轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件

第9章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

與動(dòng)物生物反應(yīng)器TransgenicAnimal＆AnimalBioreactor第9章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

與動(dòng)物生物反應(yīng)器TransgenicA1學(xué)習(xí)須知主要內(nèi)容：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用重點(diǎn)：常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育技術(shù)學(xué)習(xí)須知主要內(nèi)容：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用2章節(jié)內(nèi)容前言9.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)9.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用9.3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器章節(jié)內(nèi)容前言3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

TransgenicAnimal轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

TransgenicAnimal4前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的遺傳工程動(dòng)物。或者是指借助基因工程技術(shù)把外源基因?qū)胧荏w動(dòng)物的染色體內(nèi)，外源基因可在受體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物。前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因，并5轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究歷史：1974年，美國(guó)學(xué)者Jaenisch首次應(yīng)用顯微鏡注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1981年，美國(guó)科學(xué)家成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國(guó)著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶，含量高達(dá)30毫克/升。

1989年，意大利學(xué)者用精子作為載體轉(zhuǎn)移目的基因，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠。

1997年10月，英國(guó)羅斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。

1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管牛“滔滔”誕生，其體內(nèi)被檢測(cè)到帶有人的血清白蛋白基因，這項(xiàng)成果被評(píng)為當(dāng)年“中國(guó)十大科技進(jìn)展”之一。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究歷史：1974年，美國(guó)學(xué)者Jaenisch首69.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育技術(shù)有：9.1.1基因顯微注射法9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法9.1.3胚胎干細(xì)胞介入法9.1.4精子載體導(dǎo)入法9.1.5YAC介導(dǎo)法9.1.6細(xì)胞核移植技術(shù)9.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育技術(shù)有：79.1.1基因顯微注射法原理通過顯微注射儀把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核內(nèi)部，并使之整合到基因組DNA中，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。9.1.1基因顯微注射法原理89.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：1.目的基因的制備與純化；2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備；3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；4.供體母鼠與公鼠交配；5.受精卵采集；6.目的基因顯微注射；7.受精卵移植；8.目的基因表達(dá)鑒定和檢測(cè)；9.建立遺傳基因小鼠近交系。9.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：91.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：內(nèi)切酶的酶切片段；cDNA;人工合成基因片段；PCR擴(kuò)增特異片段。1.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：102.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備；將輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配可育雌鼠，剌激雌鼠產(chǎn)生一系列一系列妊娠變化反應(yīng)而得到假孕母鼠，做為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母。2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備；將輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交113.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性腺激素（PMSG）以及人絨毛膜促性腺激素(HCG)促使其超排卵。3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性124.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交配。4.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交135.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精卵，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)液保存?zhèn)溆谩?.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精146.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精卵雄性原核內(nèi)。6.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精15顯微注射的機(jī)理受精卵1個(gè)小時(shí)之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原核，不融合，隨著時(shí)間的推移，雄原核開始膨大。注射針要插入雄原核內(nèi)。首先將受精卵置于培養(yǎng)基的液滴內(nèi)，用吸持針找到受精卵并吸持住，調(diào)整雄原核的位置。將注射針裝好DNA溶液，通過調(diào)節(jié)注射管，慢慢將DNA溶液注射進(jìn)入雄原核內(nèi)。顯微注射的機(jī)理受精卵1個(gè)小時(shí)之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原167.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細(xì)胞到桑葚胚階段，自假孕母鼠的背部植入其輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟。7.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細(xì)胞到桑178.目的基因表達(dá)鑒定和檢測(cè)①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交（southern），鑒定外源基因是否整合，有整合的鼠稱為首建鼠（founder）（半合子：目的基因整合在二倍體動(dòng)物的其中一條染色體上

）；②檢測(cè)：通過northern(RNA)andwestern(Pr)雜交在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)表達(dá)。8.目的基因表達(dá)鑒定和檢測(cè)①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA189.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型小鼠雜交，檢測(cè)后代的整合率，取后代有50%機(jī)率帶有整合基因的小鼠(陽性)，近親繁殖，再通過同一窩的陽性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基因的同源重組作用下，最終得到純合子小鼠。9.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型19轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件20轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程21轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程（續(xù)）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程（續(xù)）22轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程23顯微注射法優(yōu)點(diǎn)：外源基因的導(dǎo)入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長(zhǎng)度可>100Kb。它可以直接獲得純系，實(shí)驗(yàn)周期短。顯微注射法不足點(diǎn)：外源基因整合的效率低，不能控制整合的位點(diǎn)，外源基因隨機(jī)結(jié)合或隨機(jī)插入位點(diǎn)，有插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，而且整合的拷貝數(shù)未知，方法較復(fù)雜，技術(shù)性強(qiáng)，設(shè)備昂貴等，基因穩(wěn)定耗時(shí)較長(zhǎng)，效率低。顯微注射法優(yōu)點(diǎn)：24轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件259.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：262.流程（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；（2）包裝細(xì)胞；（3）重組病毒感染早期胚胎；2.流程（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；27（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：病毒DNA提取；病毒DNA克隆到載體；外源目的基因克隆到載體。（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：28（2）包裝細(xì)胞包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)基因所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時(shí)，該包裝細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA。載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，載體DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，包裝細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白組裝為具有感染性的重組病毒顆粒（位于包裝細(xì)胞內(nèi)）。（2）包裝細(xì)胞包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其29轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件30（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：取出受精卵；去除卵外的透明帶；包裝細(xì)胞（含重組病毒）與受精卵共培養(yǎng)(轉(zhuǎn)染)

；轉(zhuǎn)染后的胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；轉(zhuǎn)基因仔鼠的篩選鑒定（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：31逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：感染效率高；缺點(diǎn)：被導(dǎo)入的外源基因大小受限；感染后引起的安全性存在不確定性。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：329.1.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法1.原理外源DNA導(dǎo)入體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞，把轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞注入受體囊胚并使其分化，再將此囊胚移植到假孕動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。9.1.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法1.原理33流程分離培養(yǎng)ES細(xì)胞；外源基因?qū)隕S細(xì)胞；囊胚期胚胎獲得；通過顯微操作，把ES細(xì)胞注射到胚胎的囊胚腔，形成嵌合體；轉(zhuǎn)基因胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。流程分離培養(yǎng)ES細(xì)胞；34轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件35轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件36胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：在將胚胎干細(xì)胞植入胚胎前，可以在體外選擇特殊的基因型；用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細(xì)胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細(xì)胞用于細(xì)胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。缺點(diǎn)：許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生殖細(xì)胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：379.1.4精子載體導(dǎo)入法1.原理：將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后，使攜帶外源DNA的精子與卵子結(jié)合為受精卵，并使外源DNA整合于合子的染色體中。2.精子攜帶DNA主要是通過三種途徑來完成，即將外源DNA與精子共孵育、電穿孔導(dǎo)入法和脂質(zhì)體傳染法

9.1.4精子載體導(dǎo)入法1.原理：38程序外源基因?qū)刖樱晦D(zhuǎn)基因精子與卵子結(jié)合（通過人工受精，體外受精等）；受精卵移植到假孕動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。程序外源基因?qū)刖樱?9精子介導(dǎo)方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、方便，成本小，依靠生理受精過程，免去了原核的損傷。缺點(diǎn)：成功率不高,效果不穩(wěn)定。精子介導(dǎo)方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：409.1.5酵母人工染色體(YAC)介導(dǎo)法ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染YAC后體外篩選，所得陽性ES細(xì)胞囊胚腔注射；YAC的原核顯微注射兩種途徑。9.1.5酵母人工染色體(YAC)介導(dǎo)法41利用YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的優(yōu)勢(shì)在于保證巨大基因的完整性及所有順式因子的完整并與結(jié)構(gòu)基因的位置關(guān)系不變，且較大的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究時(shí)整合率提高，便于研究。利用YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的優(yōu)勢(shì)在于保證巨大基因的完整性及所有429.1.6細(xì)胞核移植技術(shù)1.原理轉(zhuǎn)基因技術(shù)與核移植技術(shù)結(jié)合。9.1.6細(xì)胞核移植技術(shù)1.原理432.程序外源基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞；篩選整合有外源基因的體細(xì)胞作為核供體；轉(zhuǎn)基因供體核移植到去核卵母細(xì)胞；被激活的轉(zhuǎn)基因卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)至囊胚；囊胚移植到假孕母體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因幼子。2.程序外源基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞；443.該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：后代全為轉(zhuǎn)基因個(gè)體，遺傳背景和遺傳穩(wěn)定性一致；僅需一代即可建立轉(zhuǎn)基因群體，節(jié)約時(shí)間和物力。缺點(diǎn)：技術(shù)不夠完善，成功率低；后代可能出現(xiàn)老化現(xiàn)象。3.該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：后代全為轉(zhuǎn)基因個(gè)體，遺傳背景和遺傳459.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用2.1在基礎(chǔ)理論方面的應(yīng)用2.1.1可以對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究2.1.2可以進(jìn)行組織表達(dá)特異性研究2.1.3還可以研究發(fā)育過程的特異性表達(dá)。將不同的外源基因轉(zhuǎn)入宿主動(dòng)物受精卵或早期胚胎干細(xì)胞，可觀察研究目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達(dá)、閉關(guān)及調(diào)控機(jī)理。9.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用2.1在基礎(chǔ)理論方面的應(yīng)用462.2在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用

2.2.1應(yīng)用于動(dòng)物抗病育種轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以用于動(dòng)物抗病育種，不僅可以加速改良的進(jìn)程，使選擇的效率提高，改良的機(jī)會(huì)增多，并且不會(huì)受到有性繁殖的限制.2.2.2應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善品質(zhì)。2.2在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用

2.2.1應(yīng)用472.3在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.3.l建立診斷和治療人類疾病的動(dòng)物模型。目前，遺傳學(xué)家可以通過精確地失活某些基因或增強(qiáng)某些基因的表達(dá)來制作各種各樣的研究人類疾病的動(dòng)物模型，也可以為研究諸如AIDS這樣的疾病提供合適的動(dòng)物模型。2.3.2用于生產(chǎn)藥用蛋白

目前，把轉(zhuǎn)基因動(dòng)物當(dāng)作生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)受到國(guó)際社會(huì)的極大關(guān)注。2.3.3生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官2.3.4借助轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型開展人類疾病的基因治療。2.3在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.3.l建立診斷489.2.7轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用

存在的問題及展望

3.l轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低，許多轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)烈地位受著其宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平極低，極少部分基因表達(dá)水平過高。

3.2難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為，轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合于動(dòng)物的基因組中，可能會(huì)引起宿生細(xì)胞染色體的插入突變，還會(huì)造成插入位點(diǎn)的基因片段丟失，插入位點(diǎn)周圍序列的倍增及基因的轉(zhuǎn)移，也可能激活正常狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài)的基因。

3.3難以全面掌握基因的表達(dá)和所受的調(diào)控。不了解哪些基因控制多數(shù)生理過程，不了解基因表達(dá)的發(fā)育控制和組織特異性控制的機(jī)制。

3.4制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率低，這是目前幾乎所有從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的實(shí)驗(yàn)室都面臨的問題，也是制約著這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

3.5對(duì)傳統(tǒng)倫理是一種挑戰(zhàn)，對(duì)人類的生存有一定的負(fù)面作用等。

9.2.7轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用

存在的問題及展望3.l轉(zhuǎn)基因表49外源基因整合方式基因隨機(jī)插入；基因剔除；基因替換；后二者合稱基因打靶。外源基因整合方式基因隨機(jī)插入；50基因隨機(jī)插入外源基因插入時(shí),需要限制性核酸內(nèi)切酶去切宿主的基因,而限制性核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別特定的核酸序列并在特定的位點(diǎn)切開,而宿主的基因里又不止一段這樣的核酸序列,所以會(huì)切出多個(gè)切段出來,所以是隨機(jī)的?；螂S機(jī)插入外源基因插入時(shí),需要限制性核酸內(nèi)切酶去切宿主的基51基因剔除（geneknock-out），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能?；蛱蕹╣eneknock-out），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知52基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建53轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件54基因替換（基因敲入）（geneknockin）是利用基因同源重組，將有功能的外源基因（基因組原先不存在、或已失活的基因），轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，與基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，進(jìn)而插入到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。基因替換（基因敲入）（geneknockin）是利用基因559.3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需要藥用蛋白。生物反應(yīng)器：目的基因可在器官組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因生物。按照器官分為：乳腺，膀胱，血液等生物反應(yīng)器。9.3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)569.3.1動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的制備1.構(gòu)建表達(dá)載體；2.選擇目的基因；3.重組基因構(gòu)建；4.重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)受精卵；5.轉(zhuǎn)基因胚胎移植；6.轉(zhuǎn)基因子代母畜及乳腺分泌物的鑒定。9.3.1動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的制備1.構(gòu)建表達(dá)載體；579.3.2動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)1.產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；2.成本低；3.研發(fā)周期短；4.環(huán)保，無污染；5.效益高9.3.2動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)1.產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；589.3.3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1.改良奶源品質(zhì)目前，已克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。

2003年，Brophy等通過共轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選向牛胎兒成纖維細(xì)胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷貝，而后進(jìn)行核移植生產(chǎn)出了8頭轉(zhuǎn)基因奶牛，其產(chǎn)奶中酪蛋白總量較普通奶高30%。這種奶的蛋白和鈣含量提高，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)而乳糜顆粒變小，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，也更適于奶酪生產(chǎn)

9.3.3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1.改良奶源品質(zhì)592.生產(chǎn)藥用蛋白重組人抗凝血酶：世界上第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。主要成分-重組人抗凝血酶，具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對(duì)治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。據(jù)美國(guó)權(quán)威機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，到2010年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額將達(dá)到350億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類的90%以上。2.生產(chǎn)藥用蛋白重組人抗凝血酶：世界上第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反609.3.4動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器存在的問題1.外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的位點(diǎn)整合問題；2.乳蛋白基因表達(dá)組織特異性問題；3.目的蛋白的翻譯后修飾問題；4.轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化問題；5.轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問題；6.倫理道德問題。9.3.4動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器存在的問題1.外源基因在動(dòng)物體61思考題課后。Theendofthischapter.

思考題課后。62第9章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

與動(dòng)物生物反應(yīng)器TransgenicAnimal＆AnimalBioreactor第9章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

與動(dòng)物生物反應(yīng)器TransgenicA63學(xué)習(xí)須知主要內(nèi)容：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用重點(diǎn)：常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育技術(shù)學(xué)習(xí)須知主要內(nèi)容：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用64章節(jié)內(nèi)容前言9.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)9.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用9.3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器章節(jié)內(nèi)容前言65轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

TransgenicAnimal轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

TransgenicAnimal66前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的遺傳工程動(dòng)物。或者是指借助基因工程技術(shù)把外源基因?qū)胧荏w動(dòng)物的染色體內(nèi)，外源基因可在受體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物。前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因，并67轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究歷史：1974年，美國(guó)學(xué)者Jaenisch首次應(yīng)用顯微鏡注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1981年，美國(guó)科學(xué)家成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國(guó)著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶，含量高達(dá)30毫克/升。

1989年，意大利學(xué)者用精子作為載體轉(zhuǎn)移目的基因，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠。

1997年10月，英國(guó)羅斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。

1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管牛“滔滔”誕生，其體內(nèi)被檢測(cè)到帶有人的血清白蛋白基因，這項(xiàng)成果被評(píng)為當(dāng)年“中國(guó)十大科技進(jìn)展”之一。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究歷史：1974年，美國(guó)學(xué)者Jaenisch首689.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育技術(shù)有：9.1.1基因顯微注射法9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法9.1.3胚胎干細(xì)胞介入法9.1.4精子載體導(dǎo)入法9.1.5YAC介導(dǎo)法9.1.6細(xì)胞核移植技術(shù)9.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育技術(shù)有：699.1.1基因顯微注射法原理通過顯微注射儀把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核內(nèi)部，并使之整合到基因組DNA中，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。9.1.1基因顯微注射法原理709.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：1.目的基因的制備與純化；2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備；3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；4.供體母鼠與公鼠交配；5.受精卵采集；6.目的基因顯微注射；7.受精卵移植；8.目的基因表達(dá)鑒定和檢測(cè)；9.建立遺傳基因小鼠近交系。9.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：711.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：內(nèi)切酶的酶切片段；cDNA;人工合成基因片段；PCR擴(kuò)增特異片段。1.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：722.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備；將輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配可育雌鼠，剌激雌鼠產(chǎn)生一系列一系列妊娠變化反應(yīng)而得到假孕母鼠，做為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母。2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備；將輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交733.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性腺激素（PMSG）以及人絨毛膜促性腺激素(HCG)促使其超排卵。3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性744.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交配。4.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交755.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精卵，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)液保存?zhèn)溆谩?.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精766.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精卵雄性原核內(nèi)。6.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精77顯微注射的機(jī)理受精卵1個(gè)小時(shí)之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原核，不融合，隨著時(shí)間的推移，雄原核開始膨大。注射針要插入雄原核內(nèi)。首先將受精卵置于培養(yǎng)基的液滴內(nèi)，用吸持針找到受精卵并吸持住，調(diào)整雄原核的位置。將注射針裝好DNA溶液，通過調(diào)節(jié)注射管，慢慢將DNA溶液注射進(jìn)入雄原核內(nèi)。顯微注射的機(jī)理受精卵1個(gè)小時(shí)之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原787.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細(xì)胞到桑葚胚階段，自假孕母鼠的背部植入其輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟。7.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細(xì)胞到桑798.目的基因表達(dá)鑒定和檢測(cè)①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交（southern），鑒定外源基因是否整合，有整合的鼠稱為首建鼠（founder）（半合子：目的基因整合在二倍體動(dòng)物的其中一條染色體上

）；②檢測(cè)：通過northern(RNA)andwestern(Pr)雜交在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)表達(dá)。8.目的基因表達(dá)鑒定和檢測(cè)①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA809.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型小鼠雜交，檢測(cè)后代的整合率，取后代有50%機(jī)率帶有整合基因的小鼠(陽性)，近親繁殖，再通過同一窩的陽性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基因的同源重組作用下，最終得到純合子小鼠。9.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型81轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件82轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程83轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程（續(xù)）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程（續(xù)）84轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程85顯微注射法優(yōu)點(diǎn)：外源基因的導(dǎo)入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長(zhǎng)度可>100Kb。它可以直接獲得純系，實(shí)驗(yàn)周期短。顯微注射法不足點(diǎn)：外源基因整合的效率低，不能控制整合的位點(diǎn)，外源基因隨機(jī)結(jié)合或隨機(jī)插入位點(diǎn)，有插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，而且整合的拷貝數(shù)未知，方法較復(fù)雜，技術(shù)性強(qiáng)，設(shè)備昂貴等，基因穩(wěn)定耗時(shí)較長(zhǎng)，效率低。顯微注射法優(yōu)點(diǎn)：86轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件879.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：882.流程（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；（2）包裝細(xì)胞；（3）重組病毒感染早期胚胎；2.流程（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；89（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：病毒DNA提取；病毒DNA克隆到載體；外源目的基因克隆到載體。（1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：90（2）包裝細(xì)胞包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)基因所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時(shí)，該包裝細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA。載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，載體DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，包裝細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白組裝為具有感染性的重組病毒顆粒（位于包裝細(xì)胞內(nèi)）。（2）包裝細(xì)胞包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其91轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件92（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：取出受精卵；去除卵外的透明帶；包裝細(xì)胞（含重組病毒）與受精卵共培養(yǎng)(轉(zhuǎn)染)

；轉(zhuǎn)染后的胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；轉(zhuǎn)基因仔鼠的篩選鑒定（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：93逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：感染效率高；缺點(diǎn)：被導(dǎo)入的外源基因大小受限；感染后引起的安全性存在不確定性。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：949.1.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法1.原理外源DNA導(dǎo)入體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞，把轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞注入受體囊胚并使其分化，再將此囊胚移植到假孕動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。9.1.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法1.原理95流程分離培養(yǎng)ES細(xì)胞；外源基因?qū)隕S細(xì)胞；囊胚期胚胎獲得；通過顯微操作，把ES細(xì)胞注射到胚胎的囊胚腔，形成嵌合體；轉(zhuǎn)基因胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。流程分離培養(yǎng)ES細(xì)胞；96轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件97轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物生物反應(yīng)器課件98胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：在將胚胎干細(xì)胞植入胚胎前，可以在體外選擇特殊的基因型；用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細(xì)胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細(xì)胞用于細(xì)胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。缺點(diǎn)：許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生殖細(xì)胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：999.1.4精子載體導(dǎo)入法1.原理：將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后，使攜帶外源DNA的精子與卵子結(jié)合為受精卵，并使外源DNA整合于合子的染色體中。2.精子攜帶DNA主要是通過三種途徑來完成，即將外源DNA與精子共孵育、電穿孔導(dǎo)入法和脂質(zhì)體傳染法

9.1.4精子載體導(dǎo)入法1.原理：100程序外源基因?qū)刖樱晦D(zhuǎn)基因精子與卵子結(jié)合（通過人工受精，體外受精等）；受精卵移植到假孕動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。程序外源基因?qū)刖樱?01精子介導(dǎo)方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、方便，成本小，依靠生理受精過程，免去了原核的損傷。缺點(diǎn)：成功率不高,效果不穩(wěn)定。精子介導(dǎo)方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1029.1.5酵母人工染色體(YAC)介導(dǎo)法ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染YAC后體外篩選，所得陽性ES細(xì)胞囊胚腔注射；YAC的原核顯微注射兩種途徑。9.1.5酵母人工染色體(YAC)介導(dǎo)法103利用YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的優(yōu)勢(shì)在于保證巨大基因的完整性及所有順式因子的完整并與結(jié)構(gòu)基因的位置關(guān)系不變，且較大的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究時(shí)整合率提高，便于研究。利用YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的優(yōu)勢(shì)在于保證巨大基因的完整性及所有1049.1.6細(xì)胞核移植技術(shù)1.原理轉(zhuǎn)基因技術(shù)與核移植技術(shù)結(jié)合。9.1.6細(xì)胞核移植技術(shù)1.原理1052.程序外源基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞；篩選整合有外源基因的體細(xì)胞作為核供體；轉(zhuǎn)基因供體核移植到去核卵母細(xì)胞；被激活的轉(zhuǎn)基因卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)至囊胚；囊胚移植到假孕母體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因幼子。2.程序外源基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞；1063.該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：后代全為轉(zhuǎn)基因個(gè)體，遺傳背景和遺傳穩(wěn)定性一致；僅需一代即可建立轉(zhuǎn)基因群體，節(jié)約時(shí)間和物力。缺點(diǎn)：技術(shù)不夠完善，成功率低；后代可能出現(xiàn)老化現(xiàn)象。3.該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：后代全為轉(zhuǎn)基因個(gè)體，遺傳背景和遺傳1079.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用2.1在基礎(chǔ)理論方面的應(yīng)用2.1.1可以對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究2.1.2可以進(jìn)行組織表達(dá)特異性研究2.1.3還可以研究發(fā)育過程的特異性表達(dá)。將不同的外源基因轉(zhuǎn)入宿主動(dòng)物受精卵或早期胚胎干細(xì)胞，可觀察研究目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達(dá)、閉關(guān)及調(diào)控機(jī)理。9.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用2.1在基礎(chǔ)理論方面的應(yīng)用1082.2在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用

2.2.1應(yīng)用于動(dòng)物抗病育種轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以用于動(dòng)物抗病育種，不僅可以加速改良的進(jìn)程，使選擇的效率提高，改良的機(jī)會(huì)增多，并且不會(huì)受到有性繁殖的限制.2.2.2應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善品質(zhì)。2.2在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用

2.2.1應(yīng)用1092.3在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.3.l建立診斷和治療人類疾病的動(dòng)物模型。目前，遺傳學(xué)家可以通過精確地失活某些基因或增強(qiáng)某些基因的表達(dá)來制作各種各樣的研究人類疾病的動(dòng)物模型，也可以為研究諸如AIDS這樣的疾病提供合適的動(dòng)物模型。2.3.2用于生產(chǎn)藥用蛋白

目前，把轉(zhuǎn)基因動(dòng)物當(dāng)作生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)受到國(guó)際社會(huì)的極大關(guān)注。2.3.3生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官2.3.4借助轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型開展人類疾病的基因治療。2.3在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.3.l建立診斷1109.2.7轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用

存在的問題及展望

3.l轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低，許多轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)烈地位受著其宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平極低，極少部分基因表達(dá)水平過高。

3.2難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為，轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合于動(dòng)物的基因組中，可能會(huì)引起宿生細(xì)胞染色體的插入突變，還會(huì)造成插入位點(diǎn)的基因片段丟失，插入位點(diǎn)周圍序列的倍增及基因的轉(zhuǎn)移，也可能激活正常狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài)的基因。

3.3難以全面掌握基因的表達(dá)和所受的調(diào)控。不了解哪些基因控制多數(shù)生理過程，不了解基因表達(dá)的發(fā)育控制和組織特異性控制的機(jī)制。

3.4制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率低，這是目前幾乎所有從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的實(shí)驗(yàn)室都面臨的問題，也是制約著這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

3.5對(duì)傳統(tǒng)倫理是一種挑戰(zhàn)，對(duì)人類的生存有一定的負(fù)面作用等。

9.2.7轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用

存在的問題及展望3.l轉(zhuǎn)基因表111外源基因整合方式基因隨機(jī)插入；基因剔除；基因替換；后二者合稱基因打靶。外源基因整合方式基因隨機(jī)插入；112基因隨機(jī)插入外源基因插入時(shí),需要限制性核酸內(nèi)切酶去切宿主的基因,而限制性核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別特定的核酸序列并在特定的位點(diǎn)切開,而宿主的基因里又不止一段這樣的核酸序列,所以會(huì)切出多個(gè)切段出來,所以是隨機(jī)的?；螂S機(jī)插入外源基因插入時(shí),需要限制性核