顯色基質(zhì)和濁度法的區(qū)別

、光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的有色團(tuán)的量之間存在著量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測反應(yīng)混合物的色度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測色度增長速度的方法。光度測定試驗(yàn)應(yīng)在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37°C±1°C。供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進(jìn)行。為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品溶液的干擾試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對照。當(dāng)陰性對照在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。否則須重新試驗(yàn)。干擾試驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個(gè)平行管。光度測定法干擾試驗(yàn)的制備編號內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液不少于2個(gè)B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為Am）供試品溶液不少于2個(gè)C至少3個(gè)濃度（最低一點(diǎn)設(shè)定為A）檢查用水每一濃度不少于2個(gè)注A：稀釋倍數(shù)未超過MVD的供試品溶液。8：加入標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C：如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。D：陰性對照。按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。R=（Cs-Ct）/Xmx100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%?200%之間，則認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍時(shí)，須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素。并要重復(fù)干擾試驗(yàn)來驗(yàn)證處理的有效性。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢查法按“光度法的干擾試驗(yàn)”中的操作步驟進(jìn)行檢測。使用溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效：（1）系列溶液C的結(jié)果要符合“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”中的要求。（2）用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)。（3）溶液D在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)。若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。（注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應(yīng)容器，如微孔板中的孔。）注：2005年版中國藥典中指出：細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)過處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250°C干烤至少60分鐘。也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微板孔和微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素，并且對試驗(yàn)無干擾的器械，試驗(yàn)操作過程防止微生物污染。二、關(guān)于顯色基質(zhì)鱟試劑試驗(yàn)的一些問題微板法（56Test）能測樣品數(shù)（做平行管）需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線：23個(gè)樣本不需做標(biāo)準(zhǔn)曲線：能測樣品數(shù)（做平行管）50ul50ul優(yōu)缺點(diǎn)96個(gè)孔同時(shí)操作，同時(shí)讀數(shù)，效率與試管法相比可提高十倍以上，但該方法需要酶標(biāo)儀（405nm濾光片）注意事項(xiàng)為避免操作誤差，每個(gè)樣品均做2孔，再求其平均值三、內(nèi)毒素試驗(yàn)（內(nèi)毒素定量檢測）所需試劑及儀器試劑（鱟試劑包括凝膠法一一定性、顯色基質(zhì)法一一定量、動(dòng)態(tài)濁度法一一定量）名字用途及說明規(guī)格鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)，檢測樣品中內(nèi)毒素用10支/盒（凝膠法）、試劑盒（光度法）內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)，做陽性對照，或烘箱驗(yàn)證10支/盒檢查水溶解鱟試劑用或稀釋用10支/盒（2ml、10ml）瓶（50ml）耗材名字用途及說明規(guī)格除熱原吸頭稀釋急加樣。普通吸頭會(huì)干擾試驗(yàn)，造成假陽性不能使用。5支/小包（200|jl、250|jl、1000|jl）除熱原試管未除熱原試管稀釋用或反應(yīng)用容器使用前需洗干凈250度干烤1h6支/包除熱原空安瓿稀釋用或反應(yīng)用容器10支/盒真空采血管采血用含抗凝劑5ml除熱原加樣槽加樣用（顯色基質(zhì)鱟試劑微板法用）配合8道移液器3個(gè)/包除熱原微板加樣用（顯色基質(zhì)鱟試劑微板法用）個(gè)除熱原針筒采樣用支儀器名字用途及說明規(guī)格旋渦混合器混勻內(nèi)毒素溶液移液槍加樣大龍（推薦）200-1000pl等各種規(guī)格酶標(biāo)儀檢測內(nèi)毒素含量（顯色基質(zhì)鱟試劑微板法用）北京普朗集團(tuán)（DNM-9602G）型（推薦）分光光度計(jì)檢測內(nèi)毒素含量（顯色基質(zhì)鱟試劑試管法用）可見光光度計(jì)恒溫水浴鍋保溫、加熱4.其他名字用途及說明規(guī)格G因子抑制劑抑制G因子旁路反應(yīng)0.6ml/支鈣鎂離子添加劑陽離子調(diào)節(jié)劑1ml/支抗凝劑血液樣品使用5ml/支血液稀釋劑血液樣品使用5ml/支定量鱟試劑（光度測定法）產(chǎn)品規(guī)格：0.6ml/支、1.25ml/支、2.2ml/支、3.2ml/支產(chǎn)品說明：?用途：用作藥品注射劑、生物制品、放射性藥品、醫(yī)療器械（輸、注器具）細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測。?使用方法：詳見產(chǎn)