設(shè)計(jì)PCR熱循環(huán)儀的挑戰(zhàn)

4/4設(shè)計(jì)PCR熱循環(huán)儀的挑戰(zhàn)分子診斷是幫助醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行診斷和做出決策的關(guān)鍵技術(shù)。研究者將實(shí)驗(yàn)室測試與分子生物學(xué)相結(jié)合，以提高檢測微生物病原體和分析患者基因的速度和準(zhǔn)確性。分子診斷技術(shù)可以快速執(zhí)行基因檢測工作，分離DNA鏈并快速復(fù)制數(shù)百萬次，甚至數(shù)十億次，為醫(yī)生提供做出正確診斷和治療決策所必需的基本信息。

聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是分子診斷中常用的一種技術(shù)，它將單個(gè)DNA拷貝或幾條DNA鏈放大多個(gè)數(shù)量級，生成數(shù)十萬份特定DNA序列。這種方法依賴于熱循環(huán)，包括重復(fù)加熱和冷卻DNA熔化和DNA酶促復(fù)制反應(yīng)的循環(huán)。PCR實(shí)驗(yàn)需要大量的熱循環(huán)步驟來產(chǎn)生數(shù)千條DNA序列以進(jìn)行分析。

熱循環(huán)

通常，PCR由一系列20到40次重復(fù)的溫度變化組成，稱為循環(huán)，每次循環(huán)使DNA拷貝加倍。在大約40個(gè)循環(huán)中，可以生成大約10億個(gè)DNA拷貝，以生成足夠的生物標(biāo)記物，其可以通過光學(xué)測量系統(tǒng)高精度識(shí)別。循環(huán)之前通常在高溫（95°C）下進(jìn)行單一溫度步驟，分離DNA，然后冷卻至50至65°C之間的熔融溫度，生物標(biāo)記物將與DNA結(jié)合，最后將溫度提高到72℃，以便對DNA的拷貝進(jìn)行檢測。每個(gè)階段的設(shè)定點(diǎn)溫度和時(shí)間長度取決于基于生物標(biāo)記物附著于DNA程度的各種參數(shù)。

熱循環(huán)儀

PCR在特殊分子診斷裝置中進(jìn)行的，也稱為熱循環(huán)儀。在熱循環(huán)儀中，每個(gè)工藝溫度的加熱和冷卻時(shí)間需要精確的溫度控制，需要極快的升降溫速率，以最大限度地縮短擴(kuò)增的總持續(xù)時(shí)間?？刂苽?cè)由控溫模塊組成，以放置樣品孔。

整個(gè)熱模塊只能允許最小的溫度梯度，以最大限度地降低整個(gè)樣品孔的溫度過沖，這對于使用多孔的自動(dòng)PCR儀來說是一個(gè)挑戰(zhàn)。

PCR儀主要有三種類型：傳統(tǒng)的、實(shí)時(shí)的和定量的。在90年代設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)PCR儀準(zhǔn)確性差、靈敏度低，而且在測試之后才能獲得結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR儀允許技術(shù)人員在測試過程中查看結(jié)果，為定量提供最精確的數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)PCR使POCT檢測成為可能，在較短的時(shí)間內(nèi)向患者提供結(jié)果。POC測試確?；颊唠S時(shí)隨地獲得最有效的醫(yī)療護(hù)理。定量分析，即數(shù)字PCR，樣本擴(kuò)增后，對陽性和陰性反應(yīng)的數(shù)目進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，直接獲得樣品的拷貝數(shù)，可以進(jìn)行比實(shí)時(shí)PCR更精確的分析。

隨著熱循環(huán)儀應(yīng)用的普及，以及使用需求的提高，研究人員一直在探索在不犧牲速度、易用性或可重復(fù)性的條件下，如何設(shè)計(jì)經(jīng)濟(jì)高效的熱循儀。那么設(shè)計(jì)熱循環(huán)儀時(shí)，有哪些因素需要考慮呢：

速度

PCR通過快速加熱和冷卻樣品至不同溫度來分離DNA鏈，結(jié)合引物，并構(gòu)建新的DNA。大多數(shù)熱循儀的目標(biāo)是盡可能快地從一個(gè)溫度轉(zhuǎn)換到另一個(gè)溫度，這有助于防止靶外效應(yīng)，影響PCR實(shí)驗(yàn)的成功。目前大多數(shù)PCR系統(tǒng)用熱電模塊（TEM-thermoelectricmodule）進(jìn)行快速控溫。與其他類型的熱循環(huán)裝置相比，熱電模塊的優(yōu)點(diǎn)是精確的溫度控制，緊湊、更快的升溫速率和效率，但是由于其體積的限制，對于產(chǎn)品便攜性要求高的客戶，則需要考慮其他的溫控方式。

界面

為了讓熱循環(huán)儀正確地執(zhí)行DNA擴(kuò)增，使用者需要輸入循環(huán)參數(shù)——溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。目前市面上PCR儀器的用戶界面多種多樣，有些帶有小屏幕的按鈕界面，有些帶有獨(dú)立平板電腦進(jìn)行編程，還有些使用觸摸屏界面。用戶界面在用戶可用性方面起著至關(guān)重要的作用，如何設(shè)計(jì)用戶界面（UI）,在兼顧實(shí)用性，易用性的同時(shí)又能減少失誤操作并保持美觀是需要開發(fā)人員進(jìn)行研究探討的部分。

樣本容量

市面上的PCR儀檢測通量小到16個(gè)多到384個(gè)，在對PCR儀進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，不應(yīng)該一味的追求高通量，因?yàn)楦咄靠赡芤馕吨叱杀竞透邚?fù)雜度。設(shè)計(jì)人員需要考慮目標(biāo)市場的使用情況，如果只是針對一般研究市場，96孔就足夠了，但是如果需要面向新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的市場則可設(shè)計(jì)更高通量。當(dāng)然樣本通量的不足也可通過提高熱循環(huán)速率來彌補(bǔ)。

光源和檢測器

熒光定量PCR的設(shè)計(jì)勢必涉及到激發(fā)光源和檢測器的選擇，主流的光源有鹵素?zé)簦瘑紊獿ED／白光LED濾光片分光等，檢測器有CCD成像/PMT檢測等。各種設(shè)計(jì)都有優(yōu)缺點(diǎn)，鹵素?zé)魤勖糖夜庠茨芰坎环€(wěn)定，單色LED在多通道設(shè)備上需要的光源多，白光LED經(jīng)過濾光片分光后單色光能量低，熒光激發(fā)效果降低；CCD成像快但檢測96孔之間有光程差和光密度差，存在邊緣效應(yīng)，設(shè)備挪動(dòng)以后相機(jī)可能發(fā)生位移，需要校正；PMT檢測一般是逐孔檢測，每個(gè)通道對應(yīng)一個(gè)檢測器，數(shù)量多而復(fù)雜。因此在選擇光源和檢測器時(shí)需要兼顧生產(chǎn)成本，設(shè)備檢測穩(wěn)定性以及后期維護(hù)成本。

設(shè)計(jì)熱循環(huán)儀的挑戰(zhàn)

常規(guī)的PCR儀在目前市場上已經(jīng)非常普遍，大部分的設(shè)計(jì)難題已經(jīng)被攻克。但是當(dāng)將PCR儀整合到即時(shí)分子診斷儀器時(shí)，則會(huì)帶來一些新的挑