星期六

第一步：在pH=9.0和較低的鹽濃度下，核糖核酸酶a帶負(fù)電荷，不能被反膠團(tuán)萃取，留在水相中，而細(xì)胞色素C和溶菌酶由于都帶正電荷，被萃取到反膠團(tuán)中。第二步：利用提高離子強(qiáng)