混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域MLKL通過磷酸化RIP3引發(fā)壞死性的膜破裂課件

混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域MLKL被RIP3磷酸化可引發(fā)壞死性的膜破裂HuayiWang,1LimingSun,1LijingSu,2JosepRizo,2LeiLiu,1Li-FengWang,3Fu-ShengWang,3andXiaodongWang1

王華翌、孫麗明、LijingSu、JosepRizo、劉磊、王立峰、王福生（北京302醫(yī)院）、王曉東（MolecularCell，2014）匯報(bào)人：付瑋瑋一、前言 程序性細(xì)胞死亡在多細(xì)胞個(gè)體的成長(zhǎng)發(fā)育過程中扮有重要作用，主要分為兩種途徑——凋亡和壞死，它們有著不同的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。 凋亡主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小、核膜破裂、DNA降解為約180-200bp的整數(shù)倍、并最終形成胞膜包被的凋亡小體，很快被巨噬細(xì)胞和鄰近細(xì)胞所吞噬。這些凋亡過程中形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的變化主要由一類半胱氨酸蛋白酶caspases執(zhí)行。這些蛋白酶通過外在的死亡誘導(dǎo)信號(hào)激活，如腫瘤壞死因子受體或Bcl-2家族蛋白，它們可使原來位于線粒體膜間隙的蛋白質(zhì)釋放到胞漿，其中一種釋放細(xì)胞色素C，與胞漿中的Apaf-1結(jié)合后激活caspases。 腫瘤壞死因子（TNF）還可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、胞內(nèi)細(xì)胞器變形或腫大、細(xì)胞ATP含量減少、細(xì)胞膜破裂。這種形式的壞死,又稱為necroptosis，需要受體互作的蛋白激酶RIP1、RIP3的激活。研究采用RIP3敲除的小鼠證實(shí)這種形式的細(xì)胞死亡對(duì)于應(yīng)答微生物感染和炎癥介導(dǎo)的組織損傷具有重要意義。 RIP3如何引發(fā)細(xì)胞壞死以及該途徑是否自然運(yùn)行在人類組織中是我們理解細(xì)胞壞死面臨的兩大難題。RIP1,RIP3以及MLKL相互結(jié)合形成一個(gè)信號(hào)復(fù)合體，被稱作“necrosome”。且MLKL激酶結(jié)構(gòu)域的357位的蘇氨酸和358位的絲氨酸（人源）在細(xì)胞程序性壞死被啟動(dòng)后被RIP3磷酸化。MLKL是擁有激酶結(jié)構(gòu)域（與RIP3結(jié)合）但無(wú)激酶功能的假激酶。MLKL敲除的小鼠被證實(shí)與RIP3敲除的小鼠對(duì)細(xì)胞壞死具有相似的抵抗能力。但MLKL磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞壞死的機(jī)制目前尚不清楚。二、文章的總體模式圖

RIP1,RIP3以及MLKL相互結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞壞死復(fù)合體“necrosome”；MLKL激酶結(jié)構(gòu)域的T357/S358位被RIP3磷酸化；磷酸化的MLKL從單體狀態(tài)向寡聚體狀態(tài)轉(zhuǎn)化；寡聚化的MLKL結(jié)合磷酸肌醇和心肌磷脂,整個(gè)復(fù)合體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，并在這些膜結(jié)構(gòu)上形成通透性孔道，破壞膜的完整性，引起細(xì)胞壞死。三、文章的亮點(diǎn)RIP3激酶對(duì)MLKLT357/S358位的磷酸化驅(qū)使MLKL形成寡聚物；MLKL寡聚物從胞漿易位到

細(xì)胞器膜和質(zhì)膜上；MLKL寡聚物在細(xì)胞壞死過程中直接破壞細(xì)胞膜的完整性；MLKL磷酸化發(fā)生在藥物引起的肝損傷病人活檢組織中。1.MLKL磷酸化是細(xì)胞壞死的標(biāo)志；2.磷酸化的MLKL在細(xì)胞壞死過程中易位到膜部分；3.Necrosomes復(fù)合體在細(xì)胞壞死過程中轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜和細(xì)胞器膜上；4.MLKL在細(xì)胞壞死過程中形成寡聚體；5.MLKL結(jié)合磷脂和脂質(zhì)體；6.MLKL通過在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏和細(xì)胞壞死；7.藥物引起的肝損傷病人活檢組織中檢測(cè)到MLKL磷酸化信號(hào)。四、文章結(jié)構(gòu)框架流程圖(主要通過7幅圖展開)圖1、MLKL磷酸化是細(xì)胞壞死的標(biāo)志

圖B進(jìn)一步驗(yàn)證了MLKL磷酸化與細(xì)胞死亡相關(guān)；從圖可以看出HT-29細(xì)胞在TSZ共同處理下不同時(shí)間的p-MLKL、ATP水平和膜泄漏情況（通過測(cè)定胞質(zhì)蛋白酶的活性得到，CytoTox-Glokit）；6小時(shí)后三個(gè)信號(hào)同時(shí)出現(xiàn)變化。補(bǔ)充圖中又對(duì)另一種人類細(xì)胞系（白血病細(xì)胞株U937）進(jìn)行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)MLKL磷酸化信號(hào)和細(xì)胞壞死的相關(guān)性同樣出現(xiàn)在U937細(xì)胞系中。圖2A：采用TrionX-114分離內(nèi)在膜蛋白的示意圖；圖2B：HT-29在TSZ處理的不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞提取物的westernblotting情況；細(xì)胞壞死誘導(dǎo)6小時(shí)后，磷酸化的MLKL在水相出現(xiàn)，且非磷酸化的MLKL逐漸減少；同時(shí)，磷酸化的MLKL此時(shí)出現(xiàn)在膜相；暗示MLKL在被RIP3磷酸化后從溶膠轉(zhuǎn)移到膜部分。圖2C：NSA（MLKL抑制劑）先前驗(yàn)證出不能阻止MLKL發(fā)生磷酸化，但可以阻止細(xì)胞壞死，現(xiàn)在驗(yàn)證NSA可以阻止p-MLKL轉(zhuǎn)移到膜上；分別對(duì)比2、6和4、8，在沒加壞死抑制劑時(shí)，p-MLKL主要集中在膜上，加抑制劑后，則主要在水相，暗示NSA雖然不影響MLKL的磷酸化，但p-MLKL不轉(zhuǎn)移到膜上；圖2D：MLKL磷酸化位點(diǎn)突變后在細(xì)胞壞死過程中不會(huì)轉(zhuǎn)移到膜上。圖3、Necrosomes復(fù)合體在細(xì)胞壞死過程中轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜和細(xì)胞器膜上

圖3A：差速離心分離細(xì)胞器的基本步驟；圖3B：細(xì)胞器特異性標(biāo)記（質(zhì)膜和核內(nèi)體：EGFR；線粒體：Tom20；溶酶體和核內(nèi)體:

Lamp1；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：ERp72）；左圖顯示僅用TNF處理，不出現(xiàn)p-MLKL，且MLKL、RIP3、RIP1主要存在于S100，即上清液水相中；RIP1在水相和膜上都比較多，暗示其可結(jié)合TNF受體。右圖顯示在TSZ處理后，p-MLKL出現(xiàn)在各種細(xì)胞器膜上。圖3C：前三行紅色點(diǎn)和綠色點(diǎn)的重疊百分比為14%-23%；細(xì)胞膜的p-MLKL信號(hào)為22%。線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常駐留蛋白溶酶體和核內(nèi)體微分干涉圖像質(zhì)膜圖4、MLKL在細(xì)胞壞死過程中形成寡聚體

圖4A：P-MLKL在非還原凝膠中有寡聚體存在，在還原凝膠則沒有；寡聚體靠二硫鍵連接；圖4B：采用凝膠過濾（Superdex200）分析純化的重組蛋白MLKL；洗脫位置表明了分子大?。ㄒ姌?biāo)尺，甲狀腺球蛋白,670kDa;鐵蛋白,440kDa;BSA,67kDa;卵清蛋白,44kDa;核糖核酸酶A,14kDa）；非還原凝膠還原凝膠圖5、MLKL結(jié)合磷脂和脂質(zhì)體

圖5A：（TAG：甘油三酯；DAG：甘油二酯；PA：磷脂酸；PS：磷酯酰絲氨酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PC：卵磷脂；PG：磷脂酰甘油；Cardiolipin:心磷脂；PI：磷脂酰肌醇；Cholesterol：膽固醇）；15種膜脂的布局圖；圖5B：MLKL-FL(full-length，1–471aa);MLKL-CC(coiled-coildomain,1–178aa);MLKL-KL(kinase-likedomain，179–471aa)；使用Anti-N-terminalorC-terminalMLKLantibodies檢測(cè)MLKLsignal。4種磷脂--心磷脂、PI4P、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3結(jié)合最多；KL結(jié)構(gòu)域不結(jié)合任何脂質(zhì)。圖6、MLKL通過在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏和細(xì)胞壞死圖6A-C：先讓Tb3+離子和脂質(zhì)體結(jié)合，然后和帶有DPA的MLKL蛋白孵育，Tb3+有弱熒光活性，當(dāng)從脂質(zhì)體中釋放與DPA結(jié)合時(shí)，Tb3+/DPA螯合物使熒光活性增加104倍，從而給出脂質(zhì)體破裂的信號(hào)；圖6A為三種形式的MLKL蛋白膜破裂情況；圖6B為脂質(zhì)體中包含不同脂類時(shí)膜破裂的情況；圖6C為添加NSA后可以抑制膜的破裂；圖6D：MLKL全長(zhǎng)或N端卷曲結(jié)構(gòu)域可以使膜破裂；而C端激酶結(jié)構(gòu)域不起作用；圖6E：采用人類骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，其中MLKL-FKBPV融合蛋白受doxycycline（多西環(huán)素）誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制，U2OS不表達(dá)RIP3，因此正常情況下不經(jīng)歷細(xì)胞壞死；僅當(dāng)Dox存在時(shí)可表達(dá)融合蛋白，但有30%的細(xì)胞死亡，添加AP20187后，細(xì)胞死亡率增加到60%；添加z-VAD和Nec-1時(shí)沒有顯著變化，但添加NSA時(shí)細(xì)胞死亡率下降，暗示細(xì)胞死亡是由MLKL介導(dǎo)的。圖7、藥物引起的肝損傷病人活檢組織中檢測(cè)到MLKL磷酸化信號(hào)圖7A：藥物引起的肝損傷病人活檢組織染色（圖中顯示病變部位三個(gè)臨近的區(qū)域）；a為蘇木精將細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，phospho-MLKL抗體將病變部位復(fù)染為紅色；b為沒有采用第一抗體染色的陰性對(duì)照；c為蘇木精和phospho-MLKL抗體復(fù)染的肝損傷嚴(yán)重的部位；圖7B：兩個(gè)健康器官移植捐贈(zèng)者的肝活檢組織樣本的免疫組