菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定

關于菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定第1頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六主要內容菌落總數(shù)測定大腸菌群測定MPN法原理（拓展內容）第2頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六菌落總數(shù)測定掌握菌落總數(shù)測定方法實驗原理 不同稀釋度的樣品，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃，48h（水產(chǎn)品30℃，72h），菌落數(shù)第3頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六菌落總數(shù)測定器材與試劑：樣品，無菌生理鹽水，平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，培養(yǎng)皿第4頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六菌落總數(shù)測定第5頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六傾注培養(yǎng)第6頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六培養(yǎng)結果第7頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六菌落總數(shù)測定實驗步驟

5.菌落計數(shù)：肉眼觀察，可用放大鏡，可標記必要時分區(qū)計數(shù)，菌落成片者作廢計算方法某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度（1）僅有一個稀釋度在此范圍：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)第8頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六菌落總數(shù)測定計算方法：（2）有兩個稀釋度在30-300之間菌落數(shù)之比>2，選較小值菌落數(shù)之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300

取稀釋倍數(shù)最大者（4）所有稀釋度均<30

取稀釋倍數(shù)最小者（5）沒有任何稀釋度在30-300之間選最接近該范圍者結果單位：CFU/ml（g）第9頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六菌落總數(shù)測定注意事項：

1.無菌操作

2.標記

3.何時更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養(yǎng)基保溫

6.安全常識第10頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六大腸菌群數(shù)測定實驗目的實驗原理

36℃，48h，產(chǎn)氣（小倒管）三步法：初發(fā)酵、復發(fā)酵器材與試劑樣品、無菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯

1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管第11頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六初發(fā)酵器材與試劑樣品、225ml無菌生理鹽水、9ml無菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球第12頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六大腸菌群數(shù)測定實驗步驟：

1.初發(fā)酵

第13頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六第14頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六第15頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六吸取樣品方法第16頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六加注樣品第17頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六初發(fā)酵結果右邊為陽性結果，小倒管內有氣體產(chǎn)生。第18頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六實驗步驟

3.復發(fā)酵（1）選取產(chǎn)氣試管（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養(yǎng)：36℃，48h

（4）觀察指標：若產(chǎn)氣則報告大腸菌群陽性。第19頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六大腸菌群數(shù)測定實驗步驟

2.分離培養(yǎng)（1）制備伊紅美藍平板：

45℃，無菌，傾注，15ml

（2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（3）接種至伊紅美藍平板分區(qū)劃線法（4）培養(yǎng)：36℃，48h第20頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六分離培養(yǎng)器材與試劑初發(fā)酵結果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基第21頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第22頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六分區(qū)劃線法操作要點

1.劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán)

2.劃線時接種環(huán)同平板呈30-40°角

3.每次劃線應該壓到上一個區(qū)域的2-3條線

4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動第23頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六大腸菌群數(shù)測定實驗步驟

2.分離培養(yǎng)：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深（6）革蘭染色、鏡檢：選特征菌落第24頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六革蘭染色法器材與試劑結晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙第25頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六革蘭染色法涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定：通過火焰若干次初染：結晶紫一滴，1min，水洗媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗脫色：95%乙醇，30s或至無色為止復染：復紅一滴，30s第26頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六涂片第27頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六熱固定第28頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六初染第29頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六媒染第30頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六脫色第31頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六復染第32頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性革蘭染色法第33頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六復發(fā)酵器材與試劑培養(yǎng)24小時后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復發(fā)酵管第34頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六大腸菌群數(shù)測定實驗步驟

3.復發(fā)酵（1）選取鑒定為無芽孢G-桿菌的菌落1-3個（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（3）培養(yǎng)：37℃，24h

（4）觀察指標：產(chǎn)酸，產(chǎn)氣第35頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六液體接種第36頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六復發(fā)酵復發(fā)酵陽性結果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內有氣體產(chǎn)生第37頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六大腸菌群數(shù)測定注意事項：

1.無菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.顯微鏡保養(yǎng)

5.液體接種第38頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）目的：對某種細菌進行選擇性計數(shù)核心思想：泊松分布實施方法：多次稀釋直至無菌，每個稀釋度分別接種若干培養(yǎng)管，根據(jù)陽性管數(shù)估算MPN值第39頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1.細菌進入發(fā)酵管的概率近似服從泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:細菌濃度，k:進入發(fā)酵管的細菌數(shù)2.若在n管發(fā)酵中，令接種水樣量為Vi，陽性管數(shù)為Pi，陰性管數(shù)為Qi，則該檢驗結果發(fā)生的概率為：

其中C為常系數(shù)

V為總水樣量，x為細菌個數(shù)第40頁，共43頁，2022年，5月20日，7點35分，星期六MPN法原理3.當y(x)max，XMPN4.由于y(x)為單極值函