試驗二細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察-海南大學(xué)課件

微生物學(xué)實驗海南大學(xué)海洋學(xué)院微生物學(xué)實驗海南大學(xué)海洋學(xué)院實驗一細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察實驗一一、實驗?zāi)康挠^察細(xì)菌的菌落特征掌握簡單染色法和細(xì)菌涂片方法在油鏡下觀察細(xì)菌個體的形態(tài)特征一、實驗?zāi)康挠^察細(xì)菌的菌落特征形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個體的形態(tài)觀察。細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等發(fā)生變化。細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長狀況、排列方式、好氣性和運動性直接相關(guān)。細(xì)菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。二、實驗的基本原理形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個體的形態(tài)觀察。二、實驗的基本原二、實驗的基本原理簡單染色法原理：細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷，用堿性染料（解離時帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等進行染色。采用加熱或化學(xué)固定兩種方法，使菌體粘附于玻片上，并且增加菌體對染料的親和力二、實驗的基本原理簡單染色法原理：細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷三、實驗材料顯微鏡（顯微鏡燈）、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。0.05%和0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液，0.5%番紅染液，中性紅染液，二甲苯，生理鹽水細(xì)菌三種形態(tài)的染色標(biāo)本。大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，哈氏弧菌和無乳鏈球菌24h液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。三、實驗材料顯微鏡（顯微鏡燈）、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、簡單染色法（一般染色法）１.菌種：牙垢細(xì)菌２.涂片３.干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。４固定５.染色：在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。６.水洗：傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。７干燥：空氣中自然干燥。８鏡檢：在油鏡下觀察牙垢中的各種細(xì)菌形態(tài)并繪圖。四、實驗步驟簡單染色法（一般染色法）１.菌種：牙垢細(xì)菌四、實驗步驟油鏡的使用

1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。2.調(diào)節(jié)光亮度

3.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)4.依次再進行中倍、高倍觀察

5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。

6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。7.用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。

四、實驗步驟油鏡的使用顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項：1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。5.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。四、實驗步驟顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項：細(xì)菌三種基本形態(tài)的觀察：

菌落形態(tài)觀察和個體形態(tài)觀察，這里主要指個體形態(tài)的觀察。

1.

結(jié)合油鏡的使用，觀察三張細(xì)菌染色片（球狀菌、桿狀菌、和螺旋狀菌），邊觀察邊繪圖。

2.

看示范鏡：觀察雙球菌、四聯(lián)球菌，并繪圖。四、實驗步驟細(xì)菌三種基本形態(tài)的觀察：四、實驗步驟思考題油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？使用油鏡時，為什么必須用鏡頭油？鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？思考題油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什實驗二細(xì)菌的革蘭氏染色實驗二一、實驗?zāi)康恼莆占?xì)菌的革蘭氏染色進一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)觀察和識別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造一、實驗?zāi)康恼莆占?xì)菌的革蘭氏染色細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成存在差異，因此不同細(xì)菌對革蘭氏染色有不同的反應(yīng)（陽性和陰性）：革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多脂類，肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，當(dāng)以95%酒精脫色時，脂類被溶解除去，使得細(xì)胞壁空隙變大，肽聚糖因95%酒精處理，其孔徑會縮小，但由于肽聚糖含量較少，細(xì)胞壁孔徑縮小有限，使得結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物被95%酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，并被隨后的紅色復(fù)染劑染成紅色；革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂類含量少，經(jīng)95%酒精脫色處理后，肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，使得結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物很難被95%酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色，呈現(xiàn)紫色。二、實驗的基本原理細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成存在差異，因此不同細(xì)菌對革蘭氏染色有不顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，吸水紙，染色缸等。染色劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液，盧（路）哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液。菌種：哈氏弧菌和鰻弧菌24h普通海水瓊脂斜面28℃培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌24h牛肉膏瓊脂斜面28℃培養(yǎng)物。三、實驗材料顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡革蘭氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.

鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。四、實驗步驟革蘭氏（Gram）染色法思考題要得到正確的革蘭氏染色結(jié)果必須注意哪些操作？關(guān)鍵在哪幾步？為什么？思考題要得到正確的革蘭氏染色結(jié)果必須注意哪些操作？關(guān)鍵在實驗三實驗室環(huán)境及人體表面的微生物檢查實驗三認(rèn)識細(xì)菌分布的廣泛性；

掌握對菌落識別；

懂得無菌操作的重要性。一、實驗?zāi)康恼J(rèn)識細(xì)菌分布的廣泛性；一、實驗?zāi)康拿恳痪w在適宜條件下，經(jīng)過多次細(xì)胞分裂可形成一個肉眼可見的子細(xì)胞集合體，稱為菌落。由于不同細(xì)菌其個體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理和生化等特征不同，當(dāng)一個菌體經(jīng)分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈現(xiàn)其固有的特點。通過合適的方法，將自然環(huán)境中的微生物接種到平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)后觀察平板上的菌落，就可以檢查環(huán)境中及人體細(xì)菌的數(shù)量和類型。二、實驗的基本原理每一菌體在適宜條件下，經(jīng)過多次細(xì)胞分裂可形成一個肉眼可見的子無菌試管，無菌吸管，無菌空培養(yǎng)皿，細(xì)菌計數(shù)器，蠟筆，玻片，消毒牙簽，酒精燈，接種環(huán)，無菌棉拭子等。瓊脂平板培養(yǎng)基，高層瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水，2％碘酒，75％乙醇，普通瓊脂平板，血瓊脂平板，革蘭氏染色劑。水樣，泥土，空氣和人體。三、實驗材料無菌試管，無菌吸管，無菌空培養(yǎng)皿，細(xì)菌計數(shù)器，蠟筆，玻片，消1、正常人體的細(xì)菌檢查皮膚細(xì)菌的檢查（1）將手指在平板上按一下；取一根頭發(fā)，用無菌鑷子貼放在平板上。（2）平板培養(yǎng)、觀察四、實驗步驟1、正常人體的細(xì)菌檢查四、實驗步驟咽部細(xì)菌的檢查（1）用無菌棉拭子蘸取咽部分泌的液體，然后將該棉拭子在血瓊脂平板一端涂抹，接下來用接種環(huán)以涂抹處為起點，在平板上畫之字形圖案進行分離。（2）將血瓊脂平板置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h，挑選不同菌落作革蘭氏染色，鏡檢。四、實驗步驟咽部細(xì)菌的檢查四、實驗步驟牙垢中細(xì)菌的檢查（1）用消毒牙簽剔牙垢少許，置于玻片中央。（2）加少許生理鹽水將牙垢混勻，涂成薄層，用酒精燈干燥固定。（3）革蘭氏染色，鏡撿。四、實驗步驟牙垢中細(xì)菌的檢查四、實驗步驟2、空氣中細(xì)菌的檢查（1）取4個無菌操作制備的瓊脂平板，將3個分別置于實驗臺、走廊、窗臺等位置，并打開皿蓋放置15～30min后，蓋好皿蓋；另外1個不打開皿蓋作為對照。（2）將上述4個瓊脂平板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。四、實驗步驟2、空氣中細(xì)菌的檢查四、實驗步驟3.水中細(xì)菌的檢查（1）十倍梯度稀釋（2）稀釋水樣與培養(yǎng)基混合倒平板（3）培養(yǎng)、觀察。四、實驗步驟3.水中細(xì)菌的檢查四、實驗步驟對各種來源的樣品進行對比，如平板菌落數(shù)和菌落類型等？飯前為何要洗手？如何防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴散方面？思考題對各種來源的樣品進行對比，如平板菌落數(shù)和菌落類型等？思考實驗四

培養(yǎng)基的配制與滅菌

實驗四

培養(yǎng)基的配制與滅菌

一、實驗?zāi)康?.熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。

2.掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。

3.掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。一、實驗?zāi)康?/p>

培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機鹽、生長因素以及某些特需的微量元素外還應(yīng)具有適宜的酸堿度〔pH值〕、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。

二、實驗的基本原理培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10％NaOH溶液、l0％鹽酸溶液、瓊脂、水(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉花。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱。三、實驗材料(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10％NaOH溶

一、玻璃器皿的洗滌和包裝清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。棉塞的制作包裝培養(yǎng)皿和移液管等。

2-1棉塞制作方法2-2移液管滅菌前的包裝四、實驗步驟一、玻璃器皿的洗滌和包裝2-1棉塞制作方法2-2移液二、培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基配方：

牛肉膏2.5g蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、瓊脂10.0g、自來水500mL、pH7.2~7.4。（二）操作步驟：

1.取一個1000mL燒杯，裝500mL蒸餾水。

2.按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分

b.蛋白胨、肉膏可加熱促進溶解

c.加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補充因蒸發(fā)而損失的水量。二、培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制3.調(diào)pH值：用10％NaOH調(diào)pH至7.2~7.4，用精密pH試紙對照。

4.過濾

液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。

5.分裝：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染(見圖2－3)。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面（圖2－4）。分裝入錐形瓶內(nèi)以不超過其容積的3/5為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜．滅菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。

6.包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。

7.滅菌備用：滅菌條件：1210C（相當(dāng)蒸汽壓力0.103MPa）培養(yǎng)基滅菌后必須在37℃下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。3.調(diào)pH值：用10％NaOH調(diào)pH至7.2~7

圖例

圖2－3培養(yǎng)基分裝圖2－4斜面制作

圖例

圖2－3培養(yǎng)基分裝

三、稀釋水的制備1.取一個250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶內(nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。

2.另取5支18mm×180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。三、稀釋水的制備1.取一個250mL的錐形瓶裝90

四、滅菌

加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法

a.將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至160℃并維持2h；

b.把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到50℃左右，才能將物品取出。四、滅菌加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法

高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：1.滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。

2.將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。

注意：器物不能裝得太滿。

3.接通電源，進行加熱。4.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計指示溫度為100℃時關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時關(guān)閉排氣閥。濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法5.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為121℃)即開始滅菌，使其維持15～30min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2)，延長時間。6.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。

7.待培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為1間歇滅菌法：

即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅菌。操作方法：

a.待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，連續(xù)3d重復(fù)進行。

b.在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。

c.第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無菌才能使用。間歇滅菌法：即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基

過濾除菌法：

不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進行除菌。

用于除菌的濾器：a.蔡氏濾器，b.注射器裝置濾器

過濾除菌法：1.配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2.培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培養(yǎng)基進行無菌檢查？

3.高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才能打開鍋蓋?

思考題1.配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題實驗五

細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)實驗五

細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)1.掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。

2.掌握幾種接種技術(shù)。一、實驗?zāi)康?.掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離

無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。二、實驗材料無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支一、細(xì)菌的純種分離

三、實驗步驟三、實驗步驟(一)稀釋平板法1.取樣用無菌錐形瓶到現(xiàn)場取一定量的湖水，迅速帶回實驗室。

2.稀釋水樣將1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用記號筆依次編上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號為10－1無菌水(內(nèi)含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為10－1濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL10－1濃度的菌液于編號為10－2無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10－2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10－6

。(一)稀釋平板法1.取樣稀釋液的制備10mL試樣90mL蒸餾水稀釋液的制備10mL試樣90mL蒸餾水3.平板的制作①取10套無菌培養(yǎng)皿編號，10－4、10－5、10－6各3個，另一個為空氣對照。②取1支1mL無菌移液管從濃度小的菌液開始，以10－6、10－5、10－4為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿內(nèi)(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。3.平板的制作③加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45℃左右時，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。

a:皿法b:倒平板③加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45℃左右時，右手拿裝有培養(yǎng)基④取對照無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。試驗二細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察-海南大學(xué)課件（二）平板劃線法1.平板制作：將融化并冷至約50℃的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。

2.劃線：用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。（二）平板劃線法1.平板制作：將融化并冷至約50℃的平板劃線分離的劃線方法

左：連續(xù)劃線法（1，2依次劃線的起點）右：分區(qū)劃線法（1，2，3，4依次劃線的起點）平板劃線分離的劃線方法

二、細(xì)菌的接種技術(shù)

接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。

二、細(xì)菌的接種技術(shù)接種方法：常用的有斜面接種法、平

（一）斜面接種法①左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時向上)

。右手將棉塞旋松，以便在接種時容易拔出。②右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。③將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。123

（一）斜面接種法①左手平托兩支試管，拇指壓住兩支④將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。45678④將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用

（二）液體接種和穿刺接種1.液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液)：用接種環(huán)挑取斜面菌種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅滅菌。2.穿刺接種法(從斜面菌種接入(半)固體培養(yǎng)基)：用接種針經(jīng)火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。

（二）液體接種和穿刺接種1.液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)

（三）稀釋平板涂布法1.稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法2.倒平板：將融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板3.用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)志樣品液于平板上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻4.將培養(yǎng)皿正擺在恒溫箱中，調(diào)節(jié)一定溫度進行培養(yǎng)。如果培養(yǎng)時間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至長出菌落。

（三）稀釋平板涂布法1.稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法（四）液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基接種工具：無菌移液管和無菌滴管移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。（四）液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基1.斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？

2.用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時，應(yīng)從哪個濃度開始？為什么？思考題1.斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培養(yǎng)基實驗六

微生物細(xì)胞的計數(shù)實驗六

微生物細(xì)胞的計數(shù)1.了解血球計數(shù)板的結(jié)構(gòu)及計數(shù)原理。

2、掌握使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。

一、實驗?zāi)康?.了解血球計數(shù)板的結(jié)構(gòu)及計數(shù)原理。一、實驗?zāi)康?/p>

測定微生物數(shù)量方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計數(shù)法、平板計數(shù)法和光電比濁計數(shù)法。

顯微鏡直接計數(shù)法

將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，又稱血球計數(shù)板，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。二、實驗的基本原理測定微生物數(shù)量方法很多，通常采用的有顯微血球計數(shù)板的構(gòu)造血球計數(shù)板的構(gòu)造血球計數(shù)板的計算方法

血球計數(shù)板上刻有一長寬各為1毫米的方形大格，其體積為0.1mm3。計數(shù)板有兩種刻度，一種是每大格分為16個中格，而每中格又分25個小格，每大格為16×25小格=400小格，而另一種，則是每大格分為25個中格，而每中格又分為16個小格，則每大格為25×16=400小格（計數(shù)板上的標(biāo)識為XB·K25）計數(shù)時，如果使用16格×25格規(guī)格的計數(shù)室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格（即100個小格）的酵母菌數(shù)。如果使用25格×16格規(guī)格的計數(shù)室除了取其4個對角方位外，還需再數(shù)中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數(shù)。

(6)當(dāng)遇到位于大格線上的酵母菌，一般只計數(shù)大方格的上方和左方線上的酵母細(xì)胞(或只計數(shù)下方和右方線上的酵母細(xì)胞)。血球計數(shù)板的計算方法血球計數(shù)板上刻有一長寬各為1計數(shù)公式(1)16×25的血球計數(shù)板計算公式：酵母細(xì)胞數(shù)／ml=（100小格內(nèi)酵母細(xì)胞個數(shù)／100）×400×10000×稀釋倍數(shù)

(2)25x16的血球計數(shù)板計算公式：酵母細(xì)胞數(shù)／ml=（80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個數(shù)／80）×400×10000×稀釋倍數(shù)計數(shù)公式(1)16×25的血球計數(shù)板計算公式：

三、實驗器材

顯微鏡、血球計數(shù)板、酵母菌液、蓋玻片、吸管、吸水紙。

三、實驗器材

顯微鏡、血球計數(shù)板、酵母菌液、蓋玻片、操作步驟1.鏡檢計數(shù)室對計數(shù)板進行鏡檢。若有污物，則用自來水沖洗，用電吹風(fēng)吹干后才能進行計數(shù)。2.加樣品在血球計數(shù)板上蓋上蓋玻片,用滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴,菌液會自動進入計數(shù)室，靜置5分鐘。3.計數(shù)將血球計數(shù)板置于載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室的位置，再換高倍鏡計數(shù)。25個中格的取計數(shù)板四角和中間位置的五個中方格計菌數(shù)。重復(fù)計2-3次，取其平均值，按公式計算每毫升酵母菌液中菌體的個數(shù)。4.清洗血球計數(shù)板計數(shù)后將血球計數(shù)板用自來水沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌干凈為止。操作步驟1.鏡檢計數(shù)室對計數(shù)板進行鏡檢。若有結(jié)果記錄

第一個中格第二個中格第三個中格第四個中格第五個中格第一次測定第二次測定第三次測定平均結(jié)果記錄第一個第二個第三個第四個第五個第一次第二次第三次平1.使用血球計數(shù)板應(yīng)注意什么問題?2.試分析影響本實驗結(jié)果的誤差來源并提出改進措施思考題思考題實驗七

大腸桿菌生長曲線的測定實驗七

大腸桿菌生長曲線的測定1.了解大腸桿菌的生長曲線特征和繁殖規(guī)律，并學(xué)會繪制生長曲線；2.學(xué)習(xí)光電比濁法測量細(xì)菌數(shù)量的方法。

一、實驗?zāi)康?.了解大腸桿菌的生長曲線特征和繁殖規(guī)律，并學(xué)會繪制生將少量細(xì)菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進行培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的對數(shù)作縱坐標(biāo)，生長時間作橫坐標(biāo)，所繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下進行液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，二、實驗的基本原理將少量細(xì)菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在722型分光光度計，恒溫振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。LB液體培養(yǎng)基。大腸桿菌。三、實驗材料722型分光光度計，恒溫振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。三、四、實驗步驟1.250mL三角瓶11個，分別編號為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。2.大腸桿菌接入盛有50mLLB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。3.分別按對應(yīng)時間將三角瓶取出，立即于4℃條件下貯存，待所有培養(yǎng)結(jié)束時一同測定OD值。四、實驗步驟1.250mL三角瓶11個，分別編號為0、1.四、實驗步驟4.將未接種的LB液體培養(yǎng)基倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調(diào)節(jié)零點，作為空白對照，并對不同時間培養(yǎng)液從0h起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在0.10～0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。四、實驗步驟4.將未接種的LB液體培養(yǎng)基倒入比色杯中，選用如果用活菌計數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會有什么不同?兩者各有什么缺點？次生禮謝產(chǎn)物的大量積累在哪個時期?根據(jù)細(xì)菌生長繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多?思考題如果用活菌計數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會有什么不同?兩者各有什實驗八

細(xì)菌的生理生化反應(yīng)——大分子物質(zhì)的水解試驗實驗八

細(xì)菌的生理生化反應(yīng)1、證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2、掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。3、了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用。4、掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。5、了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。一、實驗?zāi)康?、證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說明不1、微生物對生物大分子的分解利用淀粉水解：淀粉酶油脂水解：脂肪酶明膠液化：蛋白酶石蕊牛乳試驗：產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、胨化、酸凝固等。2、糖發(fā)酵試驗產(chǎn)酸：溴甲酚紫指示劑大腸桿菌：產(chǎn)氣腸桿菌：產(chǎn)氣：杜氏小管檢測大腸桿菌：產(chǎn)氣腸桿菌：3、IMViC試驗二、實驗的基本原理1、微生物對生物大分子的分解利用淀粉水解：淀粉酶2、糖發(fā)酵試IMViC試驗吲哚試驗：甲基紅試驗（M.R.試驗）：伏-普試驗（乙酰甲基甲醇試驗）：檸檬酸鹽試驗：色氨酸酶：色氨酸→吲哚＋對二甲基氨基苯甲醛→玫瑰吲哚（紅色）大腸桿菌：產(chǎn)氣腸桿菌：產(chǎn)酸能力：強，甲基紅變紅；弱：甲基紅不變色大腸桿菌：陽性產(chǎn)氣腸桿菌：陰性葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→2,3-丁二醇乙酰甲基甲醇→OH－→二乙酰＋精氨酸的胍基→紅色化合物大腸桿菌：陽性產(chǎn)氣腸桿菌：陰性能否利用檸檬酸作為碳源大腸桿菌：陰性產(chǎn)氣腸桿菌：陽性IMViC試驗吲哚試驗：色氨酸酶：色氨酸→吲哚＋對二甲基氨基1、菌種：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），普通變形桿菌（Proteusvularis），產(chǎn)氣腸桿菌。2、培養(yǎng)基：固體油脂培養(yǎng)基，固體淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基試管，石蕊牛奶試管，尿素瓊脂試管、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3支，普通變形桿菌（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管），蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基，醋酸鉛培養(yǎng)基。3、溶液或試劑：革蘭氏染色用盧氏碘液（Lugol’siodinesolution），甲基紅指示劑，40%KOH，5%α-萘酚，乙醚，吲哚試劑等。4、儀器或其他用具：無菌平板，無菌試管，接種環(huán)，接種針，試管架。三、實驗材料1、菌種：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗

淀粉水解試驗培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基平板菌種：大腸桿菌和枯草芽孢桿菌方法：平板上劃“十”字接種注意：接種前在平板底部作記號；“十”字不要太大

油脂水解試驗培養(yǎng)基：油脂培養(yǎng)基平板菌種：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌方法：平板上劃折線接種注意：接種前在平板底部作記號

明膠液化試驗培養(yǎng)基：試管明膠培養(yǎng)基菌種：大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌方法：穿刺接種注意：20℃培養(yǎng)

石蕊牛乳試驗培養(yǎng)基：試管石蕊牛乳培養(yǎng)基（2支）菌種：粘乳產(chǎn)堿菌或銅綠假單胞菌方法：斜面劃線接種注意：觀察結(jié)構(gòu)注意牛乳產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固、胨化現(xiàn)象是連續(xù)出現(xiàn)的。四、實驗步驟1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗淀粉水解試驗培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基平1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗2、糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝杜氏小管）（各3支）菌種：大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌方法：分別接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基四、實驗步驟1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗2、糖發(fā)酵試驗3、IMViC試驗四、實驗步驟1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗四、實驗步驟IMViC試驗試驗名稱培養(yǎng)基名稱菌種名稱接種方式接種管數(shù)吲哚試驗蛋白胨水培養(yǎng)基大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌液體1甲基紅試驗葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基液體1伏普試驗葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基液體1檸檬酸鹽試驗檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面1IMViC試驗試驗名稱培養(yǎng)基名稱菌種名稱接種方式接種吲哚試驗1、不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？2、假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？3、為什么大腸桿菌的甲基紅反應(yīng)陽性，而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？這個試驗與伏－普試驗最初底物與最終產(chǎn)物有何異同之處？4、說明在硫化氫試驗中醋酸鉛的作用，可以用哪種化合物代替醋酸鉛？思考題1、不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？思考題實驗九菌種的保藏

實驗九一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)和掌握菌種保藏的基本原理;2.比較和掌握幾種不同菌種保藏的方法。一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)和掌握菌種保藏的基本原理;微生物個體微小、代謝活躍、生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異，被其他雜菌污染，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此，菌種的長期保藏對任何微生物學(xué)工作者都很重要，也是非常必要的。人為地創(chuàng)造低溫、缺氧、干燥、缺少營養(yǎng)物質(zhì)等不良條件，抑制微生物的生長、繁殖，使其處于休眠狀態(tài)，從而可以較長時間保持菌種不死亡和不變異。二、實驗的基本原理微生物個體微小、代謝活躍、生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變

幾種常用的保藏方法：

1、傳代培養(yǎng)法保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。

2、載體法使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。二、實驗的基本原理幾種常用的保藏方法：二、實驗的基本原理

3、懸液法將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。

4、冷凍法使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護劑的使用。

5、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和L－干燥法。冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進行減壓干燥。

L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在10－20C?范圍內(nèi)進行真空干燥。二、實驗的基本原理3、懸液法二、實驗的基本原理試管，棉塞，研體，燒杯，pH試紙，干燥器，高壓滅菌鍋，干燥箱，培養(yǎng)箱，真空泵，接種針，超凈工作臺，酒精燈，火柴，凍存管，安瓿管，吸管。甘油，液體石蠟，干冰，培養(yǎng)基等。哈氏弧菌。三、實驗材料試管，棉塞，研體，燒杯，pH試紙，干燥器，高壓滅菌鍋，干燥箱1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細(xì)菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。四、實驗步驟1、斜面保藏法四、實驗步驟2、液體石蠟保藏法將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。

3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。四、實驗步驟2、液體石蠟保藏法四、實驗步驟4、砂土管保藏法（1）河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（２）土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。

(3)砂土混合處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。

四、實驗步驟4、砂土管保藏法四、實驗步驟(4)無菌檢查 每10支砂土管隨機抽1支，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使用。

(5)菌懸液的制備 取生長健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18x180mm的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。

(6)分裝樣品 每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入0．5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)，用接種針拌勻。

(7)干燥將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。

(8)保存置4℃冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時間進行檢測。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛、效果較好，可保存幾年時間，但對營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。(4)無菌檢查5、冷凍真空干燥法（1）凍干管的準(zhǔn)備：中性硬制玻璃，烘干，滅菌。（2）菌種培養(yǎng)：細(xì)菌芽孢脫落；放，霉孢子豐滿。（3）保護劑的配制：配制，滅菌，檢查（4）菌懸液的制備：2-3ml保護劑（5）分裝樣品：菌懸液每管0.2ml

（6）預(yù)凍：程序控溫儀降溫（7）冷凍真空干燥：-50℃下抽真空（8）取出樣品：輕敲松散即達(dá)標(biāo)（9）第二次干燥：（10）熔封（11）存活性檢測：抽取一管進行存活性檢查（12）保存：4℃保存四、實驗步驟5、冷凍真空干燥法四、實驗步驟1、液體石蠟保藏菌種的原理是什么？2、產(chǎn)孢子的菌種一般用哪一種方法保藏？3、細(xì)菌用哪種方法保存的時間長面又不易變異？4、經(jīng)常使用的細(xì)菌菌種，應(yīng)用哪一種方法保藏既好又簡便？思考題1、液體石蠟保藏菌種的原理是什么？思考題實驗十海水養(yǎng)殖池塘水體中各類細(xì)菌總數(shù)的測定

實驗十1.學(xué)習(xí)水樣的采取方法和各類水樣細(xì)菌總數(shù)測定的方法；2.了解水樣的平板菌落計數(shù)的原則。一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)水樣的采取方法和各類水樣細(xì)菌總數(shù)測定的方法；一、實驗本實驗應(yīng)用平板菌落計數(shù)技術(shù)測定水中各類細(xì)菌的總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多，它們對營養(yǎng)和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落，計算出水中各類細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。二、實驗的基本原理本實驗應(yīng)用平板菌落計數(shù)技術(shù)測定水中各類細(xì)菌的總數(shù)。二、實驗的滅菌的平皿(90cm)，滅菌的刻度吸管(l.0mL，1.0mL)，盛9.0mL無菌水的試管，恒溫培養(yǎng)箱等。培養(yǎng)基：

2216E培養(yǎng)基；TCBS培養(yǎng)基(弧菌用)；.放線菌培養(yǎng)基；氨化細(xì)菌培養(yǎng)基；亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基；硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基海水養(yǎng)殖池塘（蝦池或魚池）水樣。三、實驗材料滅菌的平皿(90cm)，滅菌的刻度吸管(l.0mL，1.01.水體取樣：應(yīng)取距水面10～15cm的深層水樣。先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。四、實驗步驟1.水體取樣：四、實驗步驟3.將水樣分別稀釋成10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀釋濃度（注意：在稀釋前后一定要充分混勻）。

注意：水樣的稀釋，取1個滅菌空試管，加入9mL滅菌水。用取過滅菌水的移液管取1mL河水樣，放入試管中，振蕩試管混合均勻。

四、實驗步驟3.將水樣分別稀釋成10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀4.涂布平板法：1.加熱已經(jīng)配制好的固體培養(yǎng)基（肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基），使固體培養(yǎng)基溶化。2.倒制平板：每個空平皿中倒約20mL的培養(yǎng)基，放置桌面待其凝固。3.用移液管吸取0.1mL水樣，滴于平板中；將玻璃涂布棒于酒精燈的外焰上加熱，殺死表面微生物，然后耐心待其冷卻，然后用涂布棒將水滴均勻的涂滿整個平板表面，盡量將水涂干。5.倒置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。四、實驗步驟4.涂布平板法：四、實驗步驟試驗二細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察-海南大學(xué)課件6.菌落計數(shù)：

1.挑取無片狀菌苔生長的平板作為計數(shù)平板，若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均勻時，可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)。

2.選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的平板來計算該水樣的菌落總數(shù)。如果所有的平板的菌落總數(shù)都不在30—300范圍之內(nèi)，則取最靠近30—300的平板進行計數(shù)

3.如果有兩個稀釋濃度的總菌落數(shù)落在了30—300范圍之內(nèi)，則先計算兩個濃度下每ml水體中細(xì)菌總數(shù)，如果兩個數(shù)值的比值大于2則取小的濃度，如若小于2則取兩值的平均值。6.菌落計數(shù)：微生物學(xué)實驗海南大學(xué)海洋學(xué)院微生物學(xué)實驗海南大學(xué)海洋學(xué)院實驗一細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察實驗一一、實驗?zāi)康挠^察細(xì)菌的菌落特征掌握簡單染色法和細(xì)菌涂片方法在油鏡下觀察細(xì)菌個體的形態(tài)特征一、實驗?zāi)康挠^察細(xì)菌的菌落特征形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個體的形態(tài)觀察。細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等發(fā)生變化。細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長狀況、排列方式、好氣性和運動性直接相關(guān)。細(xì)菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。二、實驗的基本原理形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個體的形態(tài)觀察。二、實驗的基本原二、實驗的基本原理簡單染色法原理：細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷，用堿性染料（解離時帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等進行染色。采用加熱或化學(xué)固定兩種方法，使菌體粘附于玻片上，并且增加菌體對染料的親和力二、實驗的基本原理簡單染色法原理：細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷三、實驗材料顯微鏡（顯微鏡燈）、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。0.05%和0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液，0.5%番紅染液，中性紅染液，二甲苯，生理鹽水細(xì)菌三種形態(tài)的染色標(biāo)本。大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，哈氏弧菌和無乳鏈球菌24h液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。三、實驗材料顯微鏡（顯微鏡燈）、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、簡單染色法（一般染色法）１.菌種：牙垢細(xì)菌２.涂片３.干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。４固定５.染色：在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。６.水洗：傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。７干燥：空氣中自然干燥。８鏡檢：在油鏡下觀察牙垢中的各種細(xì)菌形態(tài)并繪圖。四、實驗步驟簡單染色法（一般染色法）１.菌種：牙垢細(xì)菌四、實驗步驟油鏡的使用

1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。2.調(diào)節(jié)光亮度

3.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)4.依次再進行中倍、高倍觀察

5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。

6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。7.用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。

四、實驗步驟油鏡的使用顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項：1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。5.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。四、實驗步驟顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項：細(xì)菌三種基本形態(tài)的觀察：

菌落形態(tài)觀察和個體形態(tài)觀察，這里主要指個體形態(tài)的觀察。

1.

結(jié)合油鏡的使用，觀察三張細(xì)菌染色片（球狀菌、桿狀菌、和螺旋狀菌），邊觀察邊繪圖。

2.

看示范鏡：觀察雙球菌、四聯(lián)球菌，并繪圖。四、實驗步驟細(xì)菌三種基本形態(tài)的觀察：四、實驗步驟思考題油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？使用油鏡時，為什么必須用鏡頭油？鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？思考題油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什實驗二細(xì)菌的革蘭氏染色實驗二一、實驗?zāi)康恼莆占?xì)菌的革蘭氏染色進一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)觀察和識別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造一、實驗?zāi)康恼莆占?xì)菌的革蘭氏染色細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成存在差異，因此不同細(xì)菌對革蘭氏染色有不同的反應(yīng)（陽性和陰性）：革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多脂類，肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，當(dāng)以95%酒精脫色時，脂類被溶解除去，使得細(xì)胞壁空隙變大，肽聚糖因95%酒精處理，其孔徑會縮小，但由于肽聚糖含量較少，細(xì)胞壁孔徑縮小有限，使得結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物被95%酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，并被隨后的紅色復(fù)染劑染成紅色；革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂類含量少，經(jīng)95%酒精脫色處理后，肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，使得結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物很難被95%酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色，呈現(xiàn)紫色。二、實驗的基本原理細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成存在差異，因此不同細(xì)菌對革蘭氏染色有不顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，吸水紙，染色缸等。染色劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液，盧（路）哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液。菌種：哈氏弧菌和鰻弧菌24h普通海水瓊脂斜面28℃培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌24h牛肉膏瓊脂斜面28℃培養(yǎng)物。三、實驗材料顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡革蘭氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.

鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。四、實驗步驟革蘭氏（Gram）染色法思考題要得到正確的革蘭氏染色結(jié)果必須注意哪些操作？關(guān)鍵在哪幾步？為什么？思考題要得到正確的革蘭氏染色結(jié)果必須注意哪些操作？關(guān)鍵在實驗三實驗室環(huán)境及人體表面的微生物檢查實驗三認(rèn)識細(xì)菌分布的廣泛性；

掌握對菌落識別；

懂得無菌操作的重要性。一、實驗?zāi)康恼J(rèn)識細(xì)菌分布的廣泛性；一、實驗?zāi)康拿恳痪w在適宜條件下，經(jīng)過多次細(xì)胞分裂可形成一個肉眼可見的子細(xì)胞集合體，稱為菌落。由于不同細(xì)菌其個體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理和生化等特征不同，當(dāng)一個菌體經(jīng)分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈現(xiàn)其固有的特點。通過合適的方法，將自然環(huán)境中的微生物接種到平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)后觀察平板上的菌落，就可以檢查環(huán)境中及人體細(xì)菌的數(shù)量和類型。二、實驗的基本原理每一菌體在適宜條件下，經(jīng)過多次細(xì)胞分裂可形成一個肉眼可見的子無菌試管，無菌吸管，無菌空培養(yǎng)皿，細(xì)菌計數(shù)器，蠟筆，玻片，消毒牙簽，酒精燈，接種環(huán)，無菌棉拭子等。瓊脂平板培養(yǎng)基，高層瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水，2％碘酒，75％乙醇，普通瓊脂平板，血瓊脂平板，革蘭氏染色劑。水樣，泥土，空氣和人體。三、實驗材料無菌試管，無菌吸管，無菌空培養(yǎng)皿，細(xì)菌計數(shù)器，蠟筆，玻片，消1、正常人體的細(xì)菌檢查皮膚細(xì)菌的檢查（1）將手指在平板上按一下；取一根頭發(fā)，用無菌鑷子貼放在平板上。（2）平板培養(yǎng)、觀察四、實驗步驟1、正常人體的細(xì)菌檢查四、實驗步驟咽部細(xì)菌的檢查（1）用無菌棉拭子蘸取咽部分泌的液體，然后將該棉拭子在血瓊脂平板一端涂抹，接下來用接種環(huán)以涂抹處為起點，在平板上畫之字形圖案進行分離。（2）將血瓊脂平板置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h，挑選不同菌落作革蘭氏染色，鏡檢。四、實驗步驟咽部細(xì)菌的檢查四、實驗步驟牙垢中細(xì)菌的檢查（1）用消毒牙簽剔牙垢少許，置于玻片中央。（2）加少許生理鹽水將牙垢混勻，涂成薄層，用酒精燈干燥固定。（3）革蘭氏染色，鏡撿。四、實驗步驟牙垢中細(xì)菌的檢查四、實驗步驟2、空氣中細(xì)菌的檢查（1）取4個無菌操作制備的瓊脂平板，將3個分別置于實驗臺、走廊、窗臺等位置，并打開皿蓋放置15～30min后，蓋好皿蓋；另外1個不打開皿蓋作為對照。（2）將上述4個瓊脂平板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。四、實驗步驟2、空氣中細(xì)菌的檢查四、實驗步驟3.水中細(xì)菌的檢查（1）十倍梯度稀釋（2）稀釋水樣與培養(yǎng)基混合倒平板（3）培養(yǎng)、觀察。四、實驗步驟3.水中細(xì)菌的檢查四、實驗步驟對各種來源的樣品進行對比，如平板菌落數(shù)和菌落類型等？飯前為何要洗手？如何防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴散方面？思考題對各種來源的樣品進行對比，如平板菌落數(shù)和菌落類型等？思考實驗四

培養(yǎng)基的配制與滅菌

實驗四

培養(yǎng)基的配制與滅菌

一、實驗?zāi)康?.熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。

2.掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。

3.掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。一、實驗?zāi)康?/p>

培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機鹽、生長因素以及某些特需的微量元素外還應(yīng)具有適宜的酸堿度〔pH值〕、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。

二、實驗的基本原理培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10％NaOH溶液、l0％鹽酸溶液、瓊脂、水(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉花。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱。三、實驗材料(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10％NaOH溶

一、玻璃器皿的洗滌和包裝清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。棉塞的制作包裝培養(yǎng)皿和移液管等。

2-1棉塞制作方法2-2移液管滅菌前的包裝四、實驗步驟一、玻璃器皿的洗滌和包裝2-1棉塞制作方法2-2移液二、培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基配方：

牛肉膏2.5g蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、瓊脂10.0g、自來水500mL、pH7.2~7.4。（二）操作步驟：

1.取一個1000mL燒杯，裝500mL蒸餾水。

2.按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分

b.蛋白胨、肉膏可加熱促進溶解

c.加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補充因蒸發(fā)而損失的水量。二、培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制3.調(diào)pH值：用10％NaOH調(diào)pH至7.2~7.4，用精密pH試紙對照。

4.過濾

液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。

5.分裝：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染(見圖2－3)。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面（圖2－4）。分裝入錐形瓶內(nèi)以不超過其容積的3/5為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜．滅菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。

6.包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。

7.滅菌備用：滅菌條件：1210C（相當(dāng)蒸汽壓力0.103MPa）培養(yǎng)基滅菌后必須在37℃下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。3.調(diào)pH值：用10％NaOH調(diào)pH至7.2~7

圖例

圖2－3培養(yǎng)基分裝圖2－4斜面制作

圖例

圖2－3培養(yǎng)基分裝

三、稀釋水的制備1.取一個250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶內(nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。

2.另取5支18mm×180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。三、稀釋水的制備1.取一個250mL的錐形瓶裝90

四、滅菌

加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法

a.將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至160℃并維持2h；

b.把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到50℃左右，才能將物品取出。四、滅菌加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法

高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：1.滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。

2.將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。

注意：器物不能裝得太滿。

3.接通電源，進行加熱。4.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計指示溫度為100℃時關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時關(guān)閉排氣閥。濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法5.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為121℃)即開始滅菌，使其維持15～30min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2)，延長時間。6.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。

7.待培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為1間歇滅菌法：

即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅菌。操作方法：

a.待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，連續(xù)3d重復(fù)進行。

b.在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。

c.第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無菌才能使用。間歇滅菌法：即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基