單克隆抗體制備課件

單克隆抗體制備Monoclonalantibody單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的針對(duì)同一個(gè)抗原決定簇的抗體。分三個(gè)階段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立篩選方法和程序（3）雜交瘤的生成單克隆抗體制備Monoclonalantibody1一、動(dòng)物免疫1Balb/c小鼠6-8周齡，25g左右，雌性較佳2免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5ml抗原與福氏完全佐劑1：1的混和液，一般2-3只鼠（2）30天后加強(qiáng)免疫，用福氏不完全佐劑一、動(dòng)物免疫1Balb/c小鼠2（3）15天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫3天后，去脾臟融合對(duì)于抗原性弱的抗原，可增加免疫次數(shù)，具體程序依抗原性質(zhì)而定。（3）15天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫3可溶性蛋白（提取或表達(dá)的蛋白）50-100μg顆粒性蛋白（病毒）50-100μg細(xì)菌106CFU活細(xì)胞（哺乳動(dòng)物細(xì)胞）105-7CFU活癌源細(xì)胞104-6CFU糖類（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg可溶性蛋白（提取或表達(dá)的蛋白）50-100μg41在液氮罐中取保存的SP2/0細(xì)胞，以MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2在對(duì)數(shù)生長期收獲107-108CFU的SP2/0細(xì)胞3500g離心5min，棄上清4輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)細(xì)胞，重懸于20mLMEM營養(yǎng)液中二、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)1在液氮罐中取保存的SP2/0細(xì)胞，以二、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)5注意要點(diǎn)：1如細(xì)胞外觀不健康，或生長密度不好，應(yīng)檢測(cè)是否有支原體污染2一次用一個(gè)凍存管里的細(xì)胞融合，應(yīng)避免長期培養(yǎng)3融合的細(xì)胞要處于對(duì)數(shù)生長期注意要點(diǎn)：6三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備1取清潔級(jí)ICR小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹部皮膚4用20mL注射器吸取15mLMEM營養(yǎng)液，注入小鼠腹腔三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備1取清潔級(jí)ICR小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠75輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來回抽吸幾次，將小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞吸出，置細(xì)胞瓶內(nèi)待用6將飼養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)至50mL離心管內(nèi)，500g離心5min，以HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)待用5輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來回抽吸幾8注意事項(xiàng)：1嚴(yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙?吸取腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不能將腸道刺破，否則會(huì)造成污染3如腹腔里的脂肪塊堵塞針頭，應(yīng)調(diào)整針頭的位置，重新吸取細(xì)胞液注意事項(xiàng)：9四、脾細(xì)胞的制備1取Balb/c小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹腔4小心分離出脾臟，置含有7mLMEM營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)四、脾細(xì)胞的制備1取Balb/c小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，105用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾細(xì)胞分離出來6用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液吸置50mL離心管中，沉降5min7將細(xì)胞懸液吸置另外一支離心管中，500g離心5min，棄上清，沉淀以20mLMEM培養(yǎng)基重懸5用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾11注意事項(xiàng)：1嚴(yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙?取脾臟時(shí)，如果脾臟被脂肪粘連，需小心，不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破3如果脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好，應(yīng)選用備用小鼠的脾臟注意事項(xiàng)：12五、細(xì)胞融合及培養(yǎng)1以2：1混合脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，加至細(xì)胞融合管中2在室溫下500g離心10min，棄上清3輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)和混合細(xì)胞，后置37℃水浴4在60S內(nèi)用巴氏吸管將0.8mL預(yù)熱至37℃PEG1500緩慢加至細(xì)胞內(nèi)，并輕輕抽吸兩次五、細(xì)胞融合及培養(yǎng)1以2：1混合脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，135在90S內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預(yù)熱至37℃的MEM培養(yǎng)基加至融合管中37℃水浴5min室溫下500g離心10min，棄上清在融合管內(nèi)加入HAT培養(yǎng)基20mL，將沉淀懸浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加入HAT培養(yǎng)基30mL，后加入10-15mL飼養(yǎng)細(xì)胞懸液5在90S內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預(yù)熱至149將細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-3滴，約0.1-0.15mL10將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11培養(yǎng)3天后可取出細(xì)胞板在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況9將細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-1512培養(yǎng)置第5天時(shí)用HAT培養(yǎng)基換液，換1/2137-8天用HT培養(yǎng)基換液，全部換液1410-14天后，雜交瘤細(xì)胞占孔底1/3以上，細(xì)胞上清變黃，可以檢測(cè)融合細(xì)胞上清里的抗體。12培養(yǎng)置第5天時(shí)用HAT培養(yǎng)基換液，換1/216注意事項(xiàng)：1脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的比例在2：1—5：1最好2細(xì)胞融合是關(guān)鍵步驟，避免用力吸打3細(xì)胞融合后3天要注意檢查是否污染，包括細(xì)菌和真菌，一發(fā)現(xiàn)污染，要盡快棄去4換液時(shí)不要影響孔底的雜交瘤細(xì)胞，不要吸出或沖散注意事項(xiàng)：17六、雜交瘤細(xì)胞的篩選大約有10%的雜交瘤細(xì)胞能分泌抗體，而分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞更少，故需要篩選。篩選抗體分泌細(xì)胞有多種方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中間接ELISA應(yīng)用最廣。六、雜交瘤細(xì)胞的篩選大約有10%的雜交瘤細(xì)胞能分泌18注意事項(xiàng)：1因單抗是鼠源的，故酶標(biāo)記抗抗體常用酶標(biāo)羊抗鼠或兔抗鼠抗體，包括抗IgG、IgM的抗體。如單用酶標(biāo)記抗IgG抗體，則IgM類單抗就不能被篩選出來。2陽性克隆轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞長滿后，上清再檢測(cè)一次3篩選方法應(yīng)在細(xì)胞融合前建立好，一部篩選特異單抗的方法最好注意事項(xiàng)：19七、雜交瘤細(xì)胞克隆在分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞中，可能混有不分泌單抗的細(xì)胞克隆；另外分泌單抗的克隆在初代不穩(wěn)定，有一部分細(xì)胞染色體常丟失，為了防止不分泌抗體的細(xì)胞過度生長，在早期應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆。常用有限稀釋法，一般來說，雜交瘤經(jīng)過3-4次克隆后就穩(wěn)定了。七、雜交瘤細(xì)胞克隆在分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞201在克隆的前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有0.1mL飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板2將24孔板里的待克隆細(xì)胞懸浮，取0.1mL細(xì)胞懸液加入0.9mL臺(tái)盼藍(lán)染色液，混勻3血液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)4在24孔培養(yǎng)板上，對(duì)待克隆細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍比稀釋1在克隆的前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有0.1mL飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板215當(dāng)稀釋至100CFU/mL時(shí)，取1mL細(xì)胞懸液至裝有10mLHT培養(yǎng)基的瓶中，再分別加至96孔板中（預(yù)先加有飼養(yǎng)細(xì)胞），0.1mL/孔6將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天左右，注意觀察7大約3-4天在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞克隆，5-7天換液一次，810天左右克隆長滿，可以檢測(cè)上清5當(dāng)稀釋至100CFU/mL時(shí)，取1mL細(xì)胞懸液至裝有1022注意事項(xiàng)：1上清液要在24h內(nèi)測(cè)定2細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)只計(jì)活細(xì)胞（淡藍(lán)色），死細(xì)胞為深藍(lán)色，且沒有光澤3如有高質(zhì)量的FCS ，可不用飼養(yǎng)細(xì)胞4一個(gè)克隆需亞克隆3-4次，才穩(wěn)定5如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加1mol/mL的CuSO4溶液注意事項(xiàng)：23七、實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？贵w制備體外上清液培養(yǎng)1雜交瘤細(xì)胞先在25mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2細(xì)胞長滿瓶底后轉(zhuǎn)至50或100mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3當(dāng)細(xì)胞液變黃后，收集上清液，再加新鮮的培養(yǎng)液，并重復(fù)收集上清2次4讓細(xì)胞長至飽和狀態(tài)，直至死亡，并收集上清七、實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？贵w制備體外上清液培養(yǎng)24體內(nèi)生產(chǎn)腹水1正常培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞2飼養(yǎng)Balb/c小鼠，注射細(xì)胞一周前通過腹腔注射0.5mL降植烷3在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期收獲細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)量以培養(yǎng)液調(diào)整至（2-10）×107CFU4小鼠腹腔注射0.5mL細(xì)胞懸液，1-2周后發(fā)展成癌性腹水體內(nèi)生產(chǎn)腹水255用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠可收集2-3次6腹水5000g離心10min，收集澄清的上清，除去油脂7加入0.05%的疊氮鈉，小量分裝保存。長期置-70℃保存；備用4℃保存5用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠26八、雜交瘤細(xì)胞的保存1培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期2棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，以Hanks液洗滌一次3棄去洗滌液，加入含10%DMSO、10%犢牛血清的MEM培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞4將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞凍存管，每中等細(xì)胞培養(yǎng)瓶分兩管，先放-70℃冰箱凍30min，然后置液氮罐中保存八、雜交瘤細(xì)胞的保存1培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期27單克隆抗體制備Monoclonalantibody單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的針對(duì)同一個(gè)抗原決定簇的抗體。分三個(gè)階段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立篩選方法和程序（3）雜交瘤的生成單克隆抗體制備Monoclonalantibody28一、動(dòng)物免疫1Balb/c小鼠6-8周齡，25g左右，雌性較佳2免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5ml抗原與福氏完全佐劑1：1的混和液，一般2-3只鼠（2）30天后加強(qiáng)免疫，用福氏不完全佐劑一、動(dòng)物免疫1Balb/c小鼠29（3）15天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫3天后，去脾臟融合對(duì)于抗原性弱的抗原，可增加免疫次數(shù)，具體程序依抗原性質(zhì)而定。（3）15天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫30可溶性蛋白（提取或表達(dá)的蛋白）50-100μg顆粒性蛋白（病毒）50-100μg細(xì)菌106CFU活細(xì)胞（哺乳動(dòng)物細(xì)胞）105-7CFU活癌源細(xì)胞104-6CFU糖類（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg可溶性蛋白（提取或表達(dá)的蛋白）50-100μg311在液氮罐中取保存的SP2/0細(xì)胞，以MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2在對(duì)數(shù)生長期收獲107-108CFU的SP2/0細(xì)胞3500g離心5min，棄上清4輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)細(xì)胞，重懸于20mLMEM營養(yǎng)液中二、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)1在液氮罐中取保存的SP2/0細(xì)胞，以二、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)32注意要點(diǎn)：1如細(xì)胞外觀不健康，或生長密度不好，應(yīng)檢測(cè)是否有支原體污染2一次用一個(gè)凍存管里的細(xì)胞融合，應(yīng)避免長期培養(yǎng)3融合的細(xì)胞要處于對(duì)數(shù)生長期注意要點(diǎn)：33三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備1取清潔級(jí)ICR小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹部皮膚4用20mL注射器吸取15mLMEM營養(yǎng)液，注入小鼠腹腔三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備1取清潔級(jí)ICR小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠345輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來回抽吸幾次，將小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞吸出，置細(xì)胞瓶內(nèi)待用6將飼養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)至50mL離心管內(nèi)，500g離心5min，以HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)待用5輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來回抽吸幾35注意事項(xiàng)：1嚴(yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙?吸取腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不能將腸道刺破，否則會(huì)造成污染3如腹腔里的脂肪塊堵塞針頭，應(yīng)調(diào)整針頭的位置，重新吸取細(xì)胞液注意事項(xiàng)：36四、脾細(xì)胞的制備1取Balb/c小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹腔4小心分離出脾臟，置含有7mLMEM營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)四、脾細(xì)胞的制備1取Balb/c小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，375用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾細(xì)胞分離出來6用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液吸置50mL離心管中，沉降5min7將細(xì)胞懸液吸置另外一支離心管中，500g離心5min，棄上清，沉淀以20mLMEM培養(yǎng)基重懸5用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾38注意事項(xiàng)：1嚴(yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙?取脾臟時(shí)，如果脾臟被脂肪粘連，需小心，不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破3如果脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好，應(yīng)選用備用小鼠的脾臟注意事項(xiàng)：39五、細(xì)胞融合及培養(yǎng)1以2：1混合脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，加至細(xì)胞融合管中2在室溫下500g離心10min，棄上清3輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)和混合細(xì)胞，后置37℃水浴4在60S內(nèi)用巴氏吸管將0.8mL預(yù)熱至37℃PEG1500緩慢加至細(xì)胞內(nèi)，并輕輕抽吸兩次五、細(xì)胞融合及培養(yǎng)1以2：1混合脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，405在90S內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預(yù)熱至37℃的MEM培養(yǎng)基加至融合管中37℃水浴5min室溫下500g離心10min，棄上清在融合管內(nèi)加入HAT培養(yǎng)基20mL，將沉淀懸浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加入HAT培養(yǎng)基30mL，后加入10-15mL飼養(yǎng)細(xì)胞懸液5在90S內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預(yù)熱至419將細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-3滴，約0.1-0.15mL10將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11培養(yǎng)3天后可取出細(xì)胞板在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況9將細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-4212培養(yǎng)置第5天時(shí)用HAT培養(yǎng)基換液，換1/2137-8天用HT培養(yǎng)基換液，全部換液1410-14天后，雜交瘤細(xì)胞占孔底1/3以上，細(xì)胞上清變黃，可以檢測(cè)融合細(xì)胞上清里的抗體。12培養(yǎng)置第5天時(shí)用HAT培養(yǎng)基換液，換1/243注意事項(xiàng)：1脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的比例在2：1—5：1最好2細(xì)胞融合是關(guān)鍵步驟，避免用力吸打3細(xì)胞融合后3天要注意檢查是否污染，包括細(xì)菌和真菌，一發(fā)現(xiàn)污染，要盡快棄去4換液時(shí)不要影響孔底的雜交瘤細(xì)胞，不要吸出或沖散注意事項(xiàng)：44六、雜交瘤細(xì)胞的篩選大約有10%的雜交瘤細(xì)胞能分泌抗體，而分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞更少，故需要篩選。篩選抗體分泌細(xì)胞有多種方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中間接ELISA應(yīng)用最廣。六、雜交瘤細(xì)胞的篩選大約有10%的雜交瘤細(xì)胞能分泌45注意事項(xiàng)：1因單抗是鼠源的，故酶標(biāo)記抗抗體常用酶標(biāo)羊抗鼠或兔抗鼠抗體，包括抗IgG、IgM的抗體。如單用酶標(biāo)記抗IgG抗體，則IgM類單抗就不能被篩選出來。2陽性克隆轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞長滿后，上清再檢測(cè)一次3篩選方法應(yīng)在細(xì)胞融合前建立好，一部篩選特異單抗的方法最好注意事項(xiàng)：46七、雜交瘤細(xì)胞克隆在分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞中，可能混有不分泌單抗的細(xì)胞克隆；另外分泌單抗的克隆在初代不穩(wěn)定，有一部分細(xì)胞染色體常丟失，為了防止不分泌抗體的細(xì)胞過度生長，在早期應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆。常用有限稀釋法，一般來說，雜交瘤經(jīng)過3-4次克隆后就穩(wěn)定了。七、雜交瘤細(xì)胞克隆在分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞471在克隆的前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有0.1mL飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板2將24孔板里的待克隆細(xì)胞懸浮，取0.1mL細(xì)胞懸液加入0.9mL臺(tái)盼藍(lán)染色液，混勻3血液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)4在24孔培養(yǎng)板上，對(duì)待克隆細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍比稀釋1在克隆的前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有0.1mL飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板485當(dāng)稀釋至100CFU/mL時(shí)，取1mL細(xì)胞懸液至裝有10mLHT培養(yǎng)基的瓶中，再分別加至96孔板中（預(yù)先加有飼養(yǎng)細(xì)胞），0.1mL/孔6將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天左右，注意觀察7大約3-4天在倒置顯