組織培養(yǎng)技術(shù)1課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)碩士研究生選修課程系列Cellculture

DepartmentofmedicalmicrobiologyofHMU2010年9月緒論

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基Culturevesselsandmediumforanimalcellculture

體外培養(yǎng)invitro組織培養(yǎng)Tissueculture

細(xì)胞培養(yǎng)Cellculture

器官培養(yǎng)Organculture

3細(xì)胞培養(yǎng)

CellCulture

用相似方法體外培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞或單一細(xì)胞群，在適宜條件下生長(zhǎng)并保持細(xì)胞特性，為細(xì)胞培養(yǎng)。組織培養(yǎng)人工環(huán)境生存環(huán)境改變細(xì)胞移動(dòng)長(zhǎng)時(shí)間，反復(fù)傳代細(xì)胞培養(yǎng)單一類型細(xì)胞“組織特性”

5

器官培養(yǎng)

OrganCulture

應(yīng)用與組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法。使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器宮

6體外培養(yǎng)種類7概念細(xì)胞融合（cellfusion）：在體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)融合劑、病毒或物理方法等誘發(fā)，使不同種的體細(xì)胞融合產(chǎn)生一個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞雜交(cellhybridization)采用細(xì)胞融合方法2個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞融合，形成新的雜交細(xì)胞的過(guò)程。8細(xì)胞系(cellline)：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系。細(xì)胞株(cellstrain)：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的均一特殊性質(zhì)或標(biāo)志并能穩(wěn)定保持這些特性的細(xì)胞群。10細(xì)胞一代時(shí)間(cellgenerationtime)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時(shí)間間隔。如，HeLa需24h，CHO細(xì)胞僅需12h。代或世代（generation）從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時(shí)間。一般3-5天。12單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayerculture）培養(yǎng)細(xì)胞有貼壁依賴性，在底物上平鋪長(zhǎng)成單層細(xì)胞。14接觸抑制(contactinhibition)：貼壁生長(zhǎng)的體外正常細(xì)胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進(jìn)入S期，也不會(huì)出現(xiàn)交叉重疊生長(zhǎng)。15懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于培養(yǎng)液中增殖，這些細(xì)胞無(wú)依賴于貼附底物或支持物上生長(zhǎng)的性質(zhì)。16群體密度（populationdensity）培養(yǎng)皿內(nèi)每單位面積或體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，多用細(xì)胞數(shù)/cm2表示或細(xì)胞數(shù)/mL表示。17細(xì)胞克隆(clone)：用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單個(gè)細(xì)胞通過(guò)有絲分裂形成純系的細(xì)胞群，此過(guò)程稱為細(xì)胞克隆。建立的細(xì)胞系稱為克隆細(xì)胞株，它們的遺傳特性相同。18二倍體細(xì)胞系（diploidcellline）具有兩倍染色單體數(shù)目，既具有二倍體核型的細(xì)胞系。有限細(xì)胞系（finitecellline）細(xì)胞系形成后僅能維持有限傳代次數(shù)，如二倍體細(xì)胞大約傳50代。20連續(xù)（無(wú)限）細(xì)胞系（continuouscellline）具有無(wú)限繁殖能力，即獲得了不死性，能反復(fù)進(jìn)行傳代的細(xì)胞系。如傳代細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞。21細(xì)胞凋亡（apoptosis）由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)死亡程序開(kāi)啟而導(dǎo)致的細(xì)胞自殺過(guò)程，也稱為程序性細(xì)胞死亡。23

轉(zhuǎn)染（transfection）用生物學(xué)或物理、化學(xué)的方法將某細(xì)胞的某個(gè)基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細(xì)胞核內(nèi)的一種實(shí)驗(yàn)手段。24二、發(fā)展史德國(guó)人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存活數(shù)月被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗(yàn)。1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細(xì)胞生活一月，提示組織或細(xì)胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍能生存。261907年Harrison創(chuàng)建了凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，無(wú)菌條件下，用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程。建立了體外培養(yǎng)組織和細(xì)胞的基本模式。1923年，Carrel設(shè)計(jì)了卡式瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織的生存空間。27

1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染。組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖28我國(guó)組織培養(yǎng)的發(fā)展20世紀(jì)30年代傳入我國(guó)（黃禎祥）。20世紀(jì)50年代起步20世紀(jì)70年代，成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中普遍應(yīng)用的手段。30近30年來(lái)，建立了人和各種動(dòng)物腫瘤及其他細(xì)胞系，細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)基、血清、試劑等已商品化。高科技使各種培養(yǎng)用具不斷被引入，電鏡技術(shù)、標(biāo)記技術(shù)、細(xì)胞分選技術(shù)、單細(xì)胞顯微注射、熒光免疫、電泳技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、DNA轉(zhuǎn)染、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、分子雜交等促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展。31三、實(shí)驗(yàn)者需要注意的問(wèn)題嚴(yán)格掌握操作技術(shù)，理解各種操作的基本原理有判定細(xì)胞生長(zhǎng)好壞和是否發(fā)生污染的能力熟悉體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件、細(xì)胞的生物學(xué)性狀和相關(guān)的基本理論知識(shí)。32各種液體要專人配制，并保證做到按規(guī)程行事；制備濃度精確、滅菌可靠。所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標(biāo)簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期。組織培養(yǎng)是一種程序比較復(fù)雜、需求條件多而嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)性工作。操作程序制定統(tǒng)一規(guī)則，人員相對(duì)穩(wěn)定和人人遵守。實(shí)驗(yàn)室管理制度33培養(yǎng)用品要固定存放：培養(yǎng)與非培養(yǎng)用品存放分開(kāi)；已消毒與未消毒用品嚴(yán)格分開(kāi)目的：避免各種雜質(zhì)混入細(xì)胞生存環(huán)境、防止微生物感染和細(xì)胞“污染”。細(xì)胞污染：不同細(xì)胞之間因操作不嚴(yán)造成的相互混雜，使細(xì)胞群體不純的現(xiàn)象。34四、組織培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：能長(zhǎng)時(shí)間直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)；可用于病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等學(xué)科的研究。便于觀察、記錄、攝影，直接觀察細(xì)胞變化。

353.

可供研究的細(xì)胞種類廣泛：低等生物到高等動(dòng)物及人類細(xì)胞；胚胎到成體；正常組織到腫瘤細(xì)胞。

4.便于使用不同方法研究細(xì)胞：相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡；組織化學(xué)法、免疫法和同位素標(biāo)記等。36易于施加物理、化學(xué)和生物因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞攜帶有與體內(nèi)細(xì)胞同等的基因組，也是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對(duì)象?？赏瑫r(shí)提供大量生物性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，耗資少，經(jīng)濟(jì)。已成為生物制品、基因工程制品、單克隆抗體生產(chǎn)的必要手段37

局限性

組織和細(xì)胞離體以后，獨(dú)立生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，與體內(nèi)環(huán)境相比，仍有很大差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全代表體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。

38組織培養(yǎng)基本理論知識(shí)組織培養(yǎng)技術(shù)第一章39一、組織培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)40

體內(nèi)外細(xì)胞的差異細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化。培養(yǎng)細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、出現(xiàn)類似“返祖現(xiàn)象”；細(xì)胞趨向單一化，或獲得不死性，或變成惡性細(xì)胞群。41

可能的機(jī)制：

體內(nèi)細(xì)胞高度分化，細(xì)胞間有高度的相互依存性、個(gè)體細(xì)胞相對(duì)失去獨(dú)立性。從受精卵形成開(kāi)始，細(xì)胞有增殖和分化兩個(gè)過(guò)程。增殖使細(xì)胞數(shù)量增多，分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最終形成完整人體。細(xì)胞的生命活動(dòng)，是外源信號(hào)通過(guò)相關(guān)基因的調(diào)控，使之發(fā)生增殖或分化的表達(dá)。細(xì)胞離體培養(yǎng)后，信號(hào)來(lái)源切斷，特定基因分化表達(dá)減弱或停止。但進(jìn)化中保守的細(xì)胞增殖活動(dòng)可維持；使體內(nèi)外細(xì)胞出現(xiàn)了差異。42

培養(yǎng)細(xì)胞的分化不適應(yīng)deadaption細(xì)胞的分化特性減弱或不表現(xiàn)，如干細(xì)胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性的喪失。主要因環(huán)境改變所致。細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，分化改變?cè)酱?；?xì)胞剛離體培養(yǎng)時(shí)，可能不適應(yīng)，即由于環(huán)境的改變而出現(xiàn)的變化。生存條件的改變使分化發(fā)生阻抑；43去分化dedifferentiation細(xì)胞失掉分化的能力

如肝臟細(xì)胞，當(dāng)肝細(xì)胞失去產(chǎn)生精氨酸酶、氨基轉(zhuǎn)移酶等特性后，則失掉儲(chǔ)存肝糖原能力，并很難再現(xiàn)。去分化可能是基因變異所致。44

體外培養(yǎng)細(xì)胞有分化潛能

脊髓細(xì)胞來(lái)源中樞和遺傳性狀的不同，很多細(xì)胞有一定程度的分化表達(dá)現(xiàn)象。如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞在初代培養(yǎng)和接種在類似基膜物質(zhì)底物上時(shí)，可形成類似血管樣結(jié)構(gòu)。說(shuō)明與體內(nèi)條件越近似，細(xì)胞越易發(fā)生分化。細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，分化能力越差，在體外生存時(shí)間與其分化能力成反向關(guān)系。45

體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞分化的表達(dá)形式變化因環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表達(dá)形式也會(huì)發(fā)生與體內(nèi)不同的變化。如二倍體成纖維細(xì)胞，在體外可傳30-50代，相當(dāng)于150-300個(gè)細(xì)胞周期，最后衰老死亡，呈現(xiàn)著生命發(fā)展分化過(guò)程。闡明細(xì)胞分化機(jī)制意義是了解癌變機(jī)理和攻克癌癥的核心問(wèn)題培養(yǎng)細(xì)胞是研究分化最理想的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。46有分化特性的細(xì)胞系和細(xì)胞株組織來(lái)源細(xì)胞系增殖性物種分化特性脾Friend永生小鼠合成血紅蛋白Morris肝癌HTC永生大鼠酪氨酸轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)髓性白血病K562永生人合成血紅蛋白垂體瘤GH2,GH3永生大鼠產(chǎn)生生長(zhǎng)激素黑色素瘤B16永生小鼠產(chǎn)生色素髓性白血病HL60永生人合成球蛋白膠質(zhì)瘤CCM永生人膠質(zhì)纖維酸性蛋白成神經(jīng)細(xì)胞瘤C1300永生大鼠生長(zhǎng)軸突47

培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分類貼附型能貼附在支持物表面生長(zhǎng)。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞呈貼附性生長(zhǎng)；只依賴于貼附才能生長(zhǎng)。貼附后，易失去其原有的特征，細(xì)胞分化現(xiàn)象常不顯著。在形態(tài)上表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反應(yīng)其胚層起源，呈現(xiàn)類似“返祖現(xiàn)象”。成纖維型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞及多形型細(xì)胞48

成纖維型細(xì)胞：細(xì)胞體呈梭形或三角形，卵圓形核，胞質(zhì)伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。細(xì)胞多呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行。包括成纖維細(xì)胞，中胚層間充質(zhì)起源組織（心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等）細(xì)胞培養(yǎng)類型49

（2）上皮型細(xì)胞扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細(xì)胞緊密相連成單層膜。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞（皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮）50

（3）游走型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快而且不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定51

（4）多形型細(xì)胞神經(jīng)組織細(xì)胞：有時(shí)呈多角形，有時(shí)伸出較長(zhǎng)纖維。52CHO細(xì)胞培養(yǎng)53

懸浮型胞體為圓形懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，生存空間大，容許長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，能繁殖多量細(xì)胞，便于做細(xì)胞代謝等研究。血液細(xì)胞、某些癌細(xì)胞54

培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)大體形態(tài)：液體環(huán)境中，胞體呈圓形；當(dāng)貼附于支持物表面后，開(kāi)始為圓形，很快成扁平形態(tài)。細(xì)胞大體形態(tài)可隨支持物的構(gòu)型而改變。普通光鏡下，細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。相差顯微鏡可看清細(xì)胞的輪廓和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。固定染色法和特殊技術(shù)可顯示細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)。

55

超微結(jié)構(gòu)：電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器等。細(xì)胞外衣：細(xì)胞膜表面常附有由細(xì)胞分泌物形成的糖蛋白膜，對(duì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和貼附有作用。用胰蛋白酶消化處理細(xì)胞，能改變其性質(zhì)，使細(xì)胞易從支持物上脫落下來(lái)。56

培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖過(guò)程傳代

passage/subculture：當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存。（1）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期（2）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期（潛伏期、指數(shù)增生期、衰退期）57（1）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期初代培養(yǎng)期

primaryculture從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。形態(tài)相似。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。Lifespanofculturecells58傳代培養(yǎng)期初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后稱為細(xì)胞系。此期為三期最長(zhǎng)者?？删S持二倍體核型，即二倍體細(xì)胞系。當(dāng)傳代30-50代后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，至完全停止。衰退期細(xì)胞仍然生存，增殖慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡59

少數(shù)情況下，在3個(gè)時(shí)期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標(biāo)志：細(xì)胞獲得永生性（或持久性增殖能力），核型多變成異倍體606162（2）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期細(xì)胞一代從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間。為培養(yǎng)工作中的習(xí)慣說(shuō)法63

潛伏期：懸浮狀態(tài)，胞體呈圓球形。接著是貼附在底物表面上，稱為貼壁，貼壁后變成極性細(xì)胞。0-24小時(shí)64

指數(shù)增生期：增殖旺盛，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好和最主要的階段。接觸抑制密度抑制：培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不足和代謝物的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。65

停滯期細(xì)胞數(shù)量持平，無(wú)增埴活動(dòng)，但有代謝活動(dòng)。此時(shí)需傳代。66體外培養(yǎng)細(xì)胞一代增殖生長(zhǎng)過(guò)程67

培養(yǎng)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)人體細(xì)胞有兩種基本狀態(tài)：增殖態(tài)、功能態(tài)細(xì)胞存在形式和細(xì)胞增殖周期關(guān)系68

有絲分裂G1期：

DNA合成前期，蛋白質(zhì)合成、RNA合成，胞體逐漸增大。S期：DNA合成期，此期易受致突變或致癌因素作用；遺傳物質(zhì)易受致突變物損傷。G2期：細(xì)胞分裂前期，對(duì)外界環(huán)境敏感，易受影響不能進(jìn)入M期。M期：細(xì)胞有絲分裂期G1期S期G2期M期細(xì)胞周期（一）增殖態(tài)Proliferationstate69

細(xì)胞進(jìn)行特定功能活動(dòng)如分泌、傳導(dǎo)、吞噬、收縮等的時(shí)期，是細(xì)胞的第二種生存狀態(tài)。是兩次增殖周期間的間期，或稱G0期。

體外培養(yǎng)細(xì)胞屬活躍增殖細(xì)胞，在培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)充分條件下，可反復(fù)進(jìn)行增殖活動(dòng)。

正常細(xì)胞增殖，須提供生長(zhǎng)因子；惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞可自泌生長(zhǎng)因子，降低了血清需求。（二）功能態(tài)Functionalstate70

培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)特征核型變化：初代培養(yǎng)時(shí)為二倍體細(xì)胞，傳代后可長(zhǎng)期保持二倍體狀態(tài)為主。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代后，會(huì)偏離二倍體呈多倍體和異倍體長(zhǎng)期不用或新引入的細(xì)胞應(yīng)做定期核型檢查

71永生化及惡變正常細(xì)胞主要特征：二倍體核型；增殖生長(zhǎng)期有限細(xì)胞永生化也稱不死性。惡變：有惡性細(xì)胞特征，能長(zhǎng)期增殖生長(zhǎng)；有異體接種致瘤性

72細(xì)胞型別女性的一條X染色體在間期呈異固縮狀態(tài)，呈三角形或半月?tīng)钚◇w緊附在核膜內(nèi)面，稱巴氏小體；男性Y染色體在間期則形成顆粒狀Y小體，位于胞核的近中央部位。用特殊染色法可顯現(xiàn)出巴氏體和Y小體。73

細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的關(guān)系

在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，在一定條件下，單個(gè)細(xì)胞也能生存和增殖生長(zhǎng)，表現(xiàn)有很大的獨(dú)立性。一個(gè)有活力的細(xì)胞經(jīng)過(guò)繁殖形成群體，群體細(xì)胞才是培養(yǎng)細(xì)胞的基本存在形式。在生理活動(dòng)上，群體細(xì)胞生存力強(qiáng)，細(xì)胞量多時(shí)比少時(shí)易于培養(yǎng)，說(shuō)明細(xì)胞之間能相互溝通信息。74二、細(xì)胞生存條件及代謝75無(wú)污染的環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌培養(yǎng)環(huán)境是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，失去了對(duì)微生物和有毒物質(zhì)的防御能力，一旦被污染或自身代謝物積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（一）基本條件76

適宜溫度人體細(xì)胞的適宜溫度為36.5℃+0.5℃，偏離時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞代謝，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫強(qiáng)。溫度≥0℃時(shí)，對(duì)細(xì)胞代謝有影響，但無(wú)損傷作用；培養(yǎng)液中加一定量的保護(hù)劑（甘油或二甲基亞砜），凍存于液氮中，能長(zhǎng)期儲(chǔ)存。保存細(xì)胞最主要的手段。77溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

78

氣體和pH值O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種所需成分。多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)），一般置于95%的空氣加5%CO2混合氣體環(huán)境中。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，作用是維持培養(yǎng)基的pH值，細(xì)胞要求7.2-7.4CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-79

維持培養(yǎng)基恒定pH的方法：為維持培養(yǎng)液的恒定pH值（7.2-7.4），常用磷酸鹽緩沖液（Hanks）的方法。用5.6﹪NaHCO3調(diào)pH，適用于封閉式培養(yǎng)。在堿性環(huán)境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞易堿中毒；開(kāi)放式培養(yǎng)時(shí)，在5%CO2的培養(yǎng)箱中；也可用羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不起緩沖作用，主要防止pH值的迅速變動(dòng)，其優(yōu)點(diǎn)是在開(kāi)瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH值。

80

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)糖、無(wú)機(jī)鹽氨基酸、維生素促細(xì)胞生長(zhǎng)因子牛血清是提供生長(zhǎng)因子和細(xì)胞所需物質(zhì)的來(lái)源滲透壓(滲透單位)離子強(qiáng)度：260-320mOsm/L培養(yǎng)基81

人工培養(yǎng)基按物質(zhì)形態(tài)分：液體及半固體培養(yǎng)基（軟瓊脂）按來(lái)源分：合成培養(yǎng)基syntheticmedium根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量合成天然培養(yǎng)基naturalmedium加入天然成分如人或動(dòng)物的血清、血漿和胎汁等，當(dāng)前主要使用牛血清。血清中有多種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)等。細(xì)胞培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基中，不能很好生長(zhǎng)增殖；加入5%血清時(shí)，大多細(xì)胞可緩慢生長(zhǎng)。一般需加10-20%的血清，細(xì)胞能很好生長(zhǎng)。血清要保證質(zhì)量。無(wú)血清培養(yǎng)基82附著物玻璃優(yōu)點(diǎn)：透明、便于觀察、易洗滌、能反復(fù)使用等，中性玻璃最好，適合各種細(xì)胞附著生長(zhǎng)。缺點(diǎn)為易碎。聚苯乙烯疏水性，光潔平坦，用于培養(yǎng)正常細(xì)胞、無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均可。微載體聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球體凡對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的物質(zhì)都可用作底物，不同細(xì)胞對(duì)底物要求各異。83（二）體外培養(yǎng)成功率關(guān)鍵在初代培養(yǎng)“培養(yǎng)成功”的定義：

不論用細(xì)胞消化分散法或組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物必須能貼附在底物上，繼而細(xì)胞才能發(fā)生運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞數(shù)量增多

擴(kuò)大再培養(yǎng)84供體條件培養(yǎng)條件不同細(xì)胞選用相應(yīng)的培養(yǎng)基貼附底物貼附是細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的條件。尤其對(duì)初代培養(yǎng)更重要培養(yǎng)方法選擇適宜的消化法和培養(yǎng)法85三、細(xì)胞系或細(xì)胞株的建立

各種已被命名和經(jīng)過(guò)細(xì)胞生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系或細(xì)胞株，是形態(tài)比較均一、生長(zhǎng)增殖比較穩(wěn)定、生物學(xué)性狀清楚的細(xì)胞群。86初代培養(yǎng)細(xì)胞（原代）直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。（一）培養(yǎng)細(xì)胞的種類及命名87傳代細(xì)胞系：初代培養(yǎng)物從第一次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，即為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，稱為有限細(xì)胞系；已獲無(wú)限繁殖能力可持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱無(wú)限細(xì)胞系特點(diǎn)：核發(fā)生異倍化，有異倍體核型；有永生性；但無(wú)異體接種致瘤性88克隆細(xì)胞株從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單個(gè)細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱克隆細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原細(xì)胞株性狀不同的細(xì)胞群，稱亞株（subunit）。89二倍體細(xì)胞細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同的細(xì)胞群。屬有限細(xì)胞系，壽命長(zhǎng)短各異，人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50+10代，人胚腎只有8-10代。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或2-5代即大量?jī)龃孀鳛樵N，用時(shí)再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長(zhǎng)期使用和延緩細(xì)胞的衰老。90遺傳缺陷細(xì)胞從先天缺陷者取材培養(yǎng)的細(xì)胞先天或人工誘變（2n或異倍）91腫瘤細(xì)胞系（株）現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性；有異體接種致瘤性。舉例：HeLa

名源于供體患者姓名CHO中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞NIH3T3美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院建立宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞92記錄要求：組織來(lái)源、細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)、培養(yǎng)條件和方法鑒定、管理和使用按國(guó)際慣例，在雜志或刊物上報(bào)道，詳細(xì)介紹。各國(guó)管理中心、細(xì)胞庫(kù)美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)ATCC人遺傳突變細(xì)胞庫(kù)HGMR細(xì)胞衰老細(xì)胞庫(kù)CAR（二）細(xì)胞株建立要求及管理93ATCC入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目（基本要求）：

培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來(lái)源日期、物種、供體情況、細(xì)胞傳代情況等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱、血清來(lái)源和含量

94細(xì)胞形態(tài)：類型

核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無(wú)

無(wú)誤染測(cè)驗(yàn)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲(chóng)和病毒等

物種鑒定：查同工酶，主要為G6PD和LDH，查細(xì)胞有否交叉污染

免疫檢測(cè)：一兩種血清學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測(cè)者姓名95組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)第二章96一、在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用97HIVattacksahumantissuecell

981.檢測(cè)病毒病毒的增殖

分離病原體的重要手段，還為研究病毒的親細(xì)胞性和親組織性提供了非常方便的方法。增殖指標(biāo)：CPE、pH變化、包涵體等病毒定量：PFU、TCID50病毒和細(xì)胞間關(guān)系致病機(jī)理99CPE正常細(xì)胞病變細(xì)胞100

Microscopicviewofcytopathiceffect(giantcellformation)atday5afterinfectionofU87.CD4.CCR5.CXCR4cellswiththeclinicalisolates,whicheachhaveadifferentcoreceptoruseasshownbetweenbrackets.Uninfectedcellsareshownasthenegativecontrol(upperrow).

Notetheenormousgiantcellformationintheuntreatedvirus-infectedcellcultureswhereassuchcytopathiceffectistotallyabsentininfectedcellsexposedtoa1:1combinationofSCH-CandAMD3100at1000ng/ml.Independently,SCH-CandAMD3100preventedgiantcellformationincellculturesinoculatedwithR5HIV-1andX4HIV-1,respectively,butnotincellculturesinfectedwiththedualtropicR5/X4HIV-1isolate101病毒檢驗(yàn)方法病毒培養(yǎng)全程5-30天病毒培養(yǎng)：1.細(xì)胞培養(yǎng)2.接種至細(xì)胞細(xì)胞病變判定熒光或酶染色：1.病毒涂片2.血清型特異抗體熒光染色核酸檢測(cè)：PCR或雜交中和試驗(yàn)：培養(yǎng)出的病毒與特異性抗血清作用，再接種至細(xì)胞102103

2.病毒性感染的血清學(xué)診斷中和試驗(yàn)血凝試驗(yàn)ELISA蛋白印跡（Westernblot）3.腫瘤病毒致癌機(jī)理的研究（轉(zhuǎn)化）生物學(xué)性狀細(xì)胞遺傳學(xué)特征惡性浸潤(rùn)測(cè)試1044.體外抗病毒藥效實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)體外試驗(yàn)是采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)觀察藥物的抗病毒作用；根據(jù)藥物的特性選擇病毒，根據(jù)病毒對(duì)細(xì)胞易感性選擇細(xì)胞，根據(jù)CPE作為判定藥物的藥效指標(biāo)。105

5.在病毒受體及致病機(jī)制研究方面應(yīng)用病毒受體的研究：確定某種病毒對(duì)細(xì)胞的親嗜性；確定敏感細(xì)胞表面對(duì)該種病毒的特異性受體；病毒與相應(yīng)受體結(jié)合的生化基礎(chǔ)與動(dòng)力學(xué)改變，包括結(jié)合方式及結(jié)合后細(xì)胞發(fā)生的生理功能變化；病毒受體的純化；病毒受體基因構(gòu)件及表達(dá)等。106

主要應(yīng)用的技術(shù)方法：雜交瘤技術(shù)制備細(xì)胞表面受體的單克隆抗體，用單克隆抗體封閉或阻斷病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合研究?jī)烧呓Y(jié)合的特異性。利用合成肽與受體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，研究病毒受體的結(jié)構(gòu)及作用部位。107利用人工合成多肽、序列刪除、氨基酸置換等方式模擬病毒配體與細(xì)胞病毒受體、輔助受體及其他分子的作用機(jī)制。利用酶的作用去除細(xì)胞表面的受體，觀察對(duì)病毒吸附細(xì)胞、傳入細(xì)胞的影響。108

分離和純化病毒受體。利用病毒受體蛋白免疫血清的細(xì)胞保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，研究病毒受體抗血清對(duì)病毒受體的阻斷作用。利用克隆技術(shù)克隆病毒受體的基因，再利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使受體缺陷型細(xì)胞獲得特異性受體，再用病毒感染細(xì)胞驗(yàn)證受體的存在。利用X射線衍射技術(shù)直接獲得病毒與受體結(jié)合的過(guò)程。1096.培養(yǎng)方法研究病毒學(xué)的優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有隱性感染，避免體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。沒(méi)有免疫抵抗力可選出適宜培養(yǎng)方法可以選擇出最易感的細(xì)胞進(jìn)行研究可增加接種量110獲取減毒株或無(wú)毒株較其他方法容易大規(guī)模制備病毒疫苗，可提高產(chǎn)量，降低成本，還可以使培養(yǎng)液中的異性蛋白減低至最低限度,提高疫苗質(zhì)量?？煽焖俜蛛x鑒定病毒，發(fā)現(xiàn)新病毒，如2003年SARS-CoV的發(fā)現(xiàn),2009年發(fā)現(xiàn)新甲型流感病毒H1N1。111SARS-CoV電鏡照片病毒顆粒呈不規(guī)則形，具有多形性。直徑多為60～120nm，有包膜，其包膜表面有放射狀排列的突起，形如王冠（vero-E6細(xì)胞）.112二、在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用1131.免疫細(xì)胞檢測(cè)免疫細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)單個(gè)核細(xì)胞：Ficoll分層液DC：CSF、IL-4、IFN刺激分化、成熟NK：抗T、B的抗體T細(xì)胞：E-花環(huán)沉淀B細(xì)胞：除E-花環(huán)沉淀114淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（ＭＬＣ）

HLA抗原不同，轉(zhuǎn)化率判斷差異性抗體產(chǎn)生細(xì)胞檢測(cè)115Hybridomas2.雜交瘤技術(shù)116

雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

利用大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體，可提高產(chǎn)量、簡(jiǎn)化工藝、降低成本，還可提高抗體質(zhì)量。117單克隆抗體制備流程：用特異抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取含大量B細(xì)胞的脾細(xì)胞

鼠骨髓瘤細(xì)胞

細(xì)胞融合

篩選雜交瘤細(xì)胞

生產(chǎn)單克隆抗體118雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖1193.細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)IL-1活性測(cè)定IL-1和小鼠的胸腺細(xì)胞共同培養(yǎng)（含有適量的如PHA類的絲裂原），IL-1可刺激小鼠胸腺細(xì)胞增殖（H-TdR）。通常選用C3H/HeJ品系鼠。120

IL-2活性測(cè)定IL-2的生物活性測(cè)定需要穩(wěn)定、敏感的IL-2測(cè)定細(xì)胞?？煞謨深悾阂皇荌L-2依賴性細(xì)胞株(CTLL-1,CTLL-2)。只有在IL-2存在培養(yǎng)才能生長(zhǎng)，否則24hr內(nèi)死亡；二是新鮮制備的對(duì)IL-2有反應(yīng)的淋巴母細(xì)胞，這類細(xì)胞在IL-2存在下培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)力增強(qiáng)，但無(wú)IL-2時(shí)并不死亡，此方法可替代第一類IL-2檢測(cè)法。在培養(yǎng)過(guò)程中，加入待測(cè)樣品，如果細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，表明待測(cè)標(biāo)本中有IL-2。121IFN活性測(cè)定原理：IFN-α,β均具有抗病毒活性。當(dāng)未加IFN的對(duì)照孔出現(xiàn)75%-100%細(xì)胞病變；未加病毒的細(xì)胞對(duì)照無(wú)病變時(shí)；而某一稀釋度IFN標(biāo)本的有50%細(xì)胞不出現(xiàn)病變；則表示該樣品內(nèi)含有保護(hù)細(xì)胞的足量IFN，其稀釋度即為標(biāo)本中含有的IFN效價(jià)。122TNF的檢測(cè)方法TNF細(xì)胞毒性測(cè)定是根據(jù)它對(duì)某些細(xì)胞株的直接殺傷作用，如小鼠成纖維細(xì)胞系L929、WEHI164、小鼠結(jié)締組織細(xì)胞L-M等。TNF能使敏感靶細(xì)胞發(fā)生形態(tài)上的改變，直至死亡。常采用的細(xì)胞毒性法是通過(guò)靶細(xì)胞被殺傷的程度測(cè)定TNF活性（染色法或同位素法）。123

4.HLA檢測(cè)HLA抗體篩選技術(shù)淋巴細(xì)胞毒交叉配合實(shí)驗(yàn)：常用于移植檢測(cè)。受體血清中如存在抗淋巴細(xì)胞抗體，在補(bǔ)體存在的情況下可破壞供體淋巴細(xì)胞。加入染料，死細(xì)胞被染料染色而活細(xì)胞抗拒染色為無(wú)色，計(jì)數(shù)被染色的死細(xì)胞數(shù)，從而判定有無(wú)抗淋巴細(xì)胞抗體的存在。124

HLA抗原單克隆抗體分型技術(shù)具有高度多態(tài)性的HLA糖蛋白大多表達(dá)在有核細(xì)胞的表面。應(yīng)用微量淋巴細(xì)胞毒技術(shù)，將PBMC與抗HLA特異性抗體（同種抗血清或單克隆抗體）及兔補(bǔ)體混合培養(yǎng)，計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞比例來(lái)判斷結(jié)果。PCR分型技術(shù)根據(jù)HLA基因多態(tài)性，電泳RFLP-PCR

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，電泳圖125三、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用1261.體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化BHK-21,NIH/3T3,Rat-1,PC-12誘發(fā)因素：化學(xué)、物理、病毒、癌基因1272.DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞融合、顯微注射染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染（體細(xì)胞）轉(zhuǎn)基因（生殖細(xì)胞）磷酸鈣、電擊、脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法、其他DEAE-葡聚糖法個(gè)體發(fā)育、檢測(cè)目的基因表達(dá)（轉(zhuǎn)基因技術(shù)）1283.基因診斷和基因治療原位修復(fù)有缺陷的基因基因替代療法重新開(kāi)放已關(guān)閉的基因?qū)牖颍╬53,RB）封閉基因（反義RNA）129四、在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用1301、性染色體的檢測(cè)間期細(xì)胞核內(nèi)女性X和男性Y染色體均可特殊染色。女性兩條X染色體中的一個(gè)，因失活間期時(shí)染色質(zhì)呈異固縮、深染小體，稱巴氏小體(Barrbody)。位于細(xì)胞核內(nèi)面，呈三角形或半月形，易被炭酸復(fù)紅著色。正常女性巴氏體陽(yáng)性,男性為陰性。初代培養(yǎng)細(xì)胞和二倍體細(xì)胞株均可觀察到性染色質(zhì)。男性Y染色體位于間期細(xì)胞核近中央部，熒光染色發(fā)較強(qiáng)熒光，呈點(diǎn)狀小體，發(fā)光部分為Y染色體異固縮的長(zhǎng)臂,Y小體，也稱熒光小體。1311322、培養(yǎng)細(xì)胞染色體顯示染色體顯示主要是顯示分裂中期細(xì)胞。因細(xì)胞分裂處于中期時(shí)，染色體的長(zhǎng)短和大小適合，是研究染色體的最好階段。準(zhǔn)備工作的原則：獲得多量的中期分裂相分散密集并相互纏繞的46條染色體133

措施：提高細(xì)胞分裂相數(shù)刺激細(xì)胞增殖：PHA阻抑中期分裂：秋水仙素促染色體分散措施低滲處理：低滲鹽溶液醋酸固定：膨脹固定組織細(xì)胞，和醇類混合固定有利于染色體松散效應(yīng)。1343、染色體結(jié)構(gòu)顯帶和檢測(cè)染色體顯帶、染色體脆性部位的檢測(cè)、微核檢測(cè)4、染色體基因定位核素標(biāo)記原位雜交基因定位技術(shù)熒光標(biāo)記原位雜交基因定位技術(shù)5、染色體顯微切割法（染色體區(qū)段）135五、在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用136（一）測(cè)定藥物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)影響1、繪制生長(zhǎng)曲線的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)繪制培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)細(xì)胞增長(zhǎng)的絕對(duì)數(shù)值，可直觀了解細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的動(dòng)態(tài)變化。常用于檢測(cè)各種藥物、培養(yǎng)液的成分和血清等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。1372、成集落的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)成集落細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，也稱集落形成實(shí)驗(yàn)。是檢驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞增殖情況的可靠方法，該方法比生長(zhǎng)曲線、分裂指數(shù)測(cè)定方法的準(zhǔn)確性高。細(xì)胞被制成分散的懸液后，接種到底物上，能貼壁生長(zhǎng)，形成集落，計(jì)數(shù)集落。1383、有絲分裂指數(shù)測(cè)定的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)(MI)是指屬于分裂期的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率。用于表達(dá)細(xì)胞增殖旺盛的程度，也可檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。用蓋玻片培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞，做固定和染色后，鏡下觀察和計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中處于分裂期的細(xì)胞數(shù)并計(jì)算MI。1394、縮時(shí)電影顯微攝像術(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)可直接記錄培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂情況，計(jì)算細(xì)胞周期。也可拍攝培養(yǎng)細(xì)胞的活動(dòng)情況，記錄藥物處理后細(xì)胞行為和胞質(zhì)內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)的改變。其優(yōu)點(diǎn)是可供反復(fù)研究和分析。1405、培養(yǎng)的心肌細(xì)胞收縮活動(dòng)和動(dòng)作電位記錄實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞在培養(yǎng)十幾小時(shí)后，單個(gè)細(xì)胞就以各自的節(jié)律開(kāi)始搏動(dòng)。隨著心肌細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)，細(xì)胞之間相互交織，形成連接，這是心肌細(xì)胞傳導(dǎo)電興奮的基礎(chǔ)，這是細(xì)胞的搏動(dòng)同步化。應(yīng)用光電轉(zhuǎn)換裝置和細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位記錄技術(shù)可同時(shí)記錄心肌細(xì)胞的搏動(dòng)和動(dòng)作電位。141（二）培養(yǎng)細(xì)胞的膜片鉗技術(shù)膜片鉗：將尖端直徑僅1微米的玻璃微電極吸附到細(xì)胞膜表面上，對(duì)微電極內(nèi)施加負(fù)壓，微電極與細(xì)胞膜形成高于10G歐姆的高阻封接，可記錄到膜上pA級(jí)的離子通道電流?？捎糜谘芯侩x子通道與受體分子結(jié)構(gòu)和功能，廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。142（三）心肌細(xì)胞培養(yǎng)藥理學(xué)應(yīng)用觀察藥物對(duì)心肌細(xì)胞的直接作用及對(duì)活細(xì)胞影響的動(dòng)態(tài)過(guò)程；可研究心肌細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)及在藥物影響下所發(fā)生的變化；可建立不同的心肌細(xì)胞損傷的模型，以探討藥物的作用機(jī)制。具有簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、節(jié)約動(dòng)物和藥品的特點(diǎn)，可提高科研的效率和水平。143（四）體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定藥效優(yōu)點(diǎn)：已建的細(xì)胞系（株）提供大量的遺傳特性均一或相似的細(xì)胞來(lái)源，使藥物篩選研究工作穩(wěn)定、方便、經(jīng)濟(jì)。可準(zhǔn)確控制藥物作用的對(duì)象、作用時(shí)間和劑量以及細(xì)胞的生長(zhǎng)條件。將待檢測(cè)藥物或其他化合物直接加到培養(yǎng)系統(tǒng)中，使之直接與效應(yīng)細(xì)胞相接觸。144

不足：體外檢測(cè)的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境簡(jiǎn)單而體內(nèi)復(fù)雜進(jìn)行活性檢測(cè)時(shí)，比較容易和適宜于單質(zhì)藥物，水溶性藥物較容易。145適用范圍：

較適宜于研究抗癌藥物和能夠致畸、致癌、致突變的化合物及抗病毒藥物細(xì)胞選擇選擇適當(dāng)?shù)男?yīng)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞結(jié)果觀察：形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)、生物化學(xué)測(cè)定、分子生物學(xué)檢測(cè)以及細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)等方面。146

藥效測(cè)定法抗病毒藥效測(cè)定抗癌藥效測(cè)定

147六、在組胚與細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用148器官培養(yǎng)與發(fā)育分化研究體外培養(yǎng)整個(gè)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育胚胎致畸作用的研究器官的功能及其代謝的研究149器官移植中的應(yīng)用器官細(xì)胞的體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)其他器官細(xì)胞的體外培養(yǎng)150

細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)用：細(xì)胞形態(tài)學(xué)：借助體外培養(yǎng)技術(shù)與顯微縮時(shí)電影技術(shù)結(jié)合，觀察到許多細(xì)胞生長(zhǎng)行為。細(xì)胞生理學(xué)：確定培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，建立培養(yǎng)基的合理配方