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文檔簡介
2022/11/26第三章
高效液相色譜分析HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC2022/11/26第三章
高效液相色譜分析12022/11/26§3-1高效液相色譜法的特點(diǎn)
高效液相色譜法:一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。它在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上,引入氣相色譜的理論,技術(shù)上采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器。2022/11/26§3-1高效液相色譜法的特點(diǎn)
22022/11/262022/11/2632022/11/261.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較
高壓:HPLC采用高壓輸液設(shè)備,150-350*105Pa高速:HPLC流速大增,分析速度極快,只需數(shù)分鐘;而經(jīng)典方法靠重力加料,完成一次分析需時數(shù)小時。
高效:化學(xué)鍵和固定相,>30000塔板/米
高靈敏:10-9g(紫外檢測)、10-11g(熒光檢測)2022/11/261.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比42022/11/262、HPLC與GC的區(qū)別分析對象及范圍:GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物,而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%;HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量、熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物,這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動相的選擇:GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體,只起運(yùn)載作用,和組分之間沒有相互的作用力;HPLC采用的流動相為各種極性不同的液體或液體的混合,可供選擇的機(jī)會多。它除了起運(yùn)載作用外,還可與組分作用,并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭,即流動相對分離的貢獻(xiàn)很大,可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度:GC需高溫;HPLC通常在室溫下進(jìn)行。2022/11/262、HPLC與GC的區(qū)別52022/11/26§3-2高效液相色譜法理論基礎(chǔ)速率理論P(yáng)69
=2ldp+CdDmu+CmdP2CSmdP2Csdf2DmDmDs++uH=A++CuBu
由于柱內(nèi)色譜峰擴(kuò)展所引起的塔板高度的變化為:2022/11/26§3-2高效液相色譜法理論基礎(chǔ)速率理論62022/11/26速率方程:
H=A+B/u+Cu(1)液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一,HPLC中速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小,可以忽略不計(jì),(2)影響柱效的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)。2022/11/26速率方程:H=A+B/u+Cu72022/11/262、提高柱效的途徑:提高柱內(nèi)填料均勻性,減小固定相粒度(選擇薄殼形擔(dān)體)選用低粘度的流動相或適當(dāng)提高柱溫,降低流動相粘度;減小粒度是最有效的途徑.2022/11/262、提高柱效的途徑:82022/11/26§3-3高效液相色譜法主要類型及分離原理1、液液分配色譜法2、液固吸附色譜法3、離子交換色譜法4、離子對色譜5、空間排阻色譜法
2022/11/26§3-3高效液相色譜法92022/11/261、液-液分配色譜
固定相與流動相均為液體(互不相溶);分離機(jī)制:組分在固定相和流動相上的分配;流動相:對于親水性固定液,采用疏水性流動相,即流動相的極性小于固定液的極性(正相色譜),反之,流動相的極性大于固定液的極性(反相色譜)。
固定相:早期涂漬固定液,固定液流失,較少采用;目前應(yīng)用最廣的固定相:化學(xué)鍵合固定相
2022/11/261、液-液分配色譜
固102022/11/26正相色譜與反相色譜比較正相色譜——固定液極性>流動相極性
極性小的組分先出柱,極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動相極性
極性大的組分先出柱,極性小的組分后出柱適于分離非極性組分反相色譜:固定相:C-18柱流動相:甲醇-水或乙腈-水2022/11/26正相色譜與反相色譜比較112022/11/262、液-固吸附色譜
基本原理:組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸;固定相:固體吸附劑,如硅膠、氧化鋁等適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣
缺點(diǎn):非線性等溫吸附常引起峰的拖尾;2022/11/262、液-固吸附色譜
基本原理:122022/11/263、離子對色譜(分離有機(jī)酸、有機(jī)堿)
原理:流動相中加入離子對試劑,使被測組分的溶質(zhì)離子與其電荷相反的對離子形成中性離子對,以改善分離分析酸(陰離子分離):常采用烷基銨類,如:氫氧化四丁基銨分析堿(陽離子分離):常采用烷基磺酸類,如:己烷磺酸鈉;反相離子對色譜:固定相:非極性的疏水鍵和相(C-18柱)流動相:含有對離子的甲醇-水或乙腈-水2022/11/263、離子對色譜(分離有機(jī)酸、有機(jī)堿)132022/11/264、離子交換色譜
固定相:陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂;
基本原理:組分在固定相上發(fā)生的離子交換反應(yīng);不同組分與離子交換劑之間親和力的大小不同。應(yīng)用:在溶液中可電離的物質(zhì),氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。2022/11/264、離子交換色譜
固定142022/11/265、空間排阻色譜
固定相:凝膠(具有一定大小孔隙分布);
原理:按分子大小分離。小分子可以進(jìn)入到凝膠空隙,由其中通過,出峰最慢;中等分子只能通過部分凝膠空隙,中速通過;而大分子被排斥在外,出峰最快;溶劑分子小,故在最后出峰。全部在死體積前出峰;可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2022/11/265、空間排阻色譜
固定相:152022/11/26§3-4液相色譜固定相
1.液-液分配及離子對分離固定相
(1)全多孔型擔(dān)體
由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體;早期采用100μm的大顆粒,表面涂漬固定液,性能不佳?,F(xiàn)采用10μm以下的小顆粒
(2)表面多孔型擔(dān)體
(薄殼型微珠擔(dān)體)30~40μm的玻璃微球,表面附著一層厚度為1~2μm的多孔硅膠。表面積小,柱容量低;需要高靈敏度的檢測器。
現(xiàn)在5~10μm全多孔型擔(dān)體使用廣泛2022/11/26§3-4液相色譜固定相1.液-液162022/11/26化學(xué)鍵合固定相
定義:用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)物分子結(jié)合到擔(dān)體表面。(目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相)
制備方法:a.硅氧碳鍵型:≡Si—O—C
b.硅碳鍵型:≡Si—C
c.硅氮鍵型:≡Si—N
d.硅氧硅碳鍵型:≡Si—O—Si—
C
穩(wěn)定,耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑,應(yīng)用最廣;2022/11/26化學(xué)鍵合固定相定義:用化學(xué)172022/11/26化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)(1)表面無液坑,比一般液體固定相傳質(zhì)快;(2)無固定液流失,增加了色譜柱穩(wěn)定性和壽命(3)可鍵合不同官能團(tuán),選擇性好(4)有利于梯度洗脫;分離機(jī)制:分配+吸附采用化學(xué)鍵和固定相的液相色譜稱為化學(xué)鍵和相色譜。(化學(xué)鍵和相色譜類型及應(yīng)用見表3-2)2022/11/26化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)(1)表面無液坑,比182022/11/262.液-固吸附色譜固定相
種類:硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等;結(jié)構(gòu)類型:全多孔型和薄殼型;目前,5~10μm硅膠微粒(全多孔型)使用最廣
2022/11/262.液-固吸附色譜固定相種192022/11/263.離子交換色譜分離固定相
結(jié)構(gòu)類別:(1)薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體,表面涂約1%的離子交換樹脂;(2)離子交換鍵合固定相鍵合薄殼型;鍵合微粒擔(dān)體型(鍵合離子交換基團(tuán))
樹脂類別:(1)陽離子交換樹脂(強(qiáng)酸性、弱酸性)(2)陰離子交換樹脂(強(qiáng)堿性、弱堿性)2022/11/263.離子交換色譜分離固定相結(jié)202022/11/264.空間排阻分離固定相(1)軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);水為流動相。適用于常壓排阻分離。(2)半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物,有機(jī)凝膠;非極性有機(jī)溶劑為流動相,不能用丙酮、乙醇等極性溶劑(3)硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等;化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大,流動相性質(zhì)影響小,可在較高流速下使用??煽乜讖讲A⑶?,具有恒定孔徑和窄粒度分布。2022/11/264.空間排阻分離固定相(1)軟質(zhì)凝膠212022/11/26§3-5液相色譜的流動相
1.流動相特性
液相色譜的流動相又稱為:淋洗液,洗脫劑。流動相對組分有親和力,流動相組成改變,極性改變,可顯著改變組分分離狀況
2022/11/26§3-5液相色譜的流動相
1.流222022/11/262.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題(1)盡量使用高純度試劑作流動相,防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。(2)避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。(3)試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4)溶劑粘度小些(5)流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時,流動相不應(yīng)有紫外吸收。2022/11/262.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題(1)232022/11/263.流動相選擇在選擇流動相時,溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。例:采用正相液-液分配分離時:首先選擇中等極性溶劑,若組分的保留時間太短,降低溶劑極性,反之增加。常用溶劑的極性順序:水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性,以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2022/11/263.流動相選擇在選擇流動相時242022/11/26§3-6高效液相色譜儀器
2022/11/26§3-6高效液相色譜儀器
252022/11/26液相色譜儀(1)2022/11/26液相色譜儀(1)262022/11/26液相色譜儀(2)2022/11/26液相色譜儀(2)272022/11/26流程及主要部件
processandmainassemblyofHPLC1.流程高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)2022/11/26流程及主要部件
processand282022/11/262.主要部件高壓輸液系統(tǒng)(儲液器、高壓泵、過濾器)高壓泵為了獲得高柱效,HPLC使用粒度很小的固定相(<10μm),液體流經(jīng)色譜柱受到的阻力大應(yīng)具有流量穩(wěn)定、壓力平穩(wěn)無脈動等特性。分為恒流泵、恒壓泵,各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵逐漸取代恒壓泵。2022/11/262.主要部件高壓輸液系統(tǒng)(儲液器、高壓泵292022/11/26梯度洗提裝置(P84)梯度洗提:流動相中含有兩種或以上不同極性的溶劑,在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相的組成來改善和提高分離效果。與氣相色譜中程序升溫的區(qū)別:(GC)程序升溫通過改變
來達(dá)到改善分離(HPLC)梯度洗提通過改變
來改善分離柱溫流動相的組成2022/11/26梯度洗提裝置(P84)梯度洗302022/11/26(2)進(jìn)樣系統(tǒng)注射器、進(jìn)樣閥(六通閥)通常使用六通閥,2022/11/26(2)進(jìn)樣系統(tǒng)注射器、進(jìn)樣閥(六通閥)312022/11/26(3)色譜柱
柱體為直型不銹鋼管,標(biāo)準(zhǔn)柱子的內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm,柱長15~30cm,填料一般5~10m。發(fā)展趨勢是減小填料粒度以提高柱效和減小柱徑減少溶劑用量2022/11/26(3)色譜柱柱體為直322022/11/26(4)檢測系統(tǒng)
a.紫外-可見檢測器和光電二極管陣列檢測器
紫外-可見檢測器(UVD)應(yīng)用最廣,適用對紫外光(可見光)有吸收的物質(zhì)特點(diǎn):通用性較好,對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng);靈敏度較高;檢測器對流動相的溫度變化和流速不敏感(梯度洗提);
2022/11/26(4)檢測系統(tǒng)a.紫外-可見332022/11/26光電二極管陣列檢測器(PAD、DAD)紫外檢測器的重要進(jìn)展;采用2048個二極管或更多組成陣列,得到三維色譜-光譜圖。
優(yōu)點(diǎn):
(1)可獲得組分的全部光譜信息,很快定性鑒定組分;
(2)可判斷組分純度。2022/11/26光電二極管陣列檢測器(PAD、DAD)342022/11/26b.熒光檢測器(FLD)特點(diǎn):
高靈敏度、高選擇性;對多環(huán)芳烴,維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)等有響應(yīng);
利用試樣具有熒光特性2022/11/26b.熒光檢測器(FLD)特點(diǎn):352022/11/26c.示差折光檢測器(通用型檢測器)
(differentialrefractiveindexdetector)
可連續(xù)檢測參比池和樣品池中溶液之間的折光指數(shù)差值,差值與濃度呈正比。
通用型檢測器(每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù));缺點(diǎn):對溫度敏感、不能用于梯度洗脫;
2022/11/26c.示差折光檢測器(通用362022/11/26§3-7高效液相色譜分離類型選擇
choiceofseparationtypes
根據(jù)分離分析的目的、試樣的性質(zhì)、現(xiàn)有設(shè)備條件選擇合適的方法??筛鶕?jù)試樣的相對分子量、溶解度、分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行初步選擇。
1、根據(jù)相對分子量選擇
相對分子量低、揮發(fā)性好——?dú)庀嗌V相對分子量200~2000——液固、液液、離子交換色譜相對分子量>2000——排阻色譜2022/11/26§3-7高效液相色譜分離類型選擇
c372022/11/262、根據(jù)溶解度選擇樣品溶于水不離解——反相色譜樣品溶于水并能離解——離子交換色譜樣品溶于烴類(苯或異辛烷)——液固吸附色譜樣品溶于甲醇——反相色譜3、根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇異構(gòu)體——液固吸附色譜同系物——正相色譜、反相色譜2022/11/262、根據(jù)溶解度選擇382022/11/262022/11/26392022/11/26§3-8HPLC的應(yīng)用
applicationofHPLC
1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析
固定相:薄殼型硅膠(37~50m)流動相:正己烷流速:1.5mL/min色譜柱:50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器:示差折光檢測器
可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。2022/11/26§3-8HPLC的應(yīng)用
applic402022/11/262.稠環(huán)芳烴的分析
稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。
固定相:十八烷基硅烷化鍵合相流動相:20%甲醇-水~100%甲醇線性梯度淋洗,2%/min
流速:1mL/min
柱溫:50oC柱壓:70104Pa
檢測器:紫外檢測器2022/11/262.稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴多412022/11/26§3-9液相制備色譜
制備色譜:利用色譜技術(shù)分離、制備大量純組分的有效方法。
分析HPLC制備HPLC目的目的樣品組成信息純品回收通常研究大部分或全部樣品組分通常只對一種或幾種樣品組分感興趣2022/11/26§3-9液相制備色譜
制備色422022/11/261.色譜柱的柱容量(柱負(fù)荷)分析柱:不影響柱效時的最大進(jìn)樣量;制備柱:不影響收集物純度時的最大進(jìn)樣量;
超載:進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降,峰變寬。制備柱允許超載(以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜)2022/11/261.色譜柱的柱容量(柱負(fù)荷)432022/11/262.液相制備色譜的方法收集組分時,通常有以下情況:
(1)可獲得良好分離,主峰使用制備柱,超載提高效率(圖3-28);(2)兩主成分之間的小組分;超載,分離切分使待分離組分成為主成分(富集)后,再次分離制備。
2022/11/262.液相制備色譜的方法收集組分時,通常442022/11/263.液相制備色譜儀液相制備色譜儀:結(jié)構(gòu)與分析型一樣,但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱;檢測器后增加餾分收集器。
制備柱:內(nèi)徑20~50mm,柱長50cm。2022/11/263.液相制備色譜儀液相制備色譜452022/11/26第三章
高效液相色譜分析HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC2022/11/26第三章
高效液相色譜分析462022/11/26§3-1高效液相色譜法的特點(diǎn)
高效液相色譜法:一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。它在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上,引入氣相色譜的理論,技術(shù)上采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器。2022/11/26§3-1高效液相色譜法的特點(diǎn)
472022/11/262022/11/26482022/11/261.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較
高壓:HPLC采用高壓輸液設(shè)備,150-350*105Pa高速:HPLC流速大增,分析速度極快,只需數(shù)分鐘;而經(jīng)典方法靠重力加料,完成一次分析需時數(shù)小時。
高效:化學(xué)鍵和固定相,>30000塔板/米
高靈敏:10-9g(紫外檢測)、10-11g(熒光檢測)2022/11/261.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比492022/11/262、HPLC與GC的區(qū)別分析對象及范圍:GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物,而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%;HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量、熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物,這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動相的選擇:GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體,只起運(yùn)載作用,和組分之間沒有相互的作用力;HPLC采用的流動相為各種極性不同的液體或液體的混合,可供選擇的機(jī)會多。它除了起運(yùn)載作用外,還可與組分作用,并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭,即流動相對分離的貢獻(xiàn)很大,可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度:GC需高溫;HPLC通常在室溫下進(jìn)行。2022/11/262、HPLC與GC的區(qū)別502022/11/26§3-2高效液相色譜法理論基礎(chǔ)速率理論P(yáng)69
=2ldp+CdDmu+CmdP2CSmdP2Csdf2DmDmDs++uH=A++CuBu
由于柱內(nèi)色譜峰擴(kuò)展所引起的塔板高度的變化為:2022/11/26§3-2高效液相色譜法理論基礎(chǔ)速率理論512022/11/26速率方程:
H=A+B/u+Cu(1)液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一,HPLC中速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小,可以忽略不計(jì),(2)影響柱效的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)。2022/11/26速率方程:H=A+B/u+Cu522022/11/262、提高柱效的途徑:提高柱內(nèi)填料均勻性,減小固定相粒度(選擇薄殼形擔(dān)體)選用低粘度的流動相或適當(dāng)提高柱溫,降低流動相粘度;減小粒度是最有效的途徑.2022/11/262、提高柱效的途徑:532022/11/26§3-3高效液相色譜法主要類型及分離原理1、液液分配色譜法2、液固吸附色譜法3、離子交換色譜法4、離子對色譜5、空間排阻色譜法
2022/11/26§3-3高效液相色譜法542022/11/261、液-液分配色譜
固定相與流動相均為液體(互不相溶);分離機(jī)制:組分在固定相和流動相上的分配;流動相:對于親水性固定液,采用疏水性流動相,即流動相的極性小于固定液的極性(正相色譜),反之,流動相的極性大于固定液的極性(反相色譜)。
固定相:早期涂漬固定液,固定液流失,較少采用;目前應(yīng)用最廣的固定相:化學(xué)鍵合固定相
2022/11/261、液-液分配色譜
固552022/11/26正相色譜與反相色譜比較正相色譜——固定液極性>流動相極性
極性小的組分先出柱,極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動相極性
極性大的組分先出柱,極性小的組分后出柱適于分離非極性組分反相色譜:固定相:C-18柱流動相:甲醇-水或乙腈-水2022/11/26正相色譜與反相色譜比較562022/11/262、液-固吸附色譜
基本原理:組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸;固定相:固體吸附劑,如硅膠、氧化鋁等適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣
缺點(diǎn):非線性等溫吸附常引起峰的拖尾;2022/11/262、液-固吸附色譜
基本原理:572022/11/263、離子對色譜(分離有機(jī)酸、有機(jī)堿)
原理:流動相中加入離子對試劑,使被測組分的溶質(zhì)離子與其電荷相反的對離子形成中性離子對,以改善分離分析酸(陰離子分離):常采用烷基銨類,如:氫氧化四丁基銨分析堿(陽離子分離):常采用烷基磺酸類,如:己烷磺酸鈉;反相離子對色譜:固定相:非極性的疏水鍵和相(C-18柱)流動相:含有對離子的甲醇-水或乙腈-水2022/11/263、離子對色譜(分離有機(jī)酸、有機(jī)堿)582022/11/264、離子交換色譜
固定相:陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂;
基本原理:組分在固定相上發(fā)生的離子交換反應(yīng);不同組分與離子交換劑之間親和力的大小不同。應(yīng)用:在溶液中可電離的物質(zhì),氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。2022/11/264、離子交換色譜
固定592022/11/265、空間排阻色譜
固定相:凝膠(具有一定大小孔隙分布);
原理:按分子大小分離。小分子可以進(jìn)入到凝膠空隙,由其中通過,出峰最慢;中等分子只能通過部分凝膠空隙,中速通過;而大分子被排斥在外,出峰最快;溶劑分子小,故在最后出峰。全部在死體積前出峰;可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2022/11/265、空間排阻色譜
固定相:602022/11/26§3-4液相色譜固定相
1.液-液分配及離子對分離固定相
(1)全多孔型擔(dān)體
由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體;早期采用100μm的大顆粒,表面涂漬固定液,性能不佳?,F(xiàn)采用10μm以下的小顆粒
(2)表面多孔型擔(dān)體
(薄殼型微珠擔(dān)體)30~40μm的玻璃微球,表面附著一層厚度為1~2μm的多孔硅膠。表面積小,柱容量低;需要高靈敏度的檢測器。
現(xiàn)在5~10μm全多孔型擔(dān)體使用廣泛2022/11/26§3-4液相色譜固定相1.液-液612022/11/26化學(xué)鍵合固定相
定義:用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)物分子結(jié)合到擔(dān)體表面。(目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相)
制備方法:a.硅氧碳鍵型:≡Si—O—C
b.硅碳鍵型:≡Si—C
c.硅氮鍵型:≡Si—N
d.硅氧硅碳鍵型:≡Si—O—Si—
C
穩(wěn)定,耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑,應(yīng)用最廣;2022/11/26化學(xué)鍵合固定相定義:用化學(xué)622022/11/26化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)(1)表面無液坑,比一般液體固定相傳質(zhì)快;(2)無固定液流失,增加了色譜柱穩(wěn)定性和壽命(3)可鍵合不同官能團(tuán),選擇性好(4)有利于梯度洗脫;分離機(jī)制:分配+吸附采用化學(xué)鍵和固定相的液相色譜稱為化學(xué)鍵和相色譜。(化學(xué)鍵和相色譜類型及應(yīng)用見表3-2)2022/11/26化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)(1)表面無液坑,比632022/11/262.液-固吸附色譜固定相
種類:硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等;結(jié)構(gòu)類型:全多孔型和薄殼型;目前,5~10μm硅膠微粒(全多孔型)使用最廣
2022/11/262.液-固吸附色譜固定相種642022/11/263.離子交換色譜分離固定相
結(jié)構(gòu)類別:(1)薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體,表面涂約1%的離子交換樹脂;(2)離子交換鍵合固定相鍵合薄殼型;鍵合微粒擔(dān)體型(鍵合離子交換基團(tuán))
樹脂類別:(1)陽離子交換樹脂(強(qiáng)酸性、弱酸性)(2)陰離子交換樹脂(強(qiáng)堿性、弱堿性)2022/11/263.離子交換色譜分離固定相結(jié)652022/11/264.空間排阻分離固定相(1)軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);水為流動相。適用于常壓排阻分離。(2)半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物,有機(jī)凝膠;非極性有機(jī)溶劑為流動相,不能用丙酮、乙醇等極性溶劑(3)硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等;化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大,流動相性質(zhì)影響小,可在較高流速下使用??煽乜讖讲A⑶颍哂泻愣讖胶驼6确植?。2022/11/264.空間排阻分離固定相(1)軟質(zhì)凝膠662022/11/26§3-5液相色譜的流動相
1.流動相特性
液相色譜的流動相又稱為:淋洗液,洗脫劑。流動相對組分有親和力,流動相組成改變,極性改變,可顯著改變組分分離狀況
2022/11/26§3-5液相色譜的流動相
1.流672022/11/262.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題(1)盡量使用高純度試劑作流動相,防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。(2)避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。(3)試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4)溶劑粘度小些(5)流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時,流動相不應(yīng)有紫外吸收。2022/11/262.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題(1)682022/11/263.流動相選擇在選擇流動相時,溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。例:采用正相液-液分配分離時:首先選擇中等極性溶劑,若組分的保留時間太短,降低溶劑極性,反之增加。常用溶劑的極性順序:水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性,以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2022/11/263.流動相選擇在選擇流動相時692022/11/26§3-6高效液相色譜儀器
2022/11/26§3-6高效液相色譜儀器
702022/11/26液相色譜儀(1)2022/11/26液相色譜儀(1)712022/11/26液相色譜儀(2)2022/11/26液相色譜儀(2)722022/11/26流程及主要部件
processandmainassemblyofHPLC1.流程高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)2022/11/26流程及主要部件
processand732022/11/262.主要部件高壓輸液系統(tǒng)(儲液器、高壓泵、過濾器)高壓泵為了獲得高柱效,HPLC使用粒度很小的固定相(<10μm),液體流經(jīng)色譜柱受到的阻力大應(yīng)具有流量穩(wěn)定、壓力平穩(wěn)無脈動等特性。分為恒流泵、恒壓泵,各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵逐漸取代恒壓泵。2022/11/262.主要部件高壓輸液系統(tǒng)(儲液器、高壓泵742022/11/26梯度洗提裝置(P84)梯度洗提:流動相中含有兩種或以上不同極性的溶劑,在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相的組成來改善和提高分離效果。與氣相色譜中程序升溫的區(qū)別:(GC)程序升溫通過改變
來達(dá)到改善分離(HPLC)梯度洗提通過改變
來改善分離柱溫流動相的組成2022/11/26梯度洗提裝置(P84)梯度洗752022/11/26(2)進(jìn)樣系統(tǒng)注射器、進(jìn)樣閥(六通閥)通常使用六通閥,2022/11/26(2)進(jìn)樣系統(tǒng)注射器、進(jìn)樣閥(六通閥)762022/11/26(3)色譜柱
柱體為直型不銹鋼管,標(biāo)準(zhǔn)柱子的內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm,柱長15~30cm,填料一般5~10m。發(fā)展趨勢是減小填料粒度以提高柱效和減小柱徑減少溶劑用量2022/11/26(3)色譜柱柱體為直772022/11/26(4)檢測系統(tǒng)
a.紫外-可見檢測器和光電二極管陣列檢測器
紫外-可見檢測器(UVD)應(yīng)用最廣,適用對紫外光(可見光)有吸收的物質(zhì)特點(diǎn):通用性較好,對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng);靈敏度較高;檢測器對流動相的溫度變化和流速不敏感(梯度洗提);
2022/11/26(4)檢測系統(tǒng)a.紫外-可見782022/11/26光電二極管陣列檢測器(PAD、DAD)紫外檢測器的重要進(jìn)展;采用2048個二極管或更多組成陣列,得到三維色譜-光譜圖。
優(yōu)點(diǎn):
(1)可獲得組分的全部光譜信息,很快定性鑒定組分;
(2)可判斷組分純度。2022/11/26光電二極管陣列檢測器(PAD、DAD)792022/11/26b.熒光檢測器(FLD)特點(diǎn):
高靈敏度、高選擇性;對多環(huán)芳烴,維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)等有響應(yīng);
利用試樣具有熒光特性2022/11/26b.熒光檢測器(FLD)特點(diǎn):802022/11/26c.示差折光檢測器(通用型檢測器)
(differentialrefractiveindexdetector)
可連續(xù)檢測參比池和樣品池中溶液之間的折光指數(shù)差值,差值與濃度呈正比。
通用型檢測器(每種物質(zhì)具有不同
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