細菌內(nèi)毒素檢查3.光度法檢查技術(shù)

光度法細菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)湛江安度斯生物有限公司2017年5月1光度測定法方法學(xué)分類2光度測定法原理3試驗器具4標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗5干擾試驗6檢查法光度測定法2（一）光度測定法方法學(xué)分類光度測定法濁度法顯色法動態(tài)濁度法終點濁度法動態(tài)顯色法終點顯色法3（一）光度測定法方法學(xué)分類濁度法：動態(tài)/終點檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化。顯色法：動態(tài)/終點檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少。4光度測定法與凝膠法有

什么不同？5恒溫孵育凝膠法-定性分析反應(yīng)混合物檢測結(jié)果通過凝膠的堅實程度來判斷檢測結(jié)果；手工操作、記錄，肉眼觀察結(jié)果檢測靈敏度：0.5、0.25、0.125、0.06、0.03及0.015EU/ml；反應(yīng)時間：60分鐘；6鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)，使溶液的光度值發(fā)生變化，依據(jù)該變化與內(nèi)毒素濃度的對應(yīng)關(guān)系，計算樣品中內(nèi)毒素的含量值；檢測范圍寬：0.001EU/ml～10EU/ml或0.005EU/ml～50EU/ml等；反應(yīng)時間：沒有規(guī)定，用于中控最快5分鐘可以判斷；檢測結(jié)果直觀準(zhǔn)確-定量的檢測值；光度測定法-定量分析7光度測定法-定量分析反應(yīng)混合物光度測定儀計算機BET軟件檢測結(jié)果8使用光度法BET

可以為我們帶來什么9凝膠法光度法實現(xiàn)了實驗結(jié)果的判斷從肉眼觀察到機械化實驗結(jié)果的表示從定性到定量實驗結(jié)果從不能保留到數(shù)據(jù)可溯源實驗操作、數(shù)據(jù)記錄從手工到自動化實驗操作從繁瑣到簡單實驗數(shù)據(jù)完整性從被質(zhì)疑到信任反應(yīng)過程從不可視到直觀顯示10更重要的是……11檢測時間

縮短報告說服力

增強訂單成交率提高12檢測時間可以縮短多少呢符合藥典的要求嗎13反應(yīng)時間比較凝膠法動態(tài)濁度法終點顯色法PTS60分鐘30~60分鐘20~30分鐘最快7分鐘14光度法BET特點快速、定量結(jié)果形象、直觀

操作簡單

可靠性高靈敏度高

檢測范圍寬15比凝膠法更適合在如下領(lǐng)域使用：1.檢測靈敏度更高，排除干擾的能力更強；

2.能更靈活的應(yīng)用與質(zhì)控中的快速內(nèi)毒素分析；

3.定量的檢測結(jié)果可用于產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量的趨勢分析；

4.用定量的檢測結(jié)果去衡量產(chǎn)品的質(zhì)量水平；

5.邊緣值產(chǎn)品輔助分析；

6.新產(chǎn)品BET方法學(xué)建立；

7.假陽性產(chǎn)品的判定等。光度測定法-定量分析16（二）光度測定法原理1.光電轉(zhuǎn)換原理當(dāng)一束光線進入如下光電轉(zhuǎn)換裝置時，該裝置將產(chǎn)生電流I，我們稱I為透光強度。光電池入射光反應(yīng)混合物透射光I透光容器17設(shè)：初始時的透光強度為Is，某時刻的透光強度為It

定義1：透光率（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始時It=Is，Rt=100%，Rt曲線變化趨勢是由高至低。定義2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始時It=Is，OD=0，OD曲線變化趨勢是由低至高。選擇不同的參數(shù)(Rt或OD)將得到不同變化趨勢的動態(tài)曲線。T(分)IsItIeI18反應(yīng)動態(tài)曲線(Rt-T曲線)以透光率（Rt）為縱座標(biāo)，時間（T）為橫座標(biāo)，把鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液透光率的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動態(tài)曲線如圖：Rt（%）T（分）反應(yīng)動態(tài)曲線100孵育期反應(yīng)期結(jié)束期19反應(yīng)動態(tài)曲線(OD-T曲線)以吸光度（OD）為縱座標(biāo)，時間（T）為橫座標(biāo)，把鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液吸光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動態(tài)曲線如圖：ODT（分）反應(yīng)動態(tài)曲線0孵育期反應(yīng)期結(jié)束期202.動態(tài)曲線的特點把標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備成三個濃度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分別與鱟試劑反應(yīng)，描繪出反應(yīng)的動態(tài)曲線如下圖：T（秒）C3ODC2C1分析動態(tài)曲線可看出：內(nèi)毒素濃度越高，孵育期越短；內(nèi)毒素濃度越高，反應(yīng)期曲線越陡；內(nèi)毒素濃度越高，進入結(jié)束期越快。213.光度法BET試驗的相關(guān)變量相關(guān)變量：

內(nèi)毒素濃度(C)

Rt或OD

反應(yīng)時間(T):不同的方法有不同的意義常數(shù)：固定反應(yīng)時間值終點法

固定Rt或OD值

動態(tài)法T（秒）C3ODC2C1224.動態(tài)法原理固定吸光度或透光率，檢測反應(yīng)混合物的吸光度或透光率達到某一預(yù)先設(shè)定的檢測值所需要的反應(yīng)時間。建立內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-T曲線）。用供試品的反應(yīng)時間比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的濃度。預(yù)設(shè)Rt或者OD值應(yīng)按照試劑生產(chǎn)商的建議及使用的鱟試劑和儀器類型進行設(shè)定。23回歸分析OD預(yù)設(shè)ODT1T2T30T(秒)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線24（2）測定供試品內(nèi)毒素濃度（Cs）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品(S)反應(yīng)，得到反應(yīng)時間Ts，比對C-T關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cs。比對標(biāo)準(zhǔn)曲線TsT(秒)LgT=b-kLgCLgCCsTsLgTOD0供試品預(yù)設(shè)OD25預(yù)設(shè)OD或Rt的選擇OD反應(yīng)時間最佳預(yù)設(shè)OD標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度之間的分辨率不好，容易受到背景噪聲影響分辨率好但需要增加時間預(yù)設(shè)值一般由鱟試劑生產(chǎn)商建議，并注明在鱟試劑說明書中265.終點法原理固定反應(yīng)時間（T），依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時的吸光度或透光率之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。建立內(nèi)毒素濃度與吸光度或透光率關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-OD曲線或C-Rt曲線），用供試品的吸光度或透光率比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。27回歸分析ODOD10T(秒)C1C2C3OD=k*C+bODOD1OD2OD3C3C2C1C（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線OD2OD3預(yù)設(shè)反應(yīng)時間（T）左圖為反應(yīng)示意，終點法測試通常無法觀測到反應(yīng)曲線28（2）測定供試品內(nèi)毒素濃度（Cx）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品（X）反應(yīng)，得到吸光度值ODx，比對C-OD關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cx。TODxODCx比對標(biāo)準(zhǔn)曲線OD=k*C+bODC預(yù)設(shè)反應(yīng)時間（T）ODx左圖為反應(yīng)示意，終點法測試通常無法觀測到反應(yīng)曲線29（三）光度法BET試驗器具光度測定儀和BET軟件試劑實驗用具30光度測定儀光度法試驗需在特定的儀器中進行，溫度一般為37±1℃。供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進行。31光度測定儀——FC/ET型

酶標(biāo)分析儀特點：8位濾光片輪，標(biāo)配3塊濾光片：405nm、450nm和620nm；具有線性振蕩；恒溫孵育功能；可用于：動態(tài)濁度法、動態(tài)顯色法和微板法動態(tài)顯色鱟試驗系統(tǒng)；通量大：96孔板（一次性）芬蘭Thermo（賽默飛）FC/ET型

酶標(biāo)分析儀32光度測定儀——ELx808IU酶標(biāo)儀特點：6碟濾光輪，標(biāo)配405、450、490、340和630nm波長可使用多波長同時分析，消除本底干擾；精確溫控：37.0±0.5℃；通量大：96孔板（一次性）美國Biotek（伯騰）ELx808IU酶標(biāo)儀33光度測定儀——試管儀LabKinetics（萊伯金耐特）ATi/LKL/LKM系列動態(tài)試管檢測儀特點：體積小巧，占用空間小；恒溫性能優(yōu)越、各孔溫度均在37±0.2℃；型號多，32孔、64孔和96孔；單波長和雙波長可選擇；每個孔有獨立開關(guān)，獨立計時，方便隨時添加檢測樣品；反應(yīng)管：可重復(fù)使用的玻璃管。34Endosafe?

Nexgen-PTS?

特點：便攜式設(shè)備和試劑卡片組成的系統(tǒng)；快速：15分鐘內(nèi)獲得定量結(jié)果；操作簡單：只需要插入卡片，加入供試品即可檢測；便攜：定量儀、分析軟件的一體化，可以攜帶的內(nèi)毒素分析平臺，帶有鋰電池，續(xù)航可滿足一天的工作需求。光度測定儀——卡片式快速檢測儀35Endosafe?

MCS?

特點：使用與PTS相同的試劑卡片;5個通道，可同時檢測5個樣品。光度測定儀——卡片式快速檢測儀Endosafe?Nexus?特點：MCS和自動化平臺的結(jié)合;全自動檢測系統(tǒng);3小時自動檢測48-60個樣品。36細菌內(nèi)毒素檢測軟件生物探針5特點：用戶分級管理和權(quán)限分配，密碼保護等；審計追蹤功能常規(guī)采集和快速采集模式，最快5分鐘可判斷供試品是否合格；檢測結(jié)果可導(dǎo)出Excel表格，方便樣品分析；符合數(shù)據(jù)完整性要求。37細菌內(nèi)毒素檢測軟件EndoScan-V完全符合聯(lián)邦條例法典第21款第11條關(guān)于電子記錄的要求。電子簽名功能38試劑光度法BET鱟試劑鱟試劑動態(tài)濁度法終點濁度法

動態(tài)顯色法

終點顯色法

規(guī)格1.25ml/支/0.35ml/支1.25ml/支0.45ml/支檢測范圍10-0.01EU/ml3-4個數(shù)量級/50-0.005EU/ml3-4個數(shù)量級0.5-0.05EU/ml1個數(shù)量級39試劑內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品

RSE或經(jīng)RSE標(biāo)化的CSE細菌內(nèi)毒素檢查用水

內(nèi)毒素含量小于0.005EU/ml且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。40試驗器具器具分類器具名稱反應(yīng)容器玻璃試管（外徑8×75mm或10×75mm）、微孔平板稀釋容器大口徑玻璃試管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及無熱原吸頭等儀器光度儀、天平、電熱干燥箱（溫度250℃以上）、旋渦混合器其他試管架、異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標(biāo)記紙等凡是與供試品或反應(yīng)試劑接觸的器具，必須經(jīng)除熱原處理。41（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗試驗?zāi)康尿炞C實驗室的條件驗證實驗人員的實驗技能是否滿足BET試驗的要求驗證實驗所用試劑驗證實驗所用器具42（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗試驗流程圖內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（RSE或CSE）鱟試劑開啟內(nèi)毒素測定儀預(yù)熱設(shè)定復(fù)溶、混合反應(yīng)容器，內(nèi)毒素每個濃度至少3支平行管，陰性對照平行2管在內(nèi)毒素測定儀中反應(yīng)制成至少3個濃度的稀釋液，相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限使用軟件進行數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判斷復(fù)溶123564431.陰性對照的吸光度或透光率小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點檢測值或反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點的反應(yīng)時間；2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980；3.變異系數(shù)CV<10%判斷標(biāo)準(zhǔn)藥典要求:建議值:（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗ChP（2015年版）增加終點法判斷，更合理44何時需做這個試驗?zāi)兀?、使用新批號的鱟試劑2、試驗條件有任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變45（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗例子：動態(tài)顯色法1.試劑名稱廠家裝量規(guī)格動態(tài)顯色法鱟試劑安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）中檢院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素<0.003EU/ml462.儀器及軟件信息儀器名稱ET酶標(biāo)分析儀廠家賽默飛世爾波長405nm軟件名稱生物探針５（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗例子473.反應(yīng)溶液制備選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：2.0、0.2、0.02EU/ml；取CSE1支，打開加入1ml水復(fù)溶，旋渦混合15分鐘，得原液100EU/ml的內(nèi)毒素溶液記為E1004.復(fù)溶鱟試劑E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW485.進入軟件，設(shè)置試驗參數(shù)及反應(yīng)項目試驗方法預(yù)設(shè)OD試劑批號試驗布板496.加樣：按項目布板位置加樣0.025ml鱟試劑溶液＋0.025ml內(nèi)毒素溶液,每個濃度平行三孔，NC平行二孔7.反應(yīng)：把反應(yīng)板放置儀器中，設(shè)置反應(yīng)60分鐘50陰性對照反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度反應(yīng)時間相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.980CV＜10％8.試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析519.結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：2.0~0.02EU/mlTNC

＞T

λ；|r|≥0.980,CV<10%標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定!5252變異系數(shù)變異系數(shù)(CoefficientofVariation):用于比較兩個或多個數(shù)據(jù)離散程度的大小。變異系數(shù)越大，其離散程度的測度值越大（平行管重復(fù)差），反之越?。ㄆ叫泄苤貜?fù)好）。變異系數(shù)CV=(標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean)×100%5353(五）產(chǎn)品驗證：干擾試驗?zāi)康模捍_定日常檢測供試品的制備方法（檢測濃度或稀釋倍數(shù)）不管是哪一種光度法，簡單的說分為兩個階段階段1干擾初篩試驗階段2三批產(chǎn)品干擾驗證試驗54階段1：干擾初篩目的：初步找到供試品的無干擾濃度選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線（確定λ）計算內(nèi)毒素限值，C或MVD用一批產(chǎn)品制備供試品溶液介于未稀釋的供試品原液到C或MVD之間原理：在供試品溶液中添加已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，計算內(nèi)毒素回收率，判斷供試品濃度對BET的干擾情況。55驗證三批產(chǎn)品用干擾初篩確定的無干擾稀釋倍數(shù)/濃度進行試驗如果可能請留一個安全系數(shù)小結(jié)：干擾初篩：一個批次測多個濃度干擾試驗：三個批次測一個濃度階段2：干擾試驗56A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液

B為加入m內(nèi)毒素且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液

C為用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液

D為陰性對照反應(yīng)項目設(shè)置編號內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點（或附近點）的濃度（設(shè)為λm）供試品溶液至少2C至少3個濃度（最低點設(shè)定為λ）檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少257標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇小建議考慮檢測范圍檢測靈敏度（與MVD有關(guān)）檢測范圍供試品的內(nèi)毒素水平一般選擇等比濃度，主要是線性要好不要選太高濃度581.標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗”中的要求2.回收率R滿足：50%≤R≤200%3、變異系數(shù)CV<10%判斷標(biāo)準(zhǔn)藥典要求建議值59回收率（R）的計算R=（CS-Ct)/λm×100%Ct:供試品內(nèi)毒素含量；Cs:含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品內(nèi)毒素含量；λm：人為添加的內(nèi)毒素濃度；例子：某供試品內(nèi)毒素含量0.05676EU/ml；含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品內(nèi)毒素含量0.24534EU/ml；λm：0.2EU/ml；R=（0.24534-0.05676)/0.2×100%=94.29%601.干擾初篩試驗舉例例子-動態(tài)顯色法試驗KCA（1）供試品名稱及內(nèi)毒素限值供試品名稱規(guī)格內(nèi)毒素限值注射用烏司他丁10萬單位/瓶1.25EU/10000單位61（2）儀器及軟件信息1.干擾初篩試驗舉例儀器名稱ET酶標(biāo)分析儀廠家賽默飛世爾波長405nm軟件名稱生物探針５62（3）試劑信息名稱廠家裝量規(guī)格動態(tài)顯色法鱟試劑安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）中檢院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素<0.003EU/ml63（4）選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍2.0~0.02EU/ml

λ=0.02EU/ml；λm=0.2EU/ml；（5）最大有效稀釋倍數(shù)MVD的計算

取供試品1瓶，加入2ml檢查用水溶解后混合，供試品原液濃度為5萬單位/ml;MVD=CL/λ=5萬單位/ml×1.25EU/1萬單位/0.02EU/ml=312.5(倍）

64（6）各反應(yīng)溶液的制備溶液C的制備

溶液A的制備取供試品1瓶加入2ml水溶解后，稀釋至10倍（S10）、20倍（S20）和40倍（S40）E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW65溶液B的制備：配制供試品的10倍、20倍和40倍稀釋液中含有0.2EU/ml的溶液制備方法參照凝膠法溶液B的制備方法：方法A：等比稀釋法方法B：近似稀釋法66（7）加樣及反應(yīng)反應(yīng)項目設(shè)置編號反應(yīng)項目平行管D陰性對照BET水C標(biāo)準(zhǔn)曲線E0.02E0.2E2.0A供試品溶液S10、S20、S40B供試品回收溶液S10、S20、S40中添加0.2EU/ml的內(nèi)毒素溶液6710倍回收率：113.44%20倍回收率:101.15%TNC（>3600s）>Tλ相關(guān)系數(shù)絕對值|r|=0.9994>0.980試驗有效有干擾40倍回收率:110.69%無干擾無干擾試驗有效（8）試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析68（9）結(jié)果判斷內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.020.22.0陰性對照反應(yīng)時間（秒）2468.51255685.5>3600相關(guān)系數(shù)-0.9994標(biāo)準(zhǔn)曲線信息供試品批號1檢測濃度S10S20S40回收率（%）113.44101.15110.6950%~200%符合符合符合結(jié)果判斷69（10）結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：2.0~0.02EU/mlTNC

＞T

λ；|r|≥0.980；CV<10%標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定!注射用烏司他丁稀釋10倍以上時，無干擾702.干擾試驗舉例（1）根據(jù)干擾初篩試驗結(jié)果，確定選擇供試品的無干擾濃度無干擾選擇回收率接近100%的稀釋倍數(shù)*本試驗選擇10倍稀釋液為干擾驗證濃度。無干擾無干擾71（2）反應(yīng)項目設(shè)置溶液編號反應(yīng)項目平行管D陰性對照BET水OOC標(biāo)準(zhǔn)曲線E0.02OOE0.2OOE2.0OOA1供試品溶液S10OOB1供試品回收溶液S10E0.2OOA2供試品溶液S10OOB2供試品回收溶液S10E0.2OOA3供試品溶液S10OOB3供試品回收溶液S10E0.2OO72（3）試驗結(jié)果相關(guān)系數(shù)絕對值|r|=0.9998>0.980TNC（>3600s）>Tλ試驗有效試驗有效試驗有效試驗有效無干擾73（4）結(jié)果判斷內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.020.22.0陰性對照反應(yīng)時間（秒）23341217.5663>3600相關(guān)系數(shù)-0.9998標(biāo)準(zhǔn)曲線信息供試品批號123檢測濃度（S10）S10S10S10反應(yīng)時間（S）174221991512回收率（%）94.2984.5796.7450%~200%符合符合符合結(jié)果判斷74

TNC

＞T

λ,|r|＞0.980,CV<10%標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定!注射用烏司他丁稀釋10倍時，3批供試品的回收率在84.57%~96.74%，無干擾；可以作為日常檢查濃度。試驗有效75（六）檢查法（日常檢查）根據(jù)干擾試驗結(jié)果，選擇無干擾的供試品濃度進行BET日常檢查各反應(yīng)溶液的制備及反應(yīng)項目設(shè)置與干擾試驗相同76判斷標(biāo)準(zhǔn)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗”中的要求2、回收率R滿足：50%≤R≤200%3、變異系數(shù)CV<10%若內(nèi)毒素含量＜L，判供試品符合規(guī)定；若內(nèi)毒素含量≥

L，判供試品不符合規(guī)定。

藥典要求建議值77日常檢查舉例-注射用烏司他丁1.供試品名稱及內(nèi)毒素限值供試品名稱規(guī)格內(nèi)毒素限值注射用烏司他丁10萬單位/瓶1.25EU/10000單位干擾試驗結(jié)論：注射用烏司他丁稀釋10倍時，無干擾。78溶液編號反應(yīng)項目平行管D陰性對照BET水OOC標(biāo)準(zhǔn)曲線E0.02OOE0.2OOE2.0OOA供試品溶液S10OOB供試品回收溶液S10E0.2OO2.反應(yīng)項目設(shè)置79標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍2~0.02EU/ml,反應(yīng)平均時間663.0~2334秒。相關(guān)系數(shù)絕對值|r|=0.9998>0.980TNC（>3600s）>Tλ試驗有效試驗有效3.試驗結(jié)果試驗有效804.結(jié)果判斷內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.020.22.0反應(yīng)時間（秒）23341217.5663標(biāo)準(zhǔn)曲線信息供試品批號123檢測濃度（S10）S10S10S10反應(yīng)時間（S）174221991512回收率（%）94.2984.5796.74內(nèi)毒素值（EU/萬單位）1.1360.4841.89結(jié)果判斷合格合格不合格結(jié)果判斷接近限值，慎重！81光度法報告解讀

實測值？原液濃度？參考值？該報哪一個值好呢？82實測值：將反應(yīng)時間代入回歸方程中計算得到的內(nèi)毒素濃度。表示反應(yīng)容器中的供試品中的內(nèi)毒素含量。當(dāng)超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時，則是外推值。原液濃度：表示未經(jīng)稀釋的供試品的內(nèi)毒素含量。當(dāng)實測值在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測范圍內(nèi)時：原液濃度=實測值x稀釋倍數(shù)（或?qū)崪y值÷濃度）；當(dāng)實測值在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測范圍外時：大于最高檢測限，原液濃度表示為>標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度x稀釋倍數(shù)（或?qū)崪y值÷濃度）；小于最低檢測限，原液濃度表示為<標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度x稀釋倍數(shù)（或?qū)崪y值÷濃度）；參考值：實測值x稀釋倍數(shù)（或?qū)崪y值÷濃度）。僅當(dāng)實測值為外推值時出現(xiàn)。僅供參考。83還是不明白…0.05EU/ml0.5EU/ml5EU/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線可測范圍0.05~5EU/ml舉例：假設(shè)某供試品檢測濃度為10mg/ml建立標(biāo)準(zhǔn)曲線0.05、0.5、5EU/ml實測值：0.15EU/ml原液濃度：0.015EU/mg實測值：6.2EU/ml（外推值）原液濃度：>0.5EU/mg參考值：0.62EU/mg外推值外推值84（七）BET常見異常結(jié)果分析光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性不合格變異系數(shù)大內(nèi)毒素回收率不合格陰性對照不合格不正確的預(yù)設(shè)Rt或OD值，導(dǎo)致的異常結(jié)果851.線性不足標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素某個標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度制備誤差標(biāo)準(zhǔn)品旋渦混合不充分標(biāo)準(zhǔn)品儲存不當(dāng)或用具干擾試劑污染檢測能力不足儀器設(shè)置不