常用的定量PCR熒光探針-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件

生物系統(tǒng)中mRNA或DNA等目標(biāo)核酸分子的分析鑒定必須回答如下三個(gè)基本問題：目標(biāo)核酸分子是否存在于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量是多少。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的序列如何；以及與其他實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的情況比較，目標(biāo)核酸分子的序列是否有變化。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－11生物系統(tǒng)中mRNA或DNA等目標(biāo)核酸分子的分析鑒定核酸實(shí)驗(yàn)研證明目標(biāo)核酸分子是否存在于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的基本實(shí)驗(yàn)方法：1）雜交法，2）PCR法，3）測序法。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－12證明目標(biāo)核酸分子是否存在于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的基本實(shí)驗(yàn)方法：核酸實(shí)驗(yàn)雜交法：序列已知，同時(shí)還要合成一個(gè)標(biāo)記了的特異性探針。Dotblotting：不經(jīng)過電泳，直接把檢測樣本點(diǎn)在一個(gè)適宜載體上，針對目標(biāo)DNA分子或RNA分子進(jìn)行雜交檢測。Southernblotting：在電泳后，針對目標(biāo)DNA分子的雜交檢測。Northernblotting：在電泳后，針對目標(biāo)RNA分子的雜交檢測。目標(biāo)DNA分子原位雜交檢測。目標(biāo)RNA分子原位雜交檢測。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－13雜交法：序列已知，同時(shí)還要合成一個(gè)標(biāo)記了的特異性探針。核酸實(shí)雜交法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：Dotblotting：簡單實(shí)用，適于進(jìn)行大樣本數(shù)同時(shí)檢測。Northernblotting：如果檢測結(jié)果陽性，其可信度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RT-PCR，因此被譽(yù)為評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)錄的GoldenMarker。Southernblotting：對DNA病毒類病原體等的檢測實(shí)用性很強(qiáng)。缺點(diǎn)：Dotblotting：由于在同一斑點(diǎn)位置，除了目標(biāo)核酸分子外，同時(shí)還存在其它的成千上萬種不同的核酸分子，而這些核酸分子有可能會(huì)與探針分子部分結(jié)合，這會(huì)促進(jìn)探針分子與目標(biāo)核酸分子的結(jié)合，因此將可能導(dǎo)致陽性結(jié)果放大，甚至是假陽性結(jié)果。Northernblotting：對低拷貝mRNA有時(shí)檢測不出來，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－14雜交法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－14例一：cDNAmicroarray檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因mRNA轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果反向Dotblotting核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－15例一：反向Dotblotting核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1例二：Northernblotting檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果NGAL化學(xué)發(fā)光法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－16例二：NGAL化學(xué)發(fā)光法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－16例三：Northernblotting檢測缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞EGR1基因轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果EGR1同位素法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－17例三：EGR1同位素法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－17確保雜交法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)1：確保實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理。關(guān)鍵點(diǎn)2：確保探針的特異性充分。關(guān)鍵點(diǎn)3：確保檢測的靈敏度足夠高。關(guān)鍵點(diǎn)4：確保樣本質(zhì)量合格。關(guān)鍵點(diǎn)5：確保實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量合格。關(guān)鍵點(diǎn)6：確保實(shí)驗(yàn)過程規(guī)范。關(guān)鍵點(diǎn)7：對于編碼序列的cDNA，要確保沒有RNA的干擾。關(guān)鍵點(diǎn)8：幾種雜交法，或雜交法與其它方法聯(lián)合使用，相互印證，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－18確保雜交法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－18PCR法：序列已知，同時(shí)還要合成一對特異性引物。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)的靈敏度很高，理論上可檢測實(shí)驗(yàn)生物系統(tǒng)中所存在的1個(gè)拷貝目標(biāo)核酸分子。陰性結(jié)果的可信度很高。缺點(diǎn)：由于容易存在樣本污染情況，與此同時(shí)，畢竟在實(shí)驗(yàn)過程中存在著目標(biāo)核酸分子拷貝數(shù)人為放大這樣一個(gè)事實(shí)，因此，其陽性結(jié)果的可信度不如Northernboltting或Southernboltting。9PCR法：序列已知，同時(shí)還要合成一對特異性引物。核酸實(shí)驗(yàn)研究例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果NGAL600bpSMS:食管癌細(xì)胞SHEECM:DNAmarker核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－110例子：NGALSMS:食管癌細(xì)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1確保PCR法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)1：確保實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理。關(guān)鍵點(diǎn)2：確保引物的特異性充分。關(guān)鍵點(diǎn)3：確保樣本質(zhì)量合格。關(guān)鍵點(diǎn)4：確保實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量。關(guān)鍵點(diǎn)5：確保實(shí)驗(yàn)過程規(guī)范。關(guān)鍵點(diǎn)6：確保PCR變性、退火和延伸溫度適度。關(guān)鍵點(diǎn)7：對于編碼序列cDNA，要確保沒有RNA的干擾。關(guān)鍵點(diǎn)8：幾種PCR法，或PCR法與其它方法聯(lián)合使用，相互印證，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。11核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1確保PCR法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：1核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測序法：通過電泳等手段已知實(shí)驗(yàn)生物系統(tǒng)中目標(biāo)核酸的大致大小，而且是對照生物系統(tǒng)中不存在，或者兩者相比在含量上可能有顯著差別，然而序列未知。優(yōu)點(diǎn)：可信度最高。對于解析鑒定未知核酸分子序列片段是必需的手段。缺點(diǎn)：目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時(shí)不準(zhǔn)確，在讀原初測序圖時(shí)要格外小心。12核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測序法：通過電泳等手段已知實(shí)驗(yàn)生物系核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時(shí)不準(zhǔn)確例子13核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時(shí)不準(zhǔn)確PolyAtail核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－114PolyAtail核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－114核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－115核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－115核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量16核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量16核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Dotblotting，結(jié)合斑點(diǎn)光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子、目標(biāo)cDNA分子或目標(biāo)DNA分子的含量17核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Dotblotting，結(jié)合A永生化食管上皮細(xì)胞SHEEB食管癌細(xì)胞SHEEC例子：cDNAmicroarray（反向Dotblotting）檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：B/A2或0.5為顯著性差異表達(dá)實(shí)際情況：B/A＝3.53核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－118AB例子：cDNAmicroarray（反向Dotb核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過RT-PCR，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子或目標(biāo)cDNA分子的含量19核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過RT-PCR，結(jié)合條帶光密度掃例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果NGAL600bpABMA:永生化食管上皮細(xì)胞SHEEB:食管癌細(xì)胞SHEECM:DNAmarkerABMGAPDH226bp核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－120例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮兩個(gè)問題：

反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)是否需要探針？

反轉(zhuǎn)錄PCR的特異性如何保證？

核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－121兩個(gè)問題：

反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)是否需要探針？

反轉(zhuǎn)錄PCR核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Northernblotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子的含量22核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Northernblotti例一：Northernblotting檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（化學(xué)發(fā)光）NGALABA:食管癌細(xì)胞SHEECB:永生化食管上皮細(xì)胞SHEEABGAPDHABAB500-400-300-200-100-100-80-60-40-20-核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－123例一：Northernblotting檢測SHEEC食管核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1例二：Northernblotting檢測缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞EGR1基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果(同位素標(biāo)記法)1正常2缺氧復(fù)氧3缺氧復(fù)氧＋溶劑對照4缺氧復(fù)氧＋F25缺氧復(fù)氧＋鈣離子拮抗劑1234512345EGR1-Actin24核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1例二：Northernblotti核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)DNA分子的含量25核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotti核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)DNA分子的含量26核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotti核糖核酸酶保護(hù)分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一種較好的mRNA定量檢測技術(shù)。RPA的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均優(yōu)于NorthernBlotting。運(yùn)用RPA可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)RNA分子的高通量定量檢測。核糖核酸酶保護(hù)分析RibonucleaseProtectionAssay(RPA)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－127核糖核酸酶保護(hù)分析核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－127原理：以目標(biāo)基因DNA為模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作為標(biāo)記信號(hào)，體外轉(zhuǎn)錄合成反義RNA探針。將過量的反義RNA探針與樣品總RNA雜交，然后進(jìn)行核糖核酸酶處理。未與探針雜交的單鏈RNA和過量的游離探針被降解，而目標(biāo)RNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被‘保護(hù)’。雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或化學(xué)發(fā)光等方法確定目標(biāo)RNA的量。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－128原理：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－128核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－129核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－129核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1適時(shí)熒光定量PCRRealtimefluorescentquantitationPCR30核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1適時(shí)熒光定量PCR30適時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的本質(zhì)區(qū)別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性定量或半定量分析適時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：通過一個(gè)特殊的熒光探針，對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一次循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行適時(shí)跟蹤定量分析

核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－131適時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的本質(zhì)區(qū)別核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展realtimePCR的擴(kuò)增曲線核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－132realtimePCR的擴(kuò)增曲線核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－PE公司在同一臺(tái)PCR儀上對相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖Ct值極具重現(xiàn)性核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－133PE公司在同一臺(tái)PCR儀上對相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)值與模板數(shù)成正比固定熒光信號(hào)值后，循環(huán)數(shù)與初始模板數(shù)成反比。初始模板數(shù)越多,熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少起始模板濃度的對數(shù)與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的初始模板數(shù)。Threshold104103102核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－134Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)值與模板數(shù)成正比T常用的定量PCR熒光探針SYBRGreenITaqman水解探針分子信標(biāo)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－135常用的定量PCR熒光探針核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－135SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－136SYBRGreenI核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－136SYBRGreenI工作原理未結(jié)合的SYBRgreenI核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－137SYBRGreenI工作原理未結(jié)合的SYBRgreeSYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)價(jià)格相對便宜使用簡便可以用于不同的模板靈敏度很高SYBRGreenI的缺點(diǎn)特異性較差核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－138SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－138TaqManProbes熒光素淬滅劑

與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTETJOEHEXVIC

TAMRADABCYL核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－139TaqManProbes熒光素淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTaqManProbes工作原理探針與目標(biāo)序列配對，熒光基團(tuán)與熒光淬滅劑相鄰，不發(fā)生特異熒光光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團(tuán)

淬滅劑

延伸時(shí)，Taq酶水解探針，熒光基團(tuán)與熒光淬滅劑分離，發(fā)出特異熒光。Taq發(fā)出特異熒光光另一波長的熒光核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－140TaqManProbes工作原理探針與目標(biāo)序列配對，熒光TaqManProbes的優(yōu)點(diǎn)：定量關(guān)系準(zhǔn)確。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加，TaqMan探針釋放出來的熒光基團(tuán)成倍增加，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。TaqMan探針特別適合于病毒定量、基因轉(zhuǎn)錄水平定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測等。敏感性高。特異性高。TaqManProbes的缺點(diǎn)：只適合于一個(gè)特定目標(biāo)的檢測。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－141TaqManProbes的優(yōu)點(diǎn)：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－14分子信標(biāo)(發(fā)夾型雜交探針)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)

淬滅劑

莖(5-7bp)

環(huán)（15-30bp）FAMTexasRed核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－142分子信標(biāo)(發(fā)夾型雜交探針)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對的序列組成環(huán)分子信標(biāo)工作原理探針與DNA模板雜交光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)單鏈DNA模板淬滅劑

莖

環(huán)光＋核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－143分子信標(biāo)工作原理探針與DNA模板雜交光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)單鏈D分子信標(biāo)優(yōu)點(diǎn)：分子信標(biāo)能特異性地檢測目標(biāo)DNA分子信標(biāo)可用于單核苷酸多態(tài)性的檢測特別適用于檢測點(diǎn)突變分子信標(biāo)的缺點(diǎn)只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格較高核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－144分子信標(biāo)優(yōu)點(diǎn)：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－144ABIPrism7700可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對多個(gè)靶DNA或cDNA分子進(jìn)行擴(kuò)增檢測一次可以測定96個(gè)樣本速度較快，一批樣本的完成只需要2～3小時(shí)可應(yīng)用水解探針、雙鏈DNA結(jié)合染料和分子信標(biāo)等不能實(shí)時(shí)對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，只能在全部擴(kuò)增結(jié)束后再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－145ABIPrism7700可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對多個(gè)靶生物系統(tǒng)中mRNA或DNA等目標(biāo)核酸分子的分析鑒定必須回答如下三個(gè)基本問題：目標(biāo)核酸分子是否存在于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量是多少。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的序列如何；以及與其他實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的情況比較，目標(biāo)核酸分子的序列是否有變化。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－146生物系統(tǒng)中mRNA或DNA等目標(biāo)核酸分子的分析鑒定核酸實(shí)驗(yàn)研證明目標(biāo)核酸分子是否存在于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的基本實(shí)驗(yàn)方法：1）雜交法，2）PCR法，3）測序法。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－147證明目標(biāo)核酸分子是否存在于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的基本實(shí)驗(yàn)方法：核酸實(shí)驗(yàn)雜交法：序列已知，同時(shí)還要合成一個(gè)標(biāo)記了的特異性探針。Dotblotting：不經(jīng)過電泳，直接把檢測樣本點(diǎn)在一個(gè)適宜載體上，針對目標(biāo)DNA分子或RNA分子進(jìn)行雜交檢測。Southernblotting：在電泳后，針對目標(biāo)DNA分子的雜交檢測。Northernblotting：在電泳后，針對目標(biāo)RNA分子的雜交檢測。目標(biāo)DNA分子原位雜交檢測。目標(biāo)RNA分子原位雜交檢測。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－148雜交法：序列已知，同時(shí)還要合成一個(gè)標(biāo)記了的特異性探針。核酸實(shí)雜交法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：Dotblotting：簡單實(shí)用，適于進(jìn)行大樣本數(shù)同時(shí)檢測。Northernblotting：如果檢測結(jié)果陽性，其可信度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RT-PCR，因此被譽(yù)為評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)錄的GoldenMarker。Southernblotting：對DNA病毒類病原體等的檢測實(shí)用性很強(qiáng)。缺點(diǎn)：Dotblotting：由于在同一斑點(diǎn)位置，除了目標(biāo)核酸分子外，同時(shí)還存在其它的成千上萬種不同的核酸分子，而這些核酸分子有可能會(huì)與探針分子部分結(jié)合，這會(huì)促進(jìn)探針分子與目標(biāo)核酸分子的結(jié)合，因此將可能導(dǎo)致陽性結(jié)果放大，甚至是假陽性結(jié)果。Northernblotting：對低拷貝mRNA有時(shí)檢測不出來，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－149雜交法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－14例一：cDNAmicroarray檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因mRNA轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果反向Dotblotting核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－150例一：反向Dotblotting核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1例二：Northernblotting檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果NGAL化學(xué)發(fā)光法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－151例二：NGAL化學(xué)發(fā)光法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－16例三：Northernblotting檢測缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞EGR1基因轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果EGR1同位素法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－152例三：EGR1同位素法核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－17確保雜交法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)1：確保實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理。關(guān)鍵點(diǎn)2：確保探針的特異性充分。關(guān)鍵點(diǎn)3：確保檢測的靈敏度足夠高。關(guān)鍵點(diǎn)4：確保樣本質(zhì)量合格。關(guān)鍵點(diǎn)5：確保實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量合格。關(guān)鍵點(diǎn)6：確保實(shí)驗(yàn)過程規(guī)范。關(guān)鍵點(diǎn)7：對于編碼序列的cDNA，要確保沒有RNA的干擾。關(guān)鍵點(diǎn)8：幾種雜交法，或雜交法與其它方法聯(lián)合使用，相互印證，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－153確保雜交法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－18PCR法：序列已知，同時(shí)還要合成一對特異性引物。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)的靈敏度很高，理論上可檢測實(shí)驗(yàn)生物系統(tǒng)中所存在的1個(gè)拷貝目標(biāo)核酸分子。陰性結(jié)果的可信度很高。缺點(diǎn)：由于容易存在樣本污染情況，與此同時(shí)，畢竟在實(shí)驗(yàn)過程中存在著目標(biāo)核酸分子拷貝數(shù)人為放大這樣一個(gè)事實(shí)，因此，其陽性結(jié)果的可信度不如Northernboltting或Southernboltting。54PCR法：序列已知，同時(shí)還要合成一對特異性引物。核酸實(shí)驗(yàn)研究例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果NGAL600bpSMS:食管癌細(xì)胞SHEECM:DNAmarker核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－155例子：NGALSMS:食管癌細(xì)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1確保PCR法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)1：確保實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理。關(guān)鍵點(diǎn)2：確保引物的特異性充分。關(guān)鍵點(diǎn)3：確保樣本質(zhì)量合格。關(guān)鍵點(diǎn)4：確保實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量。關(guān)鍵點(diǎn)5：確保實(shí)驗(yàn)過程規(guī)范。關(guān)鍵點(diǎn)6：確保PCR變性、退火和延伸溫度適度。關(guān)鍵點(diǎn)7：對于編碼序列cDNA，要確保沒有RNA的干擾。關(guān)鍵點(diǎn)8：幾種PCR法，或PCR法與其它方法聯(lián)合使用，相互印證，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。56核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1確保PCR法實(shí)驗(yàn)成功的八個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：1核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測序法：通過電泳等手段已知實(shí)驗(yàn)生物系統(tǒng)中目標(biāo)核酸的大致大小，而且是對照生物系統(tǒng)中不存在，或者兩者相比在含量上可能有顯著差別，然而序列未知。優(yōu)點(diǎn)：可信度最高。對于解析鑒定未知核酸分子序列片段是必需的手段。缺點(diǎn)：目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時(shí)不準(zhǔn)確，在讀原初測序圖時(shí)要格外小心。57核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測序法：通過電泳等手段已知實(shí)驗(yàn)生物系核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時(shí)不準(zhǔn)確例子58核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時(shí)不準(zhǔn)確PolyAtail核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－159PolyAtail核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－114核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－160核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－115核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量61核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量16核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Dotblotting，結(jié)合斑點(diǎn)光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子、目標(biāo)cDNA分子或目標(biāo)DNA分子的含量62核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Dotblotting，結(jié)合A永生化食管上皮細(xì)胞SHEEB食管癌細(xì)胞SHEEC例子：cDNAmicroarray（反向Dotblotting）檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：B/A2或0.5為顯著性差異表達(dá)實(shí)際情況：B/A＝3.53核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－163AB例子：cDNAmicroarray（反向Dotb核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過RT-PCR，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子或目標(biāo)cDNA分子的含量64核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過RT-PCR，結(jié)合條帶光密度掃例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果NGAL600bpABMA:永生化食管上皮細(xì)胞SHEEB:食管癌細(xì)胞SHEECM:DNAmarkerABMGAPDH226bp核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－165例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮兩個(gè)問題：

反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)是否需要探針？

反轉(zhuǎn)錄PCR的特異性如何保證？

核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－166兩個(gè)問題：

反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)是否需要探針？

反轉(zhuǎn)錄PCR核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Northernblotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子的含量67核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Northernblotti例一：Northernblotting檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（化學(xué)發(fā)光）NGALABA:食管癌細(xì)胞SHEECB:永生化食管上皮細(xì)胞SHEEABGAPDHABAB500-400-300-200-100-100-80-60-40-20-核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－168例一：Northernblotting檢測SHEEC食管核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1例二：Northernblotting檢測缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞EGR1基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果(同位素標(biāo)記法)1正常2缺氧復(fù)氧3缺氧復(fù)氧＋溶劑對照4缺氧復(fù)氧＋F25缺氧復(fù)氧＋鈣離子拮抗劑1234512345EGR1-Actin69核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1例二：Northernblotti核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)DNA分子的含量70核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotti核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中目標(biāo)DNA分子的含量71核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1通過Southernblotti核糖核酸酶保護(hù)分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一種較好的mRNA定量檢測技術(shù)。RPA的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均優(yōu)于NorthernBlotting。運(yùn)用RPA可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)RNA分子的高通量定量檢測。核糖核酸酶保護(hù)分析RibonucleaseProtectionAssay(RPA)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－172核糖核酸酶保護(hù)分析核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－127原理：以目標(biāo)基因DNA為模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作為標(biāo)記信號(hào)，體外轉(zhuǎn)錄合成反義RNA探針。將過量的反義RNA探針與樣品總RNA雜交，然后進(jìn)行核糖核酸酶處理。未與探針雜交的單鏈RNA和過量的游離探針被降解，而目標(biāo)RNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被‘保護(hù)’。雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或化學(xué)發(fā)光等方法確定目標(biāo)RNA的量。核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－173原理：核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－128核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－174核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－129核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1適時(shí)熒光定量PCRRealtimefluorescentquantitationPCR75核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－1適時(shí)熒光定量PCR30適時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的本質(zhì)區(qū)別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性定量或半定量分析適時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：通過一個(gè)特殊的熒光探針，對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一次循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行適時(shí)跟蹤定量分析

核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－176適時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的本質(zhì)區(qū)別核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展realtimePCR的擴(kuò)增曲線核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－177realtimePCR的擴(kuò)增曲線核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－PE公司在同一臺(tái)PCR儀上對相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖Ct值極具重現(xiàn)性核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－178PE公司在同一臺(tái)PCR儀上對相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)值與模板數(shù)成正比固定熒光信號(hào)值后，循環(huán)數(shù)與初始模板數(shù)成反比。初始模板數(shù)越多,熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少起始模板濃度的對數(shù)與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的初始模板數(shù)。Threshold104103102核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－179Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)值與模板數(shù)成正比T常用的定量PCR熒光探針SYBRGreenITaqman水解探針分子信標(biāo)核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－180常用的定量PCR熒光探針核酸實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)進(jìn)展－135SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA