免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)

第二十章免疫檢驗自動化儀器分析第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)一、免疫透射比濁法二、免疫膠乳比濁法三、免疫散射比濁法四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用第二十章第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)1第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)第二節(jié)自動化發(fā)光免疫分析系統(tǒng)一、吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀四、在臨床免疫檢測中的應(yīng)用第三節(jié)自動化熒光免疫分析系統(tǒng)一、時間分辨熒光免疫分析儀二、熒光偏振免疫分析儀思考題小結(jié)第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)第二節(jié)自動化發(fā)光免疫分析系2免疫檢驗自動化

（automationofimmunoassays)

是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進行。免疫檢驗自動化（automationofimmuno3第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)免疫濁度分析的基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)免疫濁度分析的基本原理是4一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標準品比較，可確定標本中抗原含量。一、免疫透射比濁法（一）原理：一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，被其中的免疫5免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)61.將待檢標本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）儀器工作過程2.將待測標本和標準抗原溶液（5個濃度抗原標準品）與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測定各管吸光度。

3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。1.將待檢標本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）儀器工作過程7（三）方法評價

優(yōu)點:靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準確

不足:

①抗體用量較大；②溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大③透射比濁測定在抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測需在抗原抗體反應(yīng)達到平衡后進行，耗時較長。

（三）方法評價優(yōu)點:不足:8用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強。

二、免疫膠乳比濁法（一）原理：用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm9（二）方法評價

本法敏感度大大高于普通比濁法，可達ng/L水平，操作簡便，易自動化；血清中的類風(fēng)濕因子(RF)可與IgGFc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會嚴重影響結(jié)果。（二）方法評價本法敏感度大大高于普通比濁法，可10粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：三、免疫散射比濁法(一)原理粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微11

式Iθ中為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的波長和強度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4式Iθ中為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的12免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)13定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時段進行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。(二)定時散射比濁法（fixedtimenephelometry）定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反141.儀器測定技術(shù)要點

(1)抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段(2)反應(yīng)階段(3)信號檢測1.儀器測定技術(shù)要點(1)抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段15

2.抗原過量檢測

(1)抗體適當(dāng)過量

(2)對抗原過量進行閾值限定2.抗原過量檢測(1)抗體適當(dāng)過量16定時散射比濁法測定原理示意圖定時散射比濁法測定原理示意圖17BNProSpec全自動特定蛋白分析儀BNProSpec全自動特定蛋白分析儀18速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1～2min即可完成。

(三)速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是19儀器測定技術(shù)要點

開啟機器，進行定標反應(yīng)階段抗原過量檢測儀器測定技術(shù)要點開啟機器，進行定標20抗原抗體復(fù)合物形成的速率

累計時間（s）形成IC總量速率累計時間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

20抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計時間（s）形成IC總量21抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化22免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)23免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)24免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)25IMMAGE全自動特定蛋白分析儀IMMAGE全自動特定蛋白分析儀26(三)方法評價散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精密等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴,對抗體的質(zhì)量要求很高。(三)方法評價散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法27

1.抗原抗體比例

2.抗體的質(zhì)量

3.增濁劑的使用

（一）免疫比濁分析的影響因素四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用1.抗原抗體比例（一）免疫比濁分析的影響因素四、免疫比284.偽濁度5.入射光光源和波長6.結(jié)果報告中的計量單位7.標準曲線制備與質(zhì)量控制

4.偽濁度29（二）臨床應(yīng)用

免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。

（二）臨床應(yīng)用免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白30

第二節(jié)自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

自動化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反應(yīng)系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)和計算機數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。

第二節(jié)自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

自動化發(fā)光免疫分析儀主要31吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結(jié)合法等相同。

一、吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或32免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)33YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY順磁性微粒示意圖

磁微粒技術(shù)

磁微粒在電磁場中分離磁微粒標記抗體YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY34發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后雙抗體夾心法直接化學(xué)發(fā)光的機理（1）加入酸性H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYY35儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合洗滌、分離加入氧化劑發(fā)光信號檢測

儀器測定技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合36

吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖37ACS：180SE和ACS∶CENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ACS：180SEACS∶CENTAURACS：180SE和ACS∶CENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析38ci8200i2000srci8200i2000sr39

酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強弱來進行被測物的定量。常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。

二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀

酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的40該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用增強劑使化學(xué)發(fā)光強度增加、時間延長。

㈠辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體、以塑料錐41魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生物（激發(fā)態(tài)）。它以光量子輻射形式返回基態(tài)時，發(fā)出微綠色可見光。魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生42魯米諾增強化學(xué)發(fā)光的原理魯米諾增強化學(xué)發(fā)光的原理43辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖

辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖44VitrosECi全自動增強化學(xué)發(fā)光酶免分析儀VitrosECi全自動增強化學(xué)發(fā)光酶免分析儀45

㈡堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

該儀器是以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以

順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)

光劑進行測定的自動化儀器。

㈡堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器是以堿46AMPPD發(fā)光反應(yīng)原理示意圖

AMPPD發(fā)光反應(yīng)原理示意圖47抗原抗體結(jié)合洗滌、分離加入AMPPD發(fā)光劑信號檢測

儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合儀器測定技術(shù)要點48堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖

堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖49Access全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Access全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀50UniCel?DxI800UniCel?DxI80051IMMULITE2000型全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)IMMULITE2000型全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)52（三）堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀

該儀器以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原），以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團，形成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。（三）堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀該儀器以堿534-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應(yīng)原理示意圖

4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應(yīng)原理示意圖54儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合洗滌、分離加入底物4-MUP信號檢測儀器測定技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合55堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫測定示意圖堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫測定示意圖56AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀57AIA-1800型全自動酶標記熒光免疫分析儀AIA-1800型全自動酶標記熒光免疫分析儀58

電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)吡啶釕標記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設(shè)計的一種自動化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時間長，易于控制并可根據(jù)待測分子的大小設(shè)計成多種反應(yīng)模式如夾心法、競爭法等。

三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)59三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+分子結(jié)構(gòu)圖三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+分子結(jié)構(gòu)圖60電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反應(yīng)原理

電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反應(yīng)原理61磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應(yīng)體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分離。磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體62儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)光信號檢測檢測完畢

儀器測定技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合63電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖64電化學(xué)發(fā)光免疫測定工作示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定工作示意圖65標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖66ELECSYS2010型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ELECSYS2010型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀67ModularAnalyticsE模塊170型ModularAnalyticsE模塊170型68

可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標和貧血類等方面的檢測，是目前免疫化學(xué)應(yīng)用最為廣泛的新技術(shù)。

四、在臨床免疫檢測中的應(yīng)用可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物69第三節(jié)自動化熒光免疫分析系統(tǒng)

熒光免疫自動化分析主要是將抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計算機技術(shù)有機結(jié)合的一項自動化免疫分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。

第三節(jié)自動化熒光免疫分析系統(tǒng)熒光免疫自動化分析70

時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay,TRFIA）是以鑭系元素標記抗原或抗體作為示蹤物，并與時間分辨測定技術(shù)相結(jié)合，建立起來的一種新型非放射性微量分析技術(shù)，具有靈敏度高，鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，標準曲線范圍寬等特點，已在臨床實驗室廣泛使用。

一、時間分辨熒光免疫分析儀時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedflu71Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移

（一）、原理Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移（一）72時間分辨Eu3+元素?zé)晒庑盘枩y量示意圖

時間分辨Eu3+元素?zé)晒庑盘枩y量示意圖73（二）儀器測定技術(shù)要點

⒈抗原抗體結(jié)合⒉加入Eu3+螯合抗體⒊加入酸性增強液

4.信號檢測

（二）儀器測定技術(shù)要點⒈抗原抗體結(jié)合74固相雙抗體夾心TRFIA檢測過程示意圖

固相雙抗體夾心TRFIA檢測過程示意圖75增強液(enhancementsolution)，使Eu3+抗體－抗原復(fù)合物的PH值降低至2~3，以利于Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來，游離的Eu3+為增強液中的另一種螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等其它成分的作用下，與增強液中的β-二酮體生成一個Eu3+在其內(nèi)部的保護性膠態(tài)分子團，這是一個新的具有高強度熒光的穩(wěn)定螯合物，它在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，信號的增強效果可達上萬倍，該技術(shù)使用了解離增強步驟，并且采用了前后兩種不同的螯合劑，前一種用于Eu3+與抗體標記，后一種用于與解離下來的Eu3+螯合成新的強熒光發(fā)射分子，因此，又將該技術(shù)稱為解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖?dissociation-enhancedlanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)

（三）解離增強原理：增強液(enhancements76autoDELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)autoDELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)77

1.TRFIA分析用的酸性增強液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污染，使本底升高，所用試劑和器材應(yīng)盡量防塵。

2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動裝置，但不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應(yīng)選擇應(yīng)用。

（四）注意事項（四）注意事項78

熒光偏振免疫測定(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)，為一種均相熒光免疫測定方法，其利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光，該熒光強度與熒光標記物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小呈反比，常采用抗原-抗體競爭反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。

二、熒光偏振免疫分析儀熒光偏振免疫測定(fluorescencepolari79光的本質(zhì)是電滋波，光是各個方向電滋波的混合物，當(dāng)光線通過偏振濾光片后，形成只有一個方向的電滋波，稱之為偏振光。熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光（藍色光，485nm）激發(fā)后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，在其恢復(fù)至基態(tài)時，釋放能量并發(fā)射出單一平面的偏振熒光（綠色光，525nm～550nm）。偏振熒光強度與熒光物質(zhì)分子在液相中轉(zhuǎn)動的速度呈反比，即分子大轉(zhuǎn)動速度慢，熒光強度大，分子小轉(zhuǎn)動速度快，熒光強度小。

(一)

原理光的本質(zhì)是電滋波，光是各個方向電滋波的混合物，當(dāng)光線通過偏80偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖熒光偏振免疫測定工作原理示意圖偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖熒光偏振免疫測定工作原理示意圖81

1.抗原抗體反應(yīng)

2.偏振熒光強度測定（二）儀器測定技術(shù)要點1.抗原抗體反應(yīng)（二）儀器測定技術(shù)要點82

1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對分子量和復(fù)合物的特性等因素。

2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標本進行預(yù)處理，除去干擾成分。

（三）注意事項1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的83第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)

根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動酶免分析儀分成二類，一類為分體機，一類為連體機。分體機是由“前處理系統(tǒng)”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，使用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動進行。

第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系84（一）儀器組成和性能

1.條形碼識別系統(tǒng)

2.樣本架和加樣系統(tǒng)

3.試劑架

4.溫育系統(tǒng)

（一）儀器組成和性能1.條形碼識別系統(tǒng)85

5.液路系統(tǒng)

6.洗板系統(tǒng)

7.酶標板讀數(shù)儀

8.自動裝載傳遞系統(tǒng)

9.計算機管理和信息系統(tǒng)

5.液路系統(tǒng)86全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析儀聯(lián)合起來，工作速度快，自動化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機，由于它有一個獨立的全自動樣本處理站，加樣速度快，適合試驗項目變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。（二）儀器評價全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析87采用流水線式操作采用流水線式操作88加樣加樣89洗板洗板901.什么是免疫檢驗自動化？應(yīng)用哪些技術(shù)？優(yōu)點是什么？2.免疫濁度分析的原理是什么？有哪些臨床應(yīng)用？3.免疫膠乳比濁法和免疫散射比濁法的原理是什么？4.定時散射比濁法和速率散射比濁法的測定原理，其抗原過量檢測有什么不同點？5.免疫比濁分析的影響因素有哪些？6.吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀技術(shù)要點是什么？7.酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀的原理，有哪幾種類型？各有什么特點？8.電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定的技術(shù)要點是什么？9.時間分辨熒光免疫分析儀測定的技術(shù)要點是什么？注意事項有哪些？10.全自動酶免分析儀的組成成分有哪些？優(yōu)點是什么？

思考題思考題91免疫檢驗自動化是將免疫檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報告和儀器清洗等步驟由計算機控制，儀器自動化進行。定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，在抗原抗體反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動大，所獲取的信號不穩(wěn)定，定時散射比濁法避開這一階段，專門測定抗原抗體反應(yīng)的最佳時段，使檢測誤差降到最低。

小結(jié)免疫檢驗自動化是將免疫檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、92吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或抗原，以磁性微粒為固相載體的一種免疫分析法，吖啶酯發(fā)光只需加入氧化劑和pH糾正液，不需要酶催化。酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強弱來進行定量。

免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)93時間分辨熒光免疫分析儀是用鑭系元素標記抗原或抗體作為示蹤物，與時間分辨測定技術(shù)結(jié)合而制造出來的一種自動化分析儀。熒光偏振免疫測定是一種均相熒光免疫測定法，常采用抗原抗體競爭反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。全自動酶聯(lián)免疫分析儀是由多個模塊組成，用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、酶標板讀數(shù)和結(jié)果打印自動化。其結(jié)果是減輕了勞動強度，縮短了試驗時間，提高了工作效率，為全面實現(xiàn)實驗室自動化打下了基礎(chǔ)。

免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)945、世上最美好的事是：我已經(jīng)長大，父母還未老;我有能力報答，父母仍然健康。

6、沒什么可怕的，大家都一樣，在試探中不斷前行。

7、時間就像一張網(wǎng)，你撒在哪里，你的收獲就在哪里。紐扣第一顆就扣錯了，可你扣到最后一顆才發(fā)現(xiàn)。有些事一開始就是錯的，可只有到最后才不得不承認。

8、世上的事，只要肯用心去學(xué)，沒有一件是太晚的。要始終保持敬畏之心，對陽光，對美，對痛楚。

9、別再去抱怨身邊人善變，多懂一些道理，明白一些事理，畢竟每個人都是越活越現(xiàn)實。

10、山有封頂，還有彼岸，慢慢長途，終有回轉(zhuǎn)，余味苦澀，終有回甘。

11、人生就像是一個馬爾可夫鏈，你的未來取決于你當(dāng)下正在做的事，而無關(guān)于過去做完的事。

12、女人，要么有美貌，要么有智慧，如果兩者你都不占絕對優(yōu)勢，那你就選擇善良。

13、時間，抓住了就是黃金，虛度了就是流水。理想，努力了才叫夢想，放棄了那只是妄想。努力，雖然未必會收獲，但放棄，就一定一無所獲。

14、一個人的知識，通過學(xué)習(xí)可以得到;一個人的成長，就必須通過磨練。若是自己沒有盡力，就沒有資格批評別人不用心。開口抱怨很容易，但是閉嘴努力的人更加值得尊敬。

15、如果沒有人為你遮風(fēng)擋雨，那就學(xué)會自己披荊斬棘，面對一切，用倔強的驕傲，活出無人能及的精彩。5、人生每天都要笑，生活的下一秒發(fā)生什么，我們誰也不知道。所以，放下心里的糾結(jié)，放下腦中的煩惱，放下生活的不愉快，活在當(dāng)下。人生喜怒哀樂，百般形態(tài)，不如在心里全部淡然處之，輕輕一笑，讓心更自在，生命更恒久。積極者相信只有推動自己才能推動世界，只要推動自己就能推動世界。

6、人性本善，純?nèi)缜逑魉冬摖q。欲望與情緒如風(fēng)沙襲擾，把原本如天空曠蔚藍的心蒙蔽。但我知道，每個人的心靈深處，不管烏云密布還是陰淤蒼茫，但依然有一道彩虹，亮麗于心中某處。

7、每個人的心里，都藏著一個了不起的自己，只要你不頹廢，不消極，一直悄悄醞釀著樂觀，培養(yǎng)著豁達，堅持著善良，只要在路上，就沒有到達不了的遠方！

8、不要活在別人眼中，更不要活在別人嘴中。世界不會因為你的抱怨不滿而為你改變，你能做到的只有改變你自己！

9、欲戴王冠，必承其重。哪有什么好命天賜，不都是一路披荊斬棘才換來的。

10、放手如拔牙。牙被拔掉的那一刻，你會覺得解脫。但舌頭總會不由自主地往那個空空的牙洞里舔，一天數(shù)次。不痛了不代表你能完全無視，留下的那個空缺永遠都在，偶爾甚至?xí)惓炷?。適應(yīng)是需要時間的，但牙總是要拔，因為太痛，所以終歸還是要放手，隨它去。

11、這個世界其實很公平，你想要比別人強，你就必須去做別人不想做的事，你想要過更好的生活，你就必須去承受更多的困難，承受別人不能承受的壓力。

12、逆境給人寶貴的磨煉機會。只有經(jīng)得起環(huán)境考驗的人，才能算是真正的強者。自古以來的偉人，大多是抱著不屈不撓的精神，從逆境中掙扎奮斗過來的。

13、不同的人生，有不同的幸福。去發(fā)現(xiàn)你所擁有幸運，少抱怨上蒼的不公，把握屬于自己的幸福。你，我，我們大家都可以經(jīng)歷幸福的人生。

14、給自己一份堅強，擦干眼淚；給自己一份自信，不卑不亢；給自己一份灑脫，悠然前行。輕輕品，靜靜藏。為了看陽光，我來到這世上；為了與陽光同行，我笑對憂傷。

15、總不能流血就喊痛，怕黑就開燈，想念就聯(lián)系，疲憊就放空，被孤立就討好，脆弱就想家，不要被現(xiàn)在而蒙蔽雙眼，終究是要長大，最漆黑的那段路終要自己走完。5、從來不跌倒不算光彩，每次跌倒后能再站起來，才是最大的榮耀。

6、這個世界到處充滿著不公平，我們能做的不僅僅是接受，還要試著做一些反抗。

7、一個最困苦、最卑賤、最為命運所屈辱的人，只要還抱有希望，便無所怨懼。

8、有些人，因為陪你走的時間長了，你便淡然了，其實是他們給你撐起了生命的天空；有些人，分開了，就忘了吧，殘缺是一種大美。

9、照自己的意思去理解自己，不要小看自己，被別人的意見引入歧途。

10、沒人能讓我輸，除非我不想贏！

11、花開不是為了花落，而是為了開的更加燦爛。

12、隨隨便便浪費的時間，再也不能贏回來。

13、不管從什么時候開始，重要的是開始以后不要停止；不管在什么時候結(jié)束，重要的是結(jié)束以后不要后悔。

14、當(dāng)你決定堅持一件事情，全世界都會為你讓路。

15、只有在開水里，茶葉才能展開生命濃郁的香氣。5、世上最美好的事是：我已經(jīng)長大，父母還未老;我有能力報答，95第二十章免疫檢驗自動化儀器分析第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)一、免疫透射比濁法二、免疫膠乳比濁法三、免疫散射比濁法四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用第二十章第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)96第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)第二節(jié)自動化發(fā)光免疫分析系統(tǒng)一、吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀四、在臨床免疫檢測中的應(yīng)用第三節(jié)自動化熒光免疫分析系統(tǒng)一、時間分辨熒光免疫分析儀二、熒光偏振免疫分析儀思考題小結(jié)第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)第二節(jié)自動化發(fā)光免疫分析系97免疫檢驗自動化

（automationofimmunoassays)

是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進行。免疫檢驗自動化（automationofimmuno98第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)免疫濁度分析的基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

第一節(jié)自動化免疫濁度分析系統(tǒng)免疫濁度分析的基本原理是99一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標準品比較，可確定標本中抗原含量。一、免疫透射比濁法（一）原理：一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，被其中的免疫100免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)1011.將待檢標本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）儀器工作過程2.將待測標本和標準抗原溶液（5個濃度抗原標準品）與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測定各管吸光度。

3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。1.將待檢標本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）儀器工作過程102（三）方法評價

優(yōu)點:靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準確

不足:

①抗體用量較大；②溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大③透射比濁測定在抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測需在抗原抗體反應(yīng)達到平衡后進行，耗時較長。

（三）方法評價優(yōu)點:不足:103用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強。

二、免疫膠乳比濁法（一）原理：用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm104（二）方法評價

本法敏感度大大高于普通比濁法，可達ng/L水平，操作簡便，易自動化；血清中的類風(fēng)濕因子(RF)可與IgGFc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會嚴重影響結(jié)果。（二）方法評價本法敏感度大大高于普通比濁法，可105粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：三、免疫散射比濁法(一)原理粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微106

式Iθ中為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的波長和強度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4式Iθ中為與入射光成θ角處散射光強度；λ和I0為入射光的107免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)108定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時段進行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。(二)定時散射比濁法（fixedtimenephelometry）定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反1091.儀器測定技術(shù)要點

(1)抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段(2)反應(yīng)階段(3)信號檢測1.儀器測定技術(shù)要點(1)抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段110

2.抗原過量檢測

(1)抗體適當(dāng)過量

(2)對抗原過量進行閾值限定2.抗原過量檢測(1)抗體適當(dāng)過量111定時散射比濁法測定原理示意圖定時散射比濁法測定原理示意圖112BNProSpec全自動特定蛋白分析儀BNProSpec全自動特定蛋白分析儀113速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1～2min即可完成。

(三)速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是114儀器測定技術(shù)要點

開啟機器，進行定標反應(yīng)階段抗原過量檢測儀器測定技術(shù)要點開啟機器，進行定標115抗原抗體復(fù)合物形成的速率

累計時間（s）形成IC總量速率累計時間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

20抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計時間（s）形成IC總量116抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化117免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)118免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)119免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)120IMMAGE全自動特定蛋白分析儀IMMAGE全自動特定蛋白分析儀121(三)方法評價散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精密等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴,對抗體的質(zhì)量要求很高。(三)方法評價散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法122

1.抗原抗體比例

2.抗體的質(zhì)量

3.增濁劑的使用

（一）免疫比濁分析的影響因素四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用1.抗原抗體比例（一）免疫比濁分析的影響因素四、免疫比1234.偽濁度5.入射光光源和波長6.結(jié)果報告中的計量單位7.標準曲線制備與質(zhì)量控制

4.偽濁度124（二）臨床應(yīng)用

免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。

（二）臨床應(yīng)用免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白125

第二節(jié)自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

自動化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反應(yīng)系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)和計算機數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。

第二節(jié)自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

自動化發(fā)光免疫分析儀主要126吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結(jié)合法等相同。

一、吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或127免疫檢驗自動化儀器分析課件(-)128YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY順磁性微粒示意圖

磁微粒技術(shù)

磁微粒在電磁場中分離磁微粒標記抗體YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY129發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后雙抗體夾心法直接化學(xué)發(fā)光的機理（1）加入酸性H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYY130儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合洗滌、分離加入氧化劑發(fā)光信號檢測

儀器測定技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合131

吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖132ACS：180SE和ACS∶CENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ACS：180SEACS∶CENTAURACS：180SE和ACS∶CENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析133ci8200i2000srci8200i2000sr134

酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強弱來進行被測物的定量。常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。

二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀

酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的135該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用增強劑使化學(xué)發(fā)光強度增加、時間延長。

㈠辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體、以塑料錐136魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生物（激發(fā)態(tài)）。它以光量子輻射形式返回基態(tài)時，發(fā)出微綠色可見光。魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生137魯米諾增強化學(xué)發(fā)光的原理魯米諾增強化學(xué)發(fā)光的原理138辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖

辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖139VitrosECi全自動增強化學(xué)發(fā)光酶免分析儀VitrosECi全自動增強化學(xué)發(fā)光酶免分析儀140

㈡堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

該儀器是以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以

順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)

光劑進行測定的自動化儀器。

㈡堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器是以堿141AMPPD發(fā)光反應(yīng)原理示意圖

AMPPD發(fā)光反應(yīng)原理示意圖142抗原抗體結(jié)合洗滌、分離加入AMPPD發(fā)光劑信號檢測

儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合儀器測定技術(shù)要點143堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖

堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖144Access全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Access全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀145UniCel?DxI800UniCel?DxI800146IMMULITE2000型全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)IMMULITE2000型全自動酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)147（三）堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀

該儀器以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原），以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團，形成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。（三）堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀該儀器以堿1484-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應(yīng)原理示意圖

4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應(yīng)原理示意圖149儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合洗滌、分離加入底物4-MUP信號檢測儀器測定技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合150堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫測定示意圖堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫測定示意圖151AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀152AIA-1800型全自動酶標記熒光免疫分析儀AIA-1800型全自動酶標記熒光免疫分析儀153

電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)吡啶釕標記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設(shè)計的一種自動化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時間長，易于控制并可根據(jù)待測分子的大小設(shè)計成多種反應(yīng)模式如夾心法、競爭法等。

三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)154三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+分子結(jié)構(gòu)圖三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+分子結(jié)構(gòu)圖155電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反應(yīng)原理

電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反應(yīng)原理156磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應(yīng)體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分離。磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體157儀器測定技術(shù)要點

抗原抗體結(jié)合電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)光信號檢測檢測完畢

儀器測定技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合158電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖159電化學(xué)發(fā)光免疫測定工作示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定工作示意圖160標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖161ELECSYS2010型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ELECSYS2010型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀162ModularAnalyticsE模塊170型ModularAnalyticsE模塊170型163

可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標和貧血類等方面的檢測，是目前免疫化學(xué)應(yīng)用最為廣泛的新技術(shù)。

四、在臨床免疫檢測中的應(yīng)用可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物164第三節(jié)自動化熒光免疫分析系統(tǒng)

熒光免疫自動化分析主要是將抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計算機技術(shù)有機結(jié)合的一項自動化免疫分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。

第三節(jié)自動化熒光免疫分析系統(tǒng)熒光免疫自動化分析165

時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay,TRFIA）是以鑭系元素標記抗原或抗體作為示蹤物，并與時間分辨測定技術(shù)相結(jié)合，建立起來的一種新型非放射性微量分析技術(shù)，具有靈敏度高，鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，標準曲線范圍寬等特點，已在臨床實驗室廣泛使用。

一、時間分辨熒光免疫分析儀時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedflu166Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移

（一）、原理Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移（一）167時間分辨Eu3+元素?zé)晒庑盘枩y量示意圖

時間分辨Eu3+元素?zé)晒庑盘枩y量示意圖168（二）儀器測定技術(shù)要點

⒈抗原抗體結(jié)合⒉加入Eu3+螯合抗體⒊加入酸性增強液

4.信號檢測

（二）儀器測定技術(shù)要點⒈抗原抗體結(jié)合169固相雙抗體夾心TRFIA檢測過程示意圖

固相雙抗體夾心TRFIA檢測過程示意圖170增強液(enhancementsolution)，使Eu3+抗體－抗原復(fù)合物的PH值降低至2~3，以利于Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來，游離的Eu3+為增強液中的另一種螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等其它成分的作用下，與增強液中的β-二酮體生成一個Eu3+在其內(nèi)部的保護性膠態(tài)分子團，這是一個新的具有高強度熒光的穩(wěn)定螯合物，它在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，信號的增強效果可達上萬倍，該技術(shù)使用了解離增強步驟，并且采用了前后兩種不同的螯合劑，前一種用于Eu3+與抗體標記，后一種用于與解離下來的Eu3+螯合成新的強熒光發(fā)射分子，因此，又將該技術(shù)稱為解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖?dissociation-enhancedlanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)

（三）解離增強原理：增強液(enhancements171autoDELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)autoDELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)172

1.TRFIA分析用的酸性增強液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污染，使本底升高，所用試劑和器材應(yīng)盡量防塵。

2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動裝置，但不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應(yīng)選擇應(yīng)用。

（四）注意事項（四）注意事項173

熒光偏振免疫測定(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)，為一種均相熒光免疫測定方法，其利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光，該熒光強度與熒光標記物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小呈反比，常采用抗原-抗體競爭反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。

二、熒光偏振免疫分析儀熒光偏振免疫測定(fluorescencepolari174光的本質(zhì)是電滋波，光是各個方向電滋波的混合物，當(dāng)光線通過偏振濾光片后，形成只有一個方向的電滋波，稱之為偏振光。熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光（藍色光，485nm）激發(fā)后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，在其恢復(fù)至基態(tài)時，釋放能量并發(fā)射出單一平面的偏振熒光（綠色光，525nm～550nm）。偏振熒光強度與熒光物質(zhì)分子在液相中轉(zhuǎn)動的速度呈反比，即分子大轉(zhuǎn)動速度慢，熒光強度大，分子小轉(zhuǎn)動速度快，熒光強度小。

(一)

原理光的本質(zhì)是電滋波，光是各個方向電滋波的混合物，當(dāng)光線通過偏175偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖熒光偏振免疫測定工作原理示意圖偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖熒光偏振免疫測定工作原理示意圖176

1.抗原抗體反應(yīng)

2.偏振熒光強度測定（二）儀器測定技術(shù)要點1.抗原抗體反應(yīng)（二）儀器測定技術(shù)要點177

1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對分子量和復(fù)合物的特性等因素。

2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標本進行預(yù)處理，除去干擾成分。

（三）注意事項1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的178第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)

根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動酶免分析儀分成二類，一類為分體機，一類為連體機。分體機是由“前處理系統(tǒng)”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，使用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動進行。

第四節(jié)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系179（一）儀器組成和性能

1.條形碼識別系統(tǒng)

2.樣本架和加樣系統(tǒng)

3.試劑架

4.溫育系統(tǒng)

（一）儀器組成和性能1.條形碼識別系統(tǒng)180

5.液路系統(tǒng)

6.洗板系統(tǒng)

7.酶標板讀數(shù)儀

8.自動裝載傳遞系統(tǒng)

9.計算機管理和信息系統(tǒng)

5.液路系統(tǒng)181全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析儀聯(lián)合起來，工作速度快，自動化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機，由于它有一個獨立的全自動樣本處理站，加樣速度快，適合試驗項目變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。（二）儀器評價全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析182采用流水線式操作采用流水線式操作183加樣加樣184洗板洗板1851.什么是免疫檢驗自動化？應(yīng)用哪些技術(shù)？優(yōu)點是什么？2.免疫濁度分析的原理是什么？有哪些臨床應(yīng)用？3.免疫膠乳比濁法和免疫散射比濁法的原理是什么？4.定時散射比濁法和速率散射比濁法的測定原理，其抗原過量檢測有什么不同點？5.免疫比濁分析的影響因素有哪些？6.吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀技術(shù)要點是什么？7.酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀的原理，有哪幾種類型？各有什么特點？8.電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定的技術(shù)要點是什么？9.時間分辨熒光免疫分析儀測定的技術(shù)要點是什么？注意事項有哪些？10.全自動酶免分析儀的組成成分有哪些？優(yōu)點是什么？

思考題思考題186免疫檢驗自動化是將免疫檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信