膜片鉗技術及應用

關于膜片鉗技術及應用第1頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術向細胞內(nèi)注射恒定或變化的電流刺激，紀錄由此引起的膜電位的變化，這叫做電流鉗技術。在具體實驗中，可通過給予細胞一系列電流脈沖刺激，誘發(fā)細胞產(chǎn)生動作電位。第2頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六

電壓鉗技術是通過向細胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流，從而將細胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反。因此它可以反映離子流的大小和方向。第3頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術膜片鉗技術與電流鉗、電壓鉗技術在命名上并不完全一致，后兩者是從電學概念的角度命名的，而“膜片鉗”主要是從機械物理學的角度命名的。第4頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術從字面上理解，膜片鉗技術鉗制的是“膜片”，是指采用尖端經(jīng)處理的微電極與細胞膜發(fā)生緊密接觸，使尖端下的這片細胞膜在電學上與其他細胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來。第5頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術所以，膜片鉗技術是一種通過微電極與細胞膜之間形成緊密接觸的方法，采用電壓鉗或電流鉗技術對生物膜上的離子通道的電活動進行記錄的微電極技術。膜片鉗技術是一種特殊的電壓鉗/電流鉗技術。第6頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面，使之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片面積為μm2量級，內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。然后對該膜片實行電壓鉗位，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA量級的電流，這種通道開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放和關閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布，并分析膜電位與離子濃度等之間的關系。第7頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗實驗系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺和屏蔽罩等。第8頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六倒置顯微鏡、防震臺、屏蔽罩、三維操縱儀三維操縱儀倒置顯微鏡第9頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗放大器第10頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗實驗流程膜片鉗實驗方法包括：制備玻璃微電極；制備細胞標本；建立高阻封接；電流記錄。第11頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六制備玻璃微電極拉制微電極材料：硼硅酸鹽毛細玻璃管。要求：玻璃毛胚外徑1.3~1.7㎜，內(nèi)徑1.0~1.2㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉制出的電極尖端管壁也越厚，電極的跨壁電容就越小，噪聲也就越低。第12頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六玻璃微電極及膜片的幾何形狀第13頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六電極拉制儀第14頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六拉制方法：兩步拉制法。第一步：使玻璃軟化，并拉開一個距離，形成一個細管，即拉制電極的頸部；第二步：使用較低的熱度，拉斷細管部，成為兩個基本相同的玻璃微電極，此步控制電極的尖端。一般拉制出的玻璃微電極尖端直徑為1~5μm。第15頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六涂膠和拋光對玻璃微電極進行涂膠和拋光。涂膠（疏水性涂料，如硅酮樹脂）主要是為了減小電極的跨壁電容。第16頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六拋光儀拋光是指將玻璃微電極靠近加熱的鉑絲，從而使電極尖端變光滑的過程。拋光主要目的是。防止電極尖端刺破細胞，利于高阻封接。第17頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六電極液的充灌對于尖端較細的玻璃微電極，膜片鉗實驗中常用的方法是：在微電極尾部施加負壓使尖端充灌電極內(nèi)液，然后用注射器在微電極尾部充灌電極內(nèi)液，最后輕彈微電極桿步使其內(nèi)的氣泡排出。充灌長度為電極的1/3。第18頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六制備細胞標本從理論上來講，膜片鉗實驗用的細胞標本可來自體內(nèi)各種組織細胞，只要細胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標本制備上，不同組織細胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機械分離以及清洗等步驟。第19頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六建立高阻封接在顯微鏡下找到微電極，移動三維操縱儀，使電極尖端接觸細胞，形成高阻封接。第20頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六建立高阻封接高阻封接形成是進行膜片鉗實驗的關鍵一步。微電極尖端與細胞膜形成封接的過程，可以采用軟件發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器上可見一直線。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六高阻封接形成的電流圖第22頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術四種基本記錄模式細胞吸附膜片(cell-attached

patch)將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上，形成高阻封接，在細胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制，高分辨測量膜電流，稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的完整性，第23頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六全細胞記錄法(Whole-cell

recording)

在高阻抗封接做好后，再給一個很小的負壓，將電極覆蓋的膜吸破，使電極內(nèi)與整個細胞內(nèi)相通，用這個方法可記錄進出整個細胞的電流。第24頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六內(nèi)面向外膜片(inside-out

patch)高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。第25頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六外面向外膜片（Outside-outpatch）在全胞記錄式的基礎上，拉開電極使之與胞體脫離，這是附在電極尖端的膜片又可自動地將電極尖端口封住。此膜片的外側面向外其是在全細胞記錄的基礎上改進而成。第26頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六膜片鉗技術的應用2008年，第二軍醫(yī)大學基礎部生物物理研究所的研究人員采用膜片鉗和激光掃描共聚焦顯微鏡，同步實時系統(tǒng)觀察心肌細胞鈣離子的釋放。第27頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六基本原理膜片鉗能獲得膜上鈣離子通道的離子電流，但不能對離子的移動進行實時定位，

不能定量分析離子濃度。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對鈣離子的移動進行實時定位,但無法對單個離子通道的離子移動信號(如單通道電流)進行分析。第28頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六大鼠心室肌細胞L2型鈣通道電流(ICa,L)第29頁，共31頁，2022年，5月20日，2點53分，星期六采用膜片鉗-激光掃描共聚焦顯微鏡同