顯色基質(zhì)和濁度法的區(qū)別

、光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應過程過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是依據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是依據(jù)反應混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的有色團的量之間存在著量化關系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反應混合物的色度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測色度增長速度的方法。光度測定試驗應在特定的儀器中進行，溫度一般為37°C±1°C。供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品溶液的干擾試驗。標準曲線的可靠性試驗當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。用標準內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照。當陰性對照在設定的時間內(nèi)不發(fā)生反應，將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標準曲線的相關系數(shù)（r）的絕對值應該大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重新試驗。干擾試驗選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個平行管。光度測定法干擾試驗的制備編號內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液不少于2個B標準曲線的中點（或附近點）的濃度（設為Am）供試品溶液不少于2個C至少3個濃度（最低一點設定為A）檢查用水每一濃度不少于2個注A：稀釋倍數(shù)未超過MVD的供試品溶液。8：加入標準曲線中點或靠近中點的一個已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C：如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線的標準內(nèi)毒素溶液。D：陰性對照。按所得線性回歸方程分別計算供試品溶液和含標準內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。R=（Cs-Ct）/Xmx100%當內(nèi)毒素的回收率在50%?200%之間，則認為在此該試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。當內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍時，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素。并要重復干擾試驗來驗證處理的有效性。當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。檢查法按“光度法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。使用溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。試驗必須符合以下三個條件方為有效：（1）系列溶液C的結(jié)果要符合“標準曲線的可靠性試驗”中的要求。（2）用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)。（3）溶液D在規(guī)定的時間內(nèi)不發(fā)生反應。若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。（注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。）注：2005年版中國藥典中指出：細菌內(nèi)毒素試驗所用的器皿需經(jīng)過處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250°C干烤至少60分鐘。也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微板孔和微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內(nèi)毒素，并且對試驗無干擾的器械，試驗操作過程防止微生物污染。二、關于顯色基質(zhì)鱟試劑試驗的一些問題微板法（56Test）能測樣品數(shù)（做平行管）需要做標準曲線：23個樣本不需做標準曲線：能測樣品數(shù)（做平行管）50ul50ul優(yōu)缺點96個孔同時操作，同時讀數(shù)，效率與試管法相比可提高十倍以上，但該方法需要酶標儀（405nm濾光片）注意事項為避免操作誤差，每個樣品均做2孔，再求其平均值三、內(nèi)毒素試驗（內(nèi)毒素定量檢測）所需試劑及儀器試劑（鱟試劑包括凝膠法一一定性、顯色基質(zhì)法一一定量、動態(tài)濁度法一一定量）名字用途及說明規(guī)格鱟試劑與內(nèi)毒素反應，檢測樣品中內(nèi)毒素用10支/盒（凝膠法）、試劑盒（光度法）內(nèi)毒素與鱟試劑反應，做陽性對照，或烘箱驗證10支/盒檢查水溶解鱟試劑用或稀釋用10支/盒（2ml、10ml）瓶（50ml）耗材名字用途及說明規(guī)格除熱原吸頭稀釋急加樣。普通吸頭會干擾試驗，造成假陽性不能使用。5支/小包（200|jl、250|jl、1000|jl）除熱原試管未除熱原試管稀釋用或反應用容器使用前需洗干凈250度干烤1h6支/包除熱原空安瓿稀釋用或反應用容器10支/盒真空采血管采血用含抗凝劑5ml除熱原加樣槽加樣用（顯色基質(zhì)鱟試劑微板法用）配合8道移液器3個/包除熱原微板加樣用（顯色基質(zhì)鱟試劑微板法用）個除熱原針筒采樣用支儀器名字用途及說明規(guī)格旋渦混合器混勻內(nèi)毒素溶液移液槍加樣大龍（推薦）200-1000pl等各種規(guī)格酶標儀檢測內(nèi)毒素含量（顯色基質(zhì)鱟試劑微板法用）北京普朗集團（DNM-9602G）型（推薦）分光光度計檢測內(nèi)毒素含量（顯色基質(zhì)鱟試劑試管法用）可見光光度計恒溫水浴鍋保溫、加熱4.其他名字用途及說明規(guī)格G因子抑制劑抑制G因子旁路反應0.6ml/支鈣鎂離子添加劑陽離子調(diào)節(jié)劑1ml/支抗凝劑血液樣品使用5ml/支血液稀釋劑血液樣品使用5ml/支定量鱟試劑（光度測定法）產(chǎn)品規(guī)格：0.6ml/支、1.25ml/支、2.2ml/支、3.2ml/支產(chǎn)品說明：?用途：用作藥品注射劑、生物制品、放射性藥品、醫(yī)療器械（輸、注器具）細菌內(nèi)毒素定量檢測。?使用方法：詳見產(chǎn)