生物化學(xué)-2017核酸雜交

分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)在分子水平上

命現(xiàn)象的科學(xué)生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生等方面來(lái)闡明各種生命現(xiàn)象并加以應(yīng)用（疾?。┘夹g(shù)解決問(wèn)題的方法及其原理生物大分子（

）獲取與鑒定技術(shù)核酸與蛋白質(zhì)分離純化、文庫(kù)、、分子雜交的擴(kuò)增（DNA克隆-重組DNA，PCR)高通量（

）功能研究技術(shù)超表達(dá)，觀察表型、RNAi干擾技術(shù)生物大分子相互作用（酵母雙雜交、CHIP、EMSA)蛋白表達(dá)與抗體蛋白在細(xì)胞中的定位編輯技術(shù)（crispr/cas9，NgAgo-gDNA？）應(yīng)用與

治療生物分子（核酸）雜交技術(shù)

Nucleic

acidhybridization內(nèi)容分子雜交概述核酸探針雜交信號(hào)的檢測(cè)核酸分子雜交的類(lèi)型核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)的影響因素與優(yōu)化技術(shù)第一節(jié)分子雜交概述加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性變性是指某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來(lái),形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱(chēng)DNA復(fù)性,也叫退火。復(fù)習(xí)DNA變性的方法：熱變性：溫度升高到90~100℃酸堿變性：pH值低于3或高于10化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、等變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加（增色效應(yīng)）復(fù)習(xí)增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。DNA解鏈時(shí)的紫外吸收變化復(fù)習(xí)DNA的解鏈曲線(溶解曲線)連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度相對(duì)于

A260值作圖，所得的曲線稱(chēng)為解鏈曲線解鏈溫度(meltingtemperature，Tm)解鏈過(guò)程中，紫外吸光度的變化達(dá)到最大變化值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。復(fù)習(xí)影響Tm值的因素：Tm不是一個(gè)固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：外部因素：pH、離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。因素：DNA的堿基比例、DNA的均一性；在相同條件下，DNA內(nèi)G-C配對(duì)含量高，其Tm值也高。復(fù)習(xí)復(fù)性過(guò)程單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈局部雙鏈周?chē)膲A基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離局部雙鏈周?chē)膲A基如配對(duì)，則形成中心序列形成完整的雙鏈分子影響復(fù)性速度的因素DNA濃度段的大小DN溫度溶液的離子強(qiáng)度DNA順序的復(fù)雜性核酸的分子雜交將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱(chēng)為雜種核酸分子。雜化雙鏈

(heteroduplex)核酸分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下

按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。

雜交的雙方是待測(cè)核酸（目的

）和已知核酸序列，已知核酸序列稱(chēng)探針。探針(序列已知，單鏈)待測(cè)核苷酸序列(單鏈)核酸分子雜交技術(shù)1961年,Hall等-------液相雜交探針與靶序列在溶液中雜交，通過(guò)平衡密度梯度離心分離雜交體1962年,Bolton等設(shè)計(jì)了第一種簡(jiǎn)單的固相雜交方法，稱(chēng)為DNA-瓊脂技術(shù)。變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復(fù)性，但能與其它互補(bǔ)核酸序列雜交。用放射性標(biāo)記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過(guò)夜，然后將膠置于柱中進(jìn)行漂洗，去除游離探針，在高溫、低鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展歷程核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展歷程組60年代末，Britten等設(shè)計(jì)了另一種分析細(xì)胞的方法。從不同生物體（細(xì)菌、酵母等）內(nèi)分離DNA，用水壓器剪切成長(zhǎng)約450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60℃，在此溫度孵育過(guò)程中，測(cè)定溶液一定時(shí)間內(nèi)的UV260nm的吸光度（減色效應(yīng)）來(lái)監(jiān)測(cè)互補(bǔ)鏈的復(fù)性程度。第二節(jié)核酸探針（Probe）探針從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。探針技能，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)其它分子進(jìn)行檢測(cè)的一種技能含標(biāo)記物的分子-----探針用放射性核素、生物素或熒光

標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱(chēng)為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。核酸探針技術(shù)DNA探針最常用，長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的單鏈或雙鏈DNA組DNA探針：如

DNAcDNA探針：互補(bǔ)于mRNA的DNA分子,最常用寡核苷酸探針：10-50bp，

、點(diǎn)突變RNA探針特異性強(qiáng)，但RNA極易降解，不宜操作核酸探針的種類(lèi)DNA探針的特點(diǎn)：探針多已克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，

方法簡(jiǎn)便。不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。能用于同位素和非同位素標(biāo)記。DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等探針標(biāo)記標(biāo)記物是什么？怎樣加上去？（探針標(biāo)記法）如何檢測(cè)雜交信號(hào)檢測(cè)探針標(biāo)記物理想探針標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：高度靈敏性不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì)對(duì)酶促反應(yīng)活性無(wú)影響或影響不大檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物放射性標(biāo)記物----放射性核素放射性核素能產(chǎn)生射線,將核素標(biāo)記在核酸所必需的NTP或dNTP上，通過(guò)一定方法摻入到DNA或RNA中去制成探針，與待測(cè)的核酸雜交后，核素產(chǎn)生的或射線可使底片感光的特性，通過(guò)放射自顯影的方法進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)生射線的核素：32P、3H、35S,如：[32P]dATP產(chǎn)生射線的核素：125I常用的放射性核素32P：產(chǎn)生射線，靈敏度高，分辨率強(qiáng)，是最常用的放射性標(biāo)記物，但半衰期短（14.3天），位和位標(biāo)記。35S：分辨率高、半衰期長(zhǎng)（87.1天），敏感度低放射性標(biāo)記物的缺點(diǎn)放射性污染成本高：半衰期短，不能長(zhǎng)期保存半抗原：地高辛配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫

酸熒光素、

等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光常用的非放射性標(biāo)記物地高辛甙元又稱(chēng)異羥基洋地黃毒甙元，是一種類(lèi)固醇半抗原分子采用人工方法可以將地高辛的線型間隔臂與dUTP連接起來(lái),形成DIG-11-dUTPDIG-11-dUTP-----通過(guò)一定方法摻入到DNA中去制成探針----雜交----加抗地高辛-酶的復(fù)合物----加底物顯色靈敏度較高：0.1pg特異性較生物素高是較理想的非放射性標(biāo)記物地高辛甙元生物素：1-2pg生物素化核苷酸----通過(guò)酶觸反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針----雜交----生物素-抗生物素蛋白-酶的復(fù)合物----加底物顯色生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP光敏生物素：生物素與光敏基團(tuán)結(jié)合----光敏生物素-----光敏生物素與核酸探針混合----在強(qiáng)光的作用下----光敏基團(tuán)與核酸共價(jià)結(jié)合---生物素標(biāo)記的探針生物素化的核苷酸和光敏生物素生物素光敏基團(tuán)優(yōu)點(diǎn)無(wú)放射性污染成本低、操作簡(jiǎn)單缺點(diǎn)敏感性、特異性均低于放射性核素非放射性標(biāo)記物探針標(biāo)記方法體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為代謝的底物，在細(xì)胞

代謝時(shí)使

核素?fù)饺氲叫?/p>

的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中探針體外標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法標(biāo)記物分子上的活性

與探針?lè)肿由系哪承?/p>

反應(yīng)，標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由厦复贅?biāo)記法標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸摻入到探針上探針的酶促標(biāo)記法缺口翻譯法（nick

translation）或切口平移隨機(jī)引物法（random

priming)末端標(biāo)記法(end-labeling)其他PCR標(biāo)記法cDNA探針的標(biāo)記（反轉(zhuǎn)錄

單鏈cDNA探針）RNA探針的標(biāo)記（體外轉(zhuǎn)錄的方法）小片段323個(gè)氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個(gè)氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N

端C

端木瓜蛋白酶DNA-pol

ⅠKlenow片段是

DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。切口平移法（nicktranslation)利用DNase

I在DNA雙鏈上造成單鏈切口利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，

新的DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中缺口平移法的特點(diǎn)快速、簡(jiǎn)便、標(biāo)記的探針均一、特異性高僅適用于較長(zhǎng)的雙連DNADNA多聚酶必須是E.ColiDNA多聚酶的全酶DNA酶I的濃度一定要適宜隨機(jī)引物法（random priming

)原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為新鏈的引物，在DNA聚合酶E.coli

DNA聚合酶I的Klenow大片段的催化下，按53方向

一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補(bǔ)。時(shí)，帶標(biāo)記的核苷酸摻入到新

的DNA分子中隨機(jī)引物法的特點(diǎn)：能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記操作簡(jiǎn)單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來(lái)的一系列問(wèn)題標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/μgDNA以上可直接在低

瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記末端標(biāo)記法將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的3’末端或5’末端的一類(lèi)標(biāo)記法，可分為5’末端標(biāo)記法3’末端標(biāo)記法T4聚合酶替代法5’末端標(biāo)記法最常用的標(biāo)記物是[γ32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶能特異地將[γ32P]ATP中的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’—OH末端，而大多數(shù)DNA或RNA的5’端都因磷酸化而含有磷酸基團(tuán)。因此標(biāo)記前要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團(tuán)。末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal

deoxynucleotidyl

traferase，TdT)催化標(biāo)記的dNTP加到單鏈或雙鏈DNA的3’末端上3’末端標(biāo)記法T4聚合酶替代法：在缺乏核苷酸的情況下，利用DNA聚合酶從3’→5’端對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行水解，產(chǎn)生帶凹缺的3’端DNA分子，加入4種核苷酸，DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性受抑，在5’→3’聚合酶活性的作

用下，DNA分子開(kāi)始修復(fù)，帶有標(biāo)記的核苷酸就摻人到修復(fù)的3’端片段中。探針的純化乙醇沉淀法無(wú)水乙醇可以沉淀DN段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾柱層析法利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是

Sephadex

G-50微柱離心法其原理與上述凝膠過(guò)濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來(lái)純化探針第三節(jié)雜交信號(hào)檢測(cè)放射性核素探針的檢測(cè)放射自顯影利用放射線在X線片上成影作用來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)，稱(chēng)為放射自顯影。放射性同位素所發(fā)射出來(lái)的帶電離子(β粒子)作用于感

光材料的鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，這種潛影可用顯影液顯示，成為可見(jiàn)的"像"非放射性核素探針的檢測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)顯色反應(yīng)非放射性核素探針的檢測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)半抗原——通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)與顯色體系偶聯(lián)。地高辛-抗地高辛-酶的復(fù)合物配體——親和法與顯色體系偶聯(lián)：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-plex

，ABC）顯色反應(yīng)：通過(guò)連接在抗體或生物素蛋白的顯色物質(zhì)如酶、熒光素等進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。酶學(xué)檢測(cè)：酶促反應(yīng)使底物形成有色產(chǎn)物。最常用辣根過(guò)氧化物酶（

HRP

）堿性磷酸酶（AKP

）酸性磷酸酶β–半乳糖苷酶AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優(yōu)點(diǎn)為價(jià)廉、穩(wěn)定。地高辛標(biāo)記探針的檢測(cè)抗地高辛抗體－堿性磷酸酶復(fù)合物＋底物（BCIP+NBT)紫色的不溶性化合物生物素標(biāo)記探針的檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶＋

底物（ＤＡＢ）抗生物素蛋白生物素棕褐色不溶性的化合物顯色反應(yīng)：熒光檢測(cè)：異硫

酸熒光素（FITC）和

，可被紫外線激發(fā)出熒光而被檢測(cè)到。主要應(yīng)用于原位雜交?；瘜W(xué)發(fā)光法：在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中伴隨的發(fā)光反應(yīng)。目前常用的是（

HRP）催化

（luminol）伴隨的發(fā)光反應(yīng)。適合于Southern、Northern及斑點(diǎn)雜交。電子密度標(biāo)記：利用重金屬的高電子密度、在電子顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)，適合于細(xì)胞原位雜交。第四節(jié)核酸分子雜交類(lèi)型按核酸分子雜交環(huán)境大致分為:液相雜交待測(cè)核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交分子的過(guò)程。雜交后過(guò)量的未雜交探針在溶液中除去較為和誤差較高。RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法固相雜交---最常用固相雜交：根據(jù)支持物的不同又可分為：濾膜雜交（印跡雜交）Southern

印跡法Northern

印跡法Western

印跡法斑點(diǎn)雜交菌落原位雜交組織原位雜交理想的固相支持物（濾膜）應(yīng)具備的特性具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力不影響與探針的雜交反應(yīng)與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固具有良好的機(jī)械性能非特異吸附少常用的濾膜硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)（在高離子強(qiáng)度下，單連DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2）雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高化學(xué)活化膜：段有同等優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同大小的DN結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較上述兩種膜低大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過(guò)毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”上去的，這一技術(shù)類(lèi)似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱(chēng)之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。印跡雜交技術(shù)印跡雜交操作基本流程印跡轉(zhuǎn)移將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上雜交將具有核酸印跡的濾膜與帶有標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交Southern

blottingDNA印跡與雜交1975年，英國(guó)Edwen

Southern創(chuàng)建定義：檢測(cè)DNA雜交方法，即將DNA電泳分離、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測(cè)的方

法。應(yīng)用：

組DNA的定性和定量分析、

診斷、分子克隆、法醫(yī)學(xué)等Southern

blotting的主要步驟（8步）待測(cè)DNA樣品的

、酶切待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜(印跡)：毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針Southern雜交(預(yù)雜交、雜交)洗膜（除去游離探針）雜交信號(hào)檢測(cè)標(biāo)記的探針1、待測(cè)DNA樣品的

、酶切DNA的提取原理：裂解細(xì)胞，使DNA

，交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，有效去除蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)程序：酚——酚-氯仿——氯仿。步驟解析2.待測(cè)DNA樣品的電泳分離瓊脂糖凝膠電泳3.凝膠中DNA的變性：堿變性凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。4.Southern轉(zhuǎn)膜(印跡)待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（如纖維素膜）上，即印跡。Southern印跡的常用方法（1）毛細(xì)管虹吸印跡法其基本原理是：利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DN

段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DN 段移出凝膠而滯留在膜上。重物玻璃板吸水紙濾紙凝膠鹽橋毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法（

Southern轉(zhuǎn)?。?）電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移快（3）真空轉(zhuǎn)移法此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。較毛細(xì)管虹轉(zhuǎn)移更為有效，快捷各種轉(zhuǎn)移方法的比較毛細(xì)管虹吸法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。電轉(zhuǎn)移法效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。真空轉(zhuǎn)移法效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。6、Southern雜交預(yù)雜交：固相膜可結(jié)合DNA,包括探針

封閉固相膜上多余的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液（常用非特異性DNA或蛋白質(zhì)）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交5.

探針建立雜交條件需要考慮的因素離子強(qiáng)度：一般，探針長(zhǎng)500bp，G+C含量為５０％，離子強(qiáng)度為５x

SSC；雜交液中不含甲酰胺，Tm值為93.4Ｃ，雜交溫度68

Ｃ，含甲酰胺，Tm值為68.4

Ｃ，雜交溫度42.4

Ｃ雜交溫度：雜交反應(yīng)在低于Tm值15-25

Ｃ溫度下進(jìn)行減少非特異性雜交反應(yīng)：預(yù)雜交7.洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的

DNA離子強(qiáng)度：0.1x

SCC洗膜溫度：低于

Tm值

5-12

C探針長(zhǎng)500bp，G+C含量42%,離子強(qiáng)度0.1xSSC,不含甲跣胺，Tm值為67Ｃ，則洗膜溫度為55-62

Ｃ.8.

雜交信號(hào)的檢測(cè)Northern印跡雜交Northernblot印跡雜交是指待測(cè)RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固-液相雜交?；驹砗突具^(guò)程與Southern

blot基本相同鑒別RNA探針可用DNA或RN

段待測(cè)樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)變性：>RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑（凝膠中加保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性轉(zhuǎn)膜