組織培養(yǎng)技術(shù)1課件

細胞培養(yǎng)技術(shù)碩士研究生選修課程系列Cellculture

DepartmentofmedicalmicrobiologyofHMU2010年9月緒論

細胞培養(yǎng)技術(shù)

2動物細胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基Culturevesselsandmediumforanimalcellculture

體外培養(yǎng)invitro組織培養(yǎng)Tissueculture

細胞培養(yǎng)Cellculture

器官培養(yǎng)Organculture

3細胞培養(yǎng)

CellCulture

用相似方法體外培養(yǎng)單個細胞或單一細胞群，在適宜條件下生長并保持細胞特性，為細胞培養(yǎng)。組織培養(yǎng)人工環(huán)境生存環(huán)境改變細胞移動長時間，反復(fù)傳代細胞培養(yǎng)單一類型細胞“組織特性”

5

器官培養(yǎng)

OrganCulture

應(yīng)用與組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。使用器官原基或器官的一部分或整個器宮

6體外培養(yǎng)種類7概念細胞融合（cellfusion）：在體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學融合劑、病毒或物理方法等誘發(fā)，使不同種的體細胞融合產(chǎn)生一個細胞。細胞雜交(cellhybridization)采用細胞融合方法2個或多個不同的細胞融合，形成新的雜交細胞的過程。8細胞系(cellline)：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系。細胞株(cellstrain)：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的均一特殊性質(zhì)或標志并能穩(wěn)定保持這些特性的細胞群。10細胞一代時間(cellgenerationtime)：單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。如，HeLa需24h，CHO細胞僅需12h。代或世代（generation）從細胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時間。一般3-5天。12單層細胞培養(yǎng)（monolayerculture）培養(yǎng)細胞有貼壁依賴性，在底物上平鋪長成單層細胞。14接觸抑制(contactinhibition)：貼壁生長的體外正常細胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進入S期，也不會出現(xiàn)交叉重疊生長。15懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）細胞或細胞聚集體懸浮于培養(yǎng)液中增殖，這些細胞無依賴于貼附底物或支持物上生長的性質(zhì)。16群體密度（populationdensity）培養(yǎng)皿內(nèi)每單位面積或體積內(nèi)的細胞數(shù)，多用細胞數(shù)/cm2表示或細胞數(shù)/mL表示。17細胞克隆(clone)：用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單個細胞通過有絲分裂形成純系的細胞群，此過程稱為細胞克隆。建立的細胞系稱為克隆細胞株，它們的遺傳特性相同。18二倍體細胞系（diploidcellline）具有兩倍染色單體數(shù)目，既具有二倍體核型的細胞系。有限細胞系（finitecellline）細胞系形成后僅能維持有限傳代次數(shù)，如二倍體細胞大約傳50代。20連續(xù)（無限）細胞系（continuouscellline）具有無限繁殖能力，即獲得了不死性，能反復(fù)進行傳代的細胞系。如傳代細胞系，HeLa細胞。21細胞凋亡（apoptosis）由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)死亡程序開啟而導(dǎo)致的細胞自殺過程，也稱為程序性細胞死亡。23

轉(zhuǎn)染（transfection）用生物學或物理、化學的方法將某細胞的某個基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細胞核內(nèi)的一種實驗手段。24二、發(fā)展史德國人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存活數(shù)月被認為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗。1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細胞生活一月，提示組織或細胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍能生存。261907年Harrison創(chuàng)建了凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，無菌條件下，用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細胞突起的生長過程。建立了體外培養(yǎng)組織和細胞的基本模式。1923年，Carrel設(shè)計了卡式瓶培養(yǎng)法，擴大了組織的生存空間。27

1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染。組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖28我國組織培養(yǎng)的發(fā)展20世紀30年代傳入我國（黃禎祥）。20世紀50年代起步20世紀70年代，成為醫(yī)學和生物學研究中普遍應(yīng)用的手段。30近30年來，建立了人和各種動物腫瘤及其他細胞系，細胞庫，細胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)基、血清、試劑等已商品化。高科技使各種培養(yǎng)用具不斷被引入，電鏡技術(shù)、標記技術(shù)、細胞分選技術(shù)、單細胞顯微注射、熒光免疫、電泳技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、DNA轉(zhuǎn)染、細胞轉(zhuǎn)化、分子雜交等促進細胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展。31三、實驗者需要注意的問題嚴格掌握操作技術(shù)，理解各種操作的基本原理有判定細胞生長好壞和是否發(fā)生污染的能力熟悉體外培養(yǎng)細胞的生存條件、細胞的生物學性狀和相關(guān)的基本理論知識。32各種液體要專人配制，并保證做到按規(guī)程行事；制備濃度精確、滅菌可靠。所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期。組織培養(yǎng)是一種程序比較復(fù)雜、需求條件多而嚴格的實驗性工作。操作程序制定統(tǒng)一規(guī)則，人員相對穩(wěn)定和人人遵守。實驗室管理制度33培養(yǎng)用品要固定存放：培養(yǎng)與非培養(yǎng)用品存放分開；已消毒與未消毒用品嚴格分開目的：避免各種雜質(zhì)混入細胞生存環(huán)境、防止微生物感染和細胞“污染”。細胞污染：不同細胞之間因操作不嚴造成的相互混雜，使細胞群體不純的現(xiàn)象。34四、組織培養(yǎng)優(yōu)缺點優(yōu)點：能長時間直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動；可用于病毒學、細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學等學科的研究。便于觀察、記錄、攝影，直接觀察細胞變化。

353.

可供研究的細胞種類廣泛：低等生物到高等動物及人類細胞；胚胎到成體；正常組織到腫瘤細胞。

4.便于使用不同方法研究細胞：相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡；組織化學法、免疫法和同位素標記等。36易于施加物理、化學和生物因素進行實驗培養(yǎng)細胞攜帶有與體內(nèi)細胞同等的基因組，也是分子生物學和基因工程學的研究對象?？赏瑫r提供大量生物性狀相似的實驗對象，耗資少，經(jīng)濟。已成為生物制品、基因工程制品、單克隆抗體生產(chǎn)的必要手段37

局限性

組織和細胞離體以后，獨立生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，與體內(nèi)環(huán)境相比，仍有很大差異。實驗結(jié)果不能完全代表體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。

38組織培養(yǎng)基本理論知識組織培養(yǎng)技術(shù)第一章39一、組織培養(yǎng)細胞生物學40

體內(nèi)外細胞的差異細胞在體外培養(yǎng)后，失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化。培養(yǎng)細胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)、分化減弱或不顯、出現(xiàn)類似“返祖現(xiàn)象”；細胞趨向單一化，或獲得不死性，或變成惡性細胞群。41

可能的機制：

體內(nèi)細胞高度分化，細胞間有高度的相互依存性、個體細胞相對失去獨立性。從受精卵形成開始，細胞有增殖和分化兩個過程。增殖使細胞數(shù)量增多，分化使機體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最終形成完整人體。細胞的生命活動，是外源信號通過相關(guān)基因的調(diào)控，使之發(fā)生增殖或分化的表達。細胞離體培養(yǎng)后，信號來源切斷，特定基因分化表達減弱或停止。但進化中保守的細胞增殖活動可維持；使體內(nèi)外細胞出現(xiàn)了差異。42

培養(yǎng)細胞的分化不適應(yīng)deadaption細胞的分化特性減弱或不表現(xiàn)，如干細胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性的喪失。主要因環(huán)境改變所致。細胞在體外培養(yǎng)時間越長，分化改變越大；細胞剛離體培養(yǎng)時，可能不適應(yīng)，即由于環(huán)境的改變而出現(xiàn)的變化。生存條件的改變使分化發(fā)生阻抑；43去分化dedifferentiation細胞失掉分化的能力

如肝臟細胞，當肝細胞失去產(chǎn)生精氨酸酶、氨基轉(zhuǎn)移酶等特性后，則失掉儲存肝糖原能力，并很難再現(xiàn)。去分化可能是基因變異所致。44

體外培養(yǎng)細胞有分化潛能

脊髓細胞來源中樞和遺傳性狀的不同，很多細胞有一定程度的分化表達現(xiàn)象。如毛細血管內(nèi)皮細胞在初代培養(yǎng)和接種在類似基膜物質(zhì)底物上時，可形成類似血管樣結(jié)構(gòu)。說明與體內(nèi)條件越近似，細胞越易發(fā)生分化。細胞離體培養(yǎng)時間越長，分化能力越差，在體外生存時間與其分化能力成反向關(guān)系。45

體外培養(yǎng)時，細胞分化的表達形式變化因環(huán)境的改變，細胞分化的表達形式也會發(fā)生與體內(nèi)不同的變化。如二倍體成纖維細胞，在體外可傳30-50代，相當于150-300個細胞周期，最后衰老死亡，呈現(xiàn)著生命發(fā)展分化過程。闡明細胞分化機制意義是了解癌變機理和攻克癌癥的核心問題培養(yǎng)細胞是研究分化最理想的實驗對象。46有分化特性的細胞系和細胞株組織來源細胞系增殖性物種分化特性脾Friend永生小鼠合成血紅蛋白Morris肝癌HTC永生大鼠酪氨酸轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)髓性白血病K562永生人合成血紅蛋白垂體瘤GH2,GH3永生大鼠產(chǎn)生生長激素黑色素瘤B16永生小鼠產(chǎn)生色素髓性白血病HL60永生人合成球蛋白膠質(zhì)瘤CCM永生人膠質(zhì)纖維酸性蛋白成神經(jīng)細胞瘤C1300永生大鼠生長軸突47

培養(yǎng)細胞形態(tài)分類貼附型能貼附在支持物表面生長。大多數(shù)培養(yǎng)細胞呈貼附性生長；只依賴于貼附才能生長。貼附后，易失去其原有的特征，細胞分化現(xiàn)象常不顯著。在形態(tài)上表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反應(yīng)其胚層起源，呈現(xiàn)類似“返祖現(xiàn)象”。成纖維型細胞、上皮型細胞、游走型細胞及多形型細胞48

成纖維型細胞：細胞體呈梭形或三角形，卵圓形核，胞質(zhì)伸出2-3個長短不同的突起。細胞多呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行。包括成纖維細胞，中胚層間充質(zhì)起源組織（心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等）細胞培養(yǎng)類型49

（2）上皮型細胞扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細胞緊密相連成單層膜。起源于內(nèi)、外胚層細胞（皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮）50

（3）游走型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快而且不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定51

（4）多形型細胞神經(jīng)組織細胞：有時呈多角形，有時伸出較長纖維。52CHO細胞培養(yǎng)53

懸浮型胞體為圓形懸浮在培養(yǎng)液中生長，生存空間大，容許長時間生長，能繁殖多量細胞，便于做細胞代謝等研究。血液細胞、某些癌細胞54

培養(yǎng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)大體形態(tài)：液體環(huán)境中，胞體呈圓形；當貼附于支持物表面后，開始為圓形，很快成扁平形態(tài)。細胞大體形態(tài)可隨支持物的構(gòu)型而改變。普通光鏡下，細胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。相差顯微鏡可看清細胞的輪廓和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。固定染色法和特殊技術(shù)可顯示細胞器等結(jié)構(gòu)。

55

超微結(jié)構(gòu)：電鏡下可見細胞膜、細胞核、細胞器等。細胞外衣：細胞膜表面常附有由細胞分泌物形成的糖蛋白膜，對細胞的運動和貼附有作用。用胰蛋白酶消化處理細胞，能改變其性質(zhì)，使細胞易從支持物上脫落下來。56

培養(yǎng)細胞生長與增殖過程傳代

passage/subculture：當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存。（1）組織培養(yǎng)細胞生命期（2）組織培養(yǎng)細胞一代生存期（潛伏期、指數(shù)增生期、衰退期）57（1）組織培養(yǎng)細胞生命期初代培養(yǎng)期

primaryculture從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。形態(tài)相似。細胞群是異質(zhì)的，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。Lifespanofculturecells58傳代培養(yǎng)期初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后稱為細胞系。此期為三期最長者?？删S持二倍體核型，即二倍體細胞系。當傳代30-50代后，細胞增殖逐漸緩慢，至完全停止。衰退期細胞仍然生存，增殖慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡59

少數(shù)情況下，在3個時期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），細胞可能會發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標志：細胞獲得永生性（或持久性增殖能力），核型多變成異倍體606162（2）組織培養(yǎng)細胞一代生存期細胞一代從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間。為培養(yǎng)工作中的習慣說法63

潛伏期：懸浮狀態(tài)，胞體呈圓球形。接著是貼附在底物表面上，稱為貼壁，貼壁后變成極性細胞。0-24小時64

指數(shù)增生期：增殖旺盛，是進行實驗最好和最主要的階段。接觸抑制密度抑制：培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)不足和代謝物的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。65

停滯期細胞數(shù)量持平，無增埴活動，但有代謝活動。此時需傳代。66體外培養(yǎng)細胞一代增殖生長過程67

培養(yǎng)細胞增殖動力學人體細胞有兩種基本狀態(tài)：增殖態(tài)、功能態(tài)細胞存在形式和細胞增殖周期關(guān)系68

有絲分裂G1期：

DNA合成前期，蛋白質(zhì)合成、RNA合成，胞體逐漸增大。S期：DNA合成期，此期易受致突變或致癌因素作用；遺傳物質(zhì)易受致突變物損傷。G2期：細胞分裂前期，對外界環(huán)境敏感，易受影響不能進入M期。M期：細胞有絲分裂期G1期S期G2期M期細胞周期（一）增殖態(tài)Proliferationstate69

細胞進行特定功能活動如分泌、傳導(dǎo)、吞噬、收縮等的時期，是細胞的第二種生存狀態(tài)。是兩次增殖周期間的間期，或稱G0期。

體外培養(yǎng)細胞屬活躍增殖細胞，在培養(yǎng)液中營養(yǎng)充分條件下，可反復(fù)進行增殖活動。

正常細胞增殖，須提供生長因子；惡性轉(zhuǎn)化細胞可自泌生長因子，降低了血清需求。（二）功能態(tài)Functionalstate70

培養(yǎng)細胞遺傳學特征核型變化：初代培養(yǎng)時為二倍體細胞，傳代后可長期保持二倍體狀態(tài)為主。經(jīng)過長期傳代后，會偏離二倍體呈多倍體和異倍體長期不用或新引入的細胞應(yīng)做定期核型檢查

71永生化及惡變正常細胞主要特征：二倍體核型；增殖生長期有限細胞永生化也稱不死性。惡變：有惡性細胞特征，能長期增殖生長；有異體接種致瘤性

72細胞型別女性的一條X染色體在間期呈異固縮狀態(tài)，呈三角形或半月狀小體緊附在核膜內(nèi)面，稱巴氏小體；男性Y染色體在間期則形成顆粒狀Y小體，位于胞核的近中央部位。用特殊染色法可顯現(xiàn)出巴氏體和Y小體。73

細胞間、細胞與基質(zhì)間的關(guān)系

在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，在一定條件下，單個細胞也能生存和增殖生長，表現(xiàn)有很大的獨立性。一個有活力的細胞經(jīng)過繁殖形成群體，群體細胞才是培養(yǎng)細胞的基本存在形式。在生理活動上，群體細胞生存力強，細胞量多時比少時易于培養(yǎng)，說明細胞之間能相互溝通信息。74二、細胞生存條件及代謝75無污染的環(huán)境無毒和無菌培養(yǎng)環(huán)境是保證培養(yǎng)細胞生存的首要條件。細胞被置于體外培養(yǎng)后，失去了對微生物和有毒物質(zhì)的防御能力，一旦被污染或自身代謝物積累等，可導(dǎo)致細胞死亡。（一）基本條件76

適宜溫度人體細胞的適宜溫度為36.5℃+0.5℃，偏離時，會影響細胞代謝，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力比對高溫強。溫度≥0℃時，對細胞代謝有影響，但無損傷作用；培養(yǎng)液中加一定量的保護劑（甘油或二甲基亞砜），凍存于液氮中，能長期儲存。保存細胞最主要的手段。77溫度對細胞生長的影響

78

氣體和pH值O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。多數(shù)細胞缺氧不能生存。開放培養(yǎng)時（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)），一般置于95%的空氣加5%CO2混合氣體環(huán)境中。CO2既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，作用是維持培養(yǎng)基的pH值，細胞要求7.2-7.4CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-79

維持培養(yǎng)基恒定pH的方法：為維持培養(yǎng)液的恒定pH值（7.2-7.4），常用磷酸鹽緩沖液（Hanks）的方法。用5.6﹪NaHCO3調(diào)pH，適用于封閉式培養(yǎng)。在堿性環(huán)境中時間過長細胞易堿中毒；開放式培養(yǎng)時，在5%CO2的培養(yǎng)箱中；也可用羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），對細胞無毒性，不起緩沖作用，主要防止pH值的迅速變動，其優(yōu)點是在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pH值。

80

營養(yǎng)物質(zhì)糖、無機鹽氨基酸、維生素促細胞生長因子牛血清是提供生長因子和細胞所需物質(zhì)的來源滲透壓(滲透單位)離子強度：260-320mOsm/L培養(yǎng)基81

人工培養(yǎng)基按物質(zhì)形態(tài)分：液體及半固體培養(yǎng)基（軟瓊脂）按來源分：合成培養(yǎng)基syntheticmedium根據(jù)細胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量合成天然培養(yǎng)基naturalmedium加入天然成分如人或動物的血清、血漿和胎汁等，當前主要使用牛血清。血清中有多種促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)等。細胞培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基中，不能很好生長增殖；加入5%血清時，大多細胞可緩慢生長。一般需加10-20%的血清，細胞能很好生長。血清要保證質(zhì)量。無血清培養(yǎng)基82附著物玻璃優(yōu)點：透明、便于觀察、易洗滌、能反復(fù)使用等，中性玻璃最好，適合各種細胞附著生長。缺點為易碎。聚苯乙烯疏水性，光潔平坦，用于培養(yǎng)正常細胞、無限細胞系、轉(zhuǎn)化細胞和腫瘤細胞生長均可。微載體聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球體凡對細胞無毒性的物質(zhì)都可用作底物，不同細胞對底物要求各異。83（二）體外培養(yǎng)成功率關(guān)鍵在初代培養(yǎng)“培養(yǎng)成功”的定義：

不論用細胞消化分散法或組織塊培養(yǎng)法進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)物必須能貼附在底物上，繼而細胞才能發(fā)生運動、生長增殖、細胞數(shù)量增多

擴大再培養(yǎng)84供體條件培養(yǎng)條件不同細胞選用相應(yīng)的培養(yǎng)基貼附底物貼附是細胞增殖生長的條件。尤其對初代培養(yǎng)更重要培養(yǎng)方法選擇適宜的消化法和培養(yǎng)法85三、細胞系或細胞株的建立

各種已被命名和經(jīng)過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株，是形態(tài)比較均一、生長增殖比較穩(wěn)定、生物學性狀清楚的細胞群。86初代培養(yǎng)細胞（原代）直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。（一）培養(yǎng)細胞的種類及命名87傳代細胞系：初代培養(yǎng)物從第一次傳代培養(yǎng)的細胞，即為細胞系。如細胞系的生存期有限，稱為有限細胞系；已獲無限繁殖能力可持續(xù)生存的細胞系，稱無限細胞系特點：核發(fā)生異倍化，有異倍體核型；有永生性；但無異體接種致瘤性88克隆細胞株從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單個細胞增殖形成的細胞群，稱克隆細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原細胞株性狀不同的細胞群，稱亞株（subunit）。89二倍體細胞細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同的細胞群。屬有限細胞系，壽命長短各異，人胚肺成纖維細胞可傳50+10代，人胚腎只有8-10代。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2-5代即大量凍存作為原種，用時再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用和延緩細胞的衰老。90遺傳缺陷細胞從先天缺陷者取材培養(yǎng)的細胞先天或人工誘變（2n或異倍）91腫瘤細胞系（株）現(xiàn)有細胞系中最多的一類，多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性；有異體接種致瘤性。舉例：HeLa

名源于供體患者姓名CHO中國地鼠卵巢細胞NIH3T3美國國立衛(wèi)生院建立宮-743：宮頸癌上皮細胞92記錄要求：組織來源、細胞生物學檢測、培養(yǎng)條件和方法鑒定、管理和使用按國際慣例，在雜志或刊物上報道，詳細介紹。各國管理中心、細胞庫美國標準細胞庫ATCC人遺傳突變細胞庫HGMR細胞衰老細胞庫CAR（二）細胞株建立要求及管理93ATCC入庫細胞要求檢測項目（基本要求）：

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、供體情況、細胞傳代情況等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱、血清來源和含量

94細胞形態(tài)：類型

核型：二倍體或多倍體，標記染色體的有無

無誤染測驗：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等

物種鑒定：查同工酶，主要為G6PD和LDH，查細胞有否交叉污染

免疫檢測：一兩種血清學檢測

細胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名95組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)第二章96一、在病毒學研究中的應(yīng)用97HIVattacksahumantissuecell

981.檢測病毒病毒的增殖

分離病原體的重要手段，還為研究病毒的親細胞性和親組織性提供了非常方便的方法。增殖指標：CPE、pH變化、包涵體等病毒定量：PFU、TCID50病毒和細胞間關(guān)系致病機理99CPE正常細胞病變細胞100

Microscopicviewofcytopathiceffect(giantcellformation)atday5afterinfectionofU87.CD4.CCR5.CXCR4cellswiththeclinicalisolates,whicheachhaveadifferentcoreceptoruseasshownbetweenbrackets.Uninfectedcellsareshownasthenegativecontrol(upperrow).

Notetheenormousgiantcellformationintheuntreatedvirus-infectedcellcultureswhereassuchcytopathiceffectistotallyabsentininfectedcellsexposedtoa1:1combinationofSCH-CandAMD3100at1000ng/ml.Independently,SCH-CandAMD3100preventedgiantcellformationincellculturesinoculatedwithR5HIV-1andX4HIV-1,respectively,butnotincellculturesinfectedwiththedualtropicR5/X4HIV-1isolate101病毒檢驗方法病毒培養(yǎng)全程5-30天病毒培養(yǎng)：1.細胞培養(yǎng)2.接種至細胞細胞病變判定熒光或酶染色：1.病毒涂片2.血清型特異抗體熒光染色核酸檢測：PCR或雜交中和試驗：培養(yǎng)出的病毒與特異性抗血清作用，再接種至細胞102103

2.病毒性感染的血清學診斷中和試驗血凝試驗ELISA蛋白印跡（Westernblot）3.腫瘤病毒致癌機理的研究（轉(zhuǎn)化）生物學性狀細胞遺傳學特征惡性浸潤測試1044.體外抗病毒藥效實驗分為體內(nèi)實驗和體外實驗體外試驗是采用組織細胞培養(yǎng)法來觀察藥物的抗病毒作用；根據(jù)藥物的特性選擇病毒，根據(jù)病毒對細胞易感性選擇細胞，根據(jù)CPE作為判定藥物的藥效指標。105

5.在病毒受體及致病機制研究方面應(yīng)用病毒受體的研究：確定某種病毒對細胞的親嗜性；確定敏感細胞表面對該種病毒的特異性受體；病毒與相應(yīng)受體結(jié)合的生化基礎(chǔ)與動力學改變，包括結(jié)合方式及結(jié)合后細胞發(fā)生的生理功能變化；病毒受體的純化；病毒受體基因構(gòu)件及表達等。106

主要應(yīng)用的技術(shù)方法：雜交瘤技術(shù)制備細胞表面受體的單克隆抗體，用單克隆抗體封閉或阻斷病毒與細胞受體的結(jié)合研究兩者結(jié)合的特異性。利用合成肽與受體進行競爭性結(jié)合，研究病毒受體的結(jié)構(gòu)及作用部位。107利用人工合成多肽、序列刪除、氨基酸置換等方式模擬病毒配體與細胞病毒受體、輔助受體及其他分子的作用機制。利用酶的作用去除細胞表面的受體，觀察對病毒吸附細胞、傳入細胞的影響。108

分離和純化病毒受體。利用病毒受體蛋白免疫血清的細胞保護性實驗，研究病毒受體抗血清對病毒受體的阻斷作用。利用克隆技術(shù)克隆病毒受體的基因，再利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使受體缺陷型細胞獲得特異性受體，再用病毒感染細胞驗證受體的存在。利用X射線衍射技術(shù)直接獲得病毒與受體結(jié)合的過程。1096.培養(yǎng)方法研究病毒學的優(yōu)點：沒有隱性感染，避免體內(nèi)實驗的假陽性或假陰性結(jié)果。沒有免疫抵抗力可選出適宜培養(yǎng)方法可以選擇出最易感的細胞進行研究可增加接種量110獲取減毒株或無毒株較其他方法容易大規(guī)模制備病毒疫苗，可提高產(chǎn)量，降低成本，還可以使培養(yǎng)液中的異性蛋白減低至最低限度,提高疫苗質(zhì)量?？煽焖俜蛛x鑒定病毒，發(fā)現(xiàn)新病毒，如2003年SARS-CoV的發(fā)現(xiàn),2009年發(fā)現(xiàn)新甲型流感病毒H1N1。111SARS-CoV電鏡照片病毒顆粒呈不規(guī)則形，具有多形性。直徑多為60～120nm，有包膜，其包膜表面有放射狀排列的突起，形如王冠（vero-E6細胞）.112二、在免疫學研究中的應(yīng)用1131.免疫細胞檢測免疫細胞分離培養(yǎng)技術(shù)單個核細胞：Ficoll分層液DC：CSF、IL-4、IFN刺激分化、成熟NK：抗T、B的抗體T細胞：E-花環(huán)沉淀B細胞：除E-花環(huán)沉淀114淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗混合淋巴細胞培養(yǎng)（ＭＬＣ）

HLA抗原不同，轉(zhuǎn)化率判斷差異性抗體產(chǎn)生細胞檢測115Hybridomas2.雜交瘤技術(shù)116

雜交瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)

利用大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)抗體，可提高產(chǎn)量、簡化工藝、降低成本，還可提高抗體質(zhì)量。117單克隆抗體制備流程：用特異抗原免疫實驗動物取含大量B細胞的脾細胞

鼠骨髓瘤細胞

細胞融合

篩選雜交瘤細胞

生產(chǎn)單克隆抗體118雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖1193.細胞因子檢測技術(shù)IL-1活性測定IL-1和小鼠的胸腺細胞共同培養(yǎng)（含有適量的如PHA類的絲裂原），IL-1可刺激小鼠胸腺細胞增殖（H-TdR）。通常選用C3H/HeJ品系鼠。120

IL-2活性測定IL-2的生物活性測定需要穩(wěn)定、敏感的IL-2測定細胞?？煞謨深悾阂皇荌L-2依賴性細胞株(CTLL-1,CTLL-2)。只有在IL-2存在培養(yǎng)才能生長，否則24hr內(nèi)死亡；二是新鮮制備的對IL-2有反應(yīng)的淋巴母細胞，這類細胞在IL-2存在下培養(yǎng)時生長力增強，但無IL-2時并不死亡，此方法可替代第一類IL-2檢測法。在培養(yǎng)過程中，加入待測樣品，如果細胞能夠生長，表明待測標本中有IL-2。121IFN活性測定原理：IFN-α,β均具有抗病毒活性。當未加IFN的對照孔出現(xiàn)75%-100%細胞病變；未加病毒的細胞對照無病變時；而某一稀釋度IFN標本的有50%細胞不出現(xiàn)病變；則表示該樣品內(nèi)含有保護細胞的足量IFN，其稀釋度即為標本中含有的IFN效價。122TNF的檢測方法TNF細胞毒性測定是根據(jù)它對某些細胞株的直接殺傷作用，如小鼠成纖維細胞系L929、WEHI164、小鼠結(jié)締組織細胞L-M等。TNF能使敏感靶細胞發(fā)生形態(tài)上的改變，直至死亡。常采用的細胞毒性法是通過靶細胞被殺傷的程度測定TNF活性（染色法或同位素法）。123

4.HLA檢測HLA抗體篩選技術(shù)淋巴細胞毒交叉配合實驗：常用于移植檢測。受體血清中如存在抗淋巴細胞抗體，在補體存在的情況下可破壞供體淋巴細胞。加入染料，死細胞被染料染色而活細胞抗拒染色為無色，計數(shù)被染色的死細胞數(shù)，從而判定有無抗淋巴細胞抗體的存在。124

HLA抗原單克隆抗體分型技術(shù)具有高度多態(tài)性的HLA糖蛋白大多表達在有核細胞的表面。應(yīng)用微量淋巴細胞毒技術(shù)，將PBMC與抗HLA特異性抗體（同種抗血清或單克隆抗體）及兔補體混合培養(yǎng)，計數(shù)死亡細胞比例來判斷結(jié)果。PCR分型技術(shù)根據(jù)HLA基因多態(tài)性，電泳RFLP-PCR

限制性片段長度多態(tài)性，電泳圖125三、在分子生物學研究中的應(yīng)用1261.體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化細胞自發(fā)轉(zhuǎn)化人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化BHK-21,NIH/3T3,Rat-1,PC-12誘發(fā)因素：化學、物理、病毒、癌基因1272.DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞融合、顯微注射染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染（體細胞）轉(zhuǎn)基因（生殖細胞）磷酸鈣、電擊、脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法、其他DEAE-葡聚糖法個體發(fā)育、檢測目的基因表達（轉(zhuǎn)基因技術(shù)）1283.基因診斷和基因治療原位修復(fù)有缺陷的基因基因替代療法重新開放已關(guān)閉的基因?qū)牖颍╬53,RB）封閉基因（反義RNA）129四、在遺傳學研究中的應(yīng)用1301、性染色體的檢測間期細胞核內(nèi)女性X和男性Y染色體均可特殊染色。女性兩條X染色體中的一個，因失活間期時染色質(zhì)呈異固縮、深染小體，稱巴氏小體(Barrbody)。位于細胞核內(nèi)面，呈三角形或半月形，易被炭酸復(fù)紅著色。正常女性巴氏體陽性,男性為陰性。初代培養(yǎng)細胞和二倍體細胞株均可觀察到性染色質(zhì)。男性Y染色體位于間期細胞核近中央部，熒光染色發(fā)較強熒光，呈點狀小體，發(fā)光部分為Y染色體異固縮的長臂,Y小體，也稱熒光小體。1311322、培養(yǎng)細胞染色體顯示染色體顯示主要是顯示分裂中期細胞。因細胞分裂處于中期時，染色體的長短和大小適合，是研究染色體的最好階段。準備工作的原則：獲得多量的中期分裂相分散密集并相互纏繞的46條染色體133

措施：提高細胞分裂相數(shù)刺激細胞增殖：PHA阻抑中期分裂：秋水仙素促染色體分散措施低滲處理：低滲鹽溶液醋酸固定：膨脹固定組織細胞，和醇類混合固定有利于染色體松散效應(yīng)。1343、染色體結(jié)構(gòu)顯帶和檢測染色體顯帶、染色體脆性部位的檢測、微核檢測4、染色體基因定位核素標記原位雜交基因定位技術(shù)熒光標記原位雜交基因定位技術(shù)5、染色體顯微切割法（染色體區(qū)段）135五、在藥理學研究中的應(yīng)用136（一）測定藥物對培養(yǎng)細胞生長影響1、繪制生長曲線的細胞培養(yǎng)實驗繪制培養(yǎng)細胞的生長曲線計數(shù)細胞增長的絕對數(shù)值，可直觀了解細胞生長與死亡的動態(tài)變化。常用于檢測各種藥物、培養(yǎng)液的成分和血清等對細胞生長的影響。1372、成集落的細胞培養(yǎng)實驗成集落細胞培養(yǎng)實驗，也稱集落形成實驗。是檢驗培養(yǎng)細胞增殖情況的可靠方法，該方法比生長曲線、分裂指數(shù)測定方法的準確性高。細胞被制成分散的懸液后，接種到底物上，能貼壁生長，形成集落，計數(shù)集落。1383、有絲分裂指數(shù)測定的細胞培養(yǎng)實驗細胞有絲分裂指數(shù)(MI)是指屬于分裂期的細胞占總細胞數(shù)的百分率。用于表達細胞增殖旺盛的程度，也可檢測藥物對細胞增殖能力的影響。用蓋玻片培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞，做固定和染色后，鏡下觀察和計算1000個細胞中處于分裂期的細胞數(shù)并計算MI。1394、縮時電影顯微攝像術(shù)的細胞培養(yǎng)實驗可直接記錄培養(yǎng)細胞的運動、分裂情況，計算細胞周期。也可拍攝培養(yǎng)細胞的活動情況，記錄藥物處理后細胞行為和胞質(zhì)內(nèi)細微結(jié)構(gòu)的改變。其優(yōu)點是可供反復(fù)研究和分析。1405、培養(yǎng)的心肌細胞收縮活動和動作電位記錄實驗心肌細胞在培養(yǎng)十幾小時后，單個細胞就以各自的節(jié)律開始搏動。隨著心肌細胞的不斷生長，細胞之間相互交織，形成連接，這是心肌細胞傳導(dǎo)電興奮的基礎(chǔ)，這是細胞的搏動同步化。應(yīng)用光電轉(zhuǎn)換裝置和細胞內(nèi)動作電位記錄技術(shù)可同時記錄心肌細胞的搏動和動作電位。141（二）培養(yǎng)細胞的膜片鉗技術(shù)膜片鉗：將尖端直徑僅1微米的玻璃微電極吸附到細胞膜表面上，對微電極內(nèi)施加負壓，微電極與細胞膜形成高于10G歐姆的高阻封接，可記錄到膜上pA級的離子通道電流?？捎糜谘芯侩x子通道與受體分子結(jié)構(gòu)和功能，廣泛用于神經(jīng)生物學、生理學、藥理學等各個領(lǐng)域。142（三）心肌細胞培養(yǎng)藥理學應(yīng)用觀察藥物對心肌細胞的直接作用及對活細胞影響的動態(tài)過程；可研究心肌細胞的離子轉(zhuǎn)運及在藥物影響下所發(fā)生的變化；可建立不同的心肌細胞損傷的模型，以探討藥物的作用機制。具有簡便、快捷、準確、節(jié)約動物和藥品的特點，可提高科研的效率和水平。143（四）體外細胞培養(yǎng)測定藥效優(yōu)點：已建的細胞系（株）提供大量的遺傳特性均一或相似的細胞來源，使藥物篩選研究工作穩(wěn)定、方便、經(jīng)濟?？蓽蚀_控制藥物作用的對象、作用時間和劑量以及細胞的生長條件。將待檢測藥物或其他化合物直接加到培養(yǎng)系統(tǒng)中，使之直接與效應(yīng)細胞相接觸。144

不足：體外檢測的細胞生長環(huán)境簡單而體內(nèi)復(fù)雜進行活性檢測時，比較容易和適宜于單質(zhì)藥物，水溶性藥物較容易。145適用范圍：

較適宜于研究抗癌藥物和能夠致畸、致癌、致突變的化合物及抗病毒藥物細胞選擇選擇適當?shù)男?yīng)細胞和對照細胞結(jié)果觀察：形態(tài)學觀察、細胞生物學檢測、生物化學測定、分子生物學檢測以及細胞死亡評價等方面。146

藥效測定法抗病毒藥效測定抗癌藥效測定

147六、在組胚與細胞生物學中的應(yīng)用148器官培養(yǎng)與發(fā)育分化研究體外培養(yǎng)整個胚胎的生長發(fā)育胚胎致畸作用的研究器官的功能及其代謝的研究149器官移植中的應(yīng)用器官細胞的體外培養(yǎng)胚胎干細胞的體外培養(yǎng)造血干細胞的體外培養(yǎng)其他器官細胞的體外培養(yǎng)150

細胞生物學上的應(yīng)用：細胞形態(tài)學：借助體外培養(yǎng)技術(shù)與顯微縮時電影技術(shù)結(jié)合，觀察到許多細胞生長行為。細胞生理學：確定培養(yǎng)細胞的營養(yǎng)需求，建立培養(yǎng)基的合理配方