蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定及其進(jìn)展

關(guān)于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定及其進(jìn)展第1頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的概述:研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是目前分子生物學(xué)的中心課題之一.1953年英國人F.Sanger首先第一個完成牛胰島素的測定工作.同時此人還是第一個搞清ф×175phageDNA的一級結(jié)構(gòu)的學(xué)者,為此兩次獲得諾貝爾獎.第2頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六1969年,基本與應(yīng)用化學(xué)國際聯(lián)合會規(guī)定以各種氨基酸按一定的順序排列構(gòu)成的蛋白質(zhì)肽鏈骨架為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu).1.多肽鏈的數(shù)目;2.每一條多肽鏈末端氨基酸的種類;3.每一條多肽鏈氨基酸中氨基酸的數(shù)目、種類和排列順序;4.鏈內(nèi)二硫鍵的位置和數(shù)目

5.鏈間二硫鍵的位置和數(shù)目第3頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)研究需要一級結(jié)構(gòu)的知識;

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)如:牛胰核糖核酸酶的復(fù)性實驗基因工程中包涵體的問題蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與分子進(jìn)化的關(guān)系;

細(xì)胞色素C是廣泛存在于需氧生物線粒體呼吸鏈中的起傳替作用的一種蛋白質(zhì)通過它可以繪出生物進(jìn)化樹,一般在進(jìn)化樹位置相距越遠(yuǎn),則氨基酸的順序差別越大.一級結(jié)構(gòu)與遺傳病(分子病);

鐮刀狀細(xì)胞貧血癥中的血紅蛋白(HbS),他僅是β-鏈上第六號的Glu變?yōu)閂al，從而導(dǎo)致生物功能上的巨大差異第4頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六多肽激素功能以及作用；酶原激活與激素原的激活；酶原與激素原均是酶和激素的前體，均無生物活性，但經(jīng)過特殊處理如激酶作用，肽段切除，氨基酸的置換等則可使其具有生物活性。蛋白質(zhì)工程研究發(fā)展；利用一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的知識在蛋白質(zhì)工程中廣泛應(yīng)用第5頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要意義用來研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系;可用于分子克隆中寡核苷酸的制備為cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列提供證據(jù)為重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作指紋分析蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)鑒定確定翻譯后修飾的位點決定簇的定位二硫鍵的確定第6頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的進(jìn)展1953年的Sanger測定胰島素全部氨基酸序列蛋白質(zhì)測序的基本思路與測定氨基酸序列的化學(xué)法與酶法1967年推出基于Edman機理的液相（旋轉(zhuǎn)杯）自動蛋白質(zhì)測序儀1970華裔科學(xué)家張瑞耀采用DABITC試劑（4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-4`-異硫氰酸酯）與PITC偶聯(lián)提高靈敏度1970年代推出固相序列分析儀，彌補液相序列分析儀不適合分析小肽（＜30個殘基的肽）不足1980年代Hewwick推出氣相序列分析儀1980年代通過測定DNA順序推出蛋白質(zhì)序列1980年代質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)序列測定中應(yīng)用第7頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六目前蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)通過經(jīng)典測定方法已經(jīng)搞清近幾百種目前蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定可上千個氨基酸,如牛皮膠元(1052)、RNApolymerase(1407)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫大多來源于DNA推導(dǎo)序列第8頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的戰(zhàn)略從DNA開始推蛋白質(zhì)的氨基酸順序從蛋白質(zhì)開始進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)第9頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六從DNA推測蛋白質(zhì)的氨基酸順序第10頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六目的蛋白的N、C末端均已知目的蛋白的N末端已知目的蛋白的N、C末端均不知第11頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六從蛋白質(zhì)開始進(jìn)行氨基酸的序列分析序列分析的關(guān)鍵：

1蛋白樣品的純度；

2氨基酸組成與分子量關(guān)系；

3重疊(序列的重建)也有一些特例：組蛋白和一些同功酶第12頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)序列分析的一般步驟第13頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的關(guān)鍵步驟二硫鍵的拆除與大片肽段的分離;末端分析;多肽的一次性降解;肽段氨基酸的序列測定;二硫鍵位置的確定;第14頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六二硫鍵的拆除與大片肽段的分離

1直接拆除并固定-SH(過甲酸氧化)2拆除后再固定(利用還原劑還原)

3大片段的分離第15頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

1直接拆除并固定-SH(過甲酸氧化)

兩個-SH全部能轉(zhuǎn)變?yōu)榛撬峄?被氧化的Cys稱為磺基Ala)過甲酸是強氧化劑,MetTrp也可能被氧化低溫,過甲酸的濃度,一般不超過10%反應(yīng)不可逆第16頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六2拆除后再固定(利用還原劑還原)1)β-巰基乙醇還原:

還原劑處理前需用變性劑處理蛋白反應(yīng)可逆

β-巰基乙醇濃度必需在第17頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六2)Cleland試劑的還原:Cleland試劑指的是二硫赤蘇糖醇,二硫蘇糖醇。還原能力上是較強的試劑,只要0.01M就使-S-S-還原,在許多球蛋白反應(yīng)中可以不用變性劑.

第18頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六3)-SH的固定烷基試劑使-SH轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的硫醚衍生物氨乙基化乙睛化第19頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六3大片段的分離蛋白質(zhì)多肽鏈拆開后,可以通過凝膠柱分離如果蛋白質(zhì)分子的幾條肽鏈以非共價鍵結(jié)合,則可用尿素鹽酸胍變性劑進(jìn)行拆分.第20頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六蛋白質(zhì)或多肽末端分析

N端分析C端分析第21頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六N端分析:丹磺酰氯法(dansyl-cl);靈敏度高,一般氨基酸都是可以的.但對H、R、W、C不完全成功;D、N、E、Q不能分,生成強熒光磺酰胺衍生物;PITC(苯異硫氰酸酯)法;基本上是成功的,但對S、T收率偏低.首先Edman用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N端;Dabitc;4-二甲基氨基偶氨苯異硫氰酸酯;氨肽酶;亮氨酸氨肽酶;FDNB;2.4-二硝基氟苯(FDNB)生成DNP-氨基酸.首先Sanger用來測定多肽或蛋白質(zhì)的N端氨基酸;氰酸鹽第22頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六三種氨基酸末端分析方法的對比試劑反應(yīng)產(chǎn)物備注名稱結(jié)構(gòu)式氟-2,4-二硝基苯肽的黃色二硝基苯的衍生物從肽鏈上水解新生成的N-末端產(chǎn)物,破壞其它肽鍵丹磺酰氯強熒光磺酰胺衍生物異硫氰酸苯苯硫氰甲?；苌锉痉ū苊馍鲜龆ㄈ毕莸?3頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

封閉N端的測定:如果蛋白質(zhì)或多肽的N端是封閉的,則不能和上述反應(yīng),如蛋白乙?；?兔肌紅蛋白)、蛋白甲酰化(蜂毒素)、焦谷氯酰環(huán)化(兔免疫球蛋白)、丙酰氯環(huán)化以及環(huán)肽(短桿菌酪肽A)1N端甲?；蛞阴；梢杂脺睾退崴饣蛳鄳?yīng)的脫?；?2焦谷氯酰殘基可通過酶解法和化學(xué)降解法來裂解;第24頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六C端分析:

目前N-端氨基酸序列測定應(yīng)用Edman化學(xué)降解法已經(jīng)達(dá)到高度自動化,微量化,可以分析蛋白質(zhì)N端20-40或更多的氨基酸殘基,但是不少蛋白質(zhì)尤其是哺乳動物及高等植物中N端被修飾封閉,且封閉方式不盡相同,因此給蛋白質(zhì)N端測定帶來困難.因此人們希望從C端獲得一些信息,C端序列研究對研究多肽加工,DNA重組產(chǎn)物質(zhì)量監(jiān)控都很重要,同時cDNA起始于C端,因此了解C端氨基酸殘基序列更有助于DNA克隆并得到正確的基因結(jié)構(gòu).另外許多報道指出C端和生物活性有重要關(guān)系.第25頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

雖然C端研究很重要，但C端研究仍處于研究和發(fā)展階段,雖有自動分析儀，但多是由N端分析儀改裝而來,其基本結(jié)構(gòu)相同。兩者不同之處在于:1反應(yīng)所用的試劑不同;2C端序列儀中所有化學(xué)反應(yīng)均應(yīng)在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行不需再轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化。第26頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六C端分析比較困難，常用的有酶法和化學(xué)法:1化學(xué)法主要是肼解法:

肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。注意:1肼解絕對避免水分子的存在;2對于羧基末端氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)菐в絮０返腝、N,則肼解不能產(chǎn)生游離的羧基末端的氨基酸;3對Cys會發(fā)生分解需先氧化或烷化第27頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六

羧肽酶法：現(xiàn)在通常用酶法,但是酶法需先進(jìn)行酶的動力學(xué)實驗以及選擇合適酶的濃度及反應(yīng)時間使釋放出的氨基酸主要是C端氨基酸.

將蛋白質(zhì)在pH8.0,30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。第28頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六多肽的專一性降解（specificcleavageoftheprotein）

大于20的多肽一般需要預(yù)先進(jìn)行降解，盡管目前的測序可以一次測定60-70氨基酸殘基，但由于氨基酸組成、純度、產(chǎn)率等因素的影響這種幾率比較少。多肽的降解不外于化學(xué)法和酶法倆種?；瘜W(xué)法（大片段）

A:Cyanogenbromide(CNBr)它選擇性的切斷Met殘基的羧基側(cè)肽鏈，將Met轉(zhuǎn)化為高絲氨酸（Homoser)和高絲氨酸內(nèi)酯(Homoserinelactone)。在氨基酸組成分析時高絲氨酸和高絲氨酸內(nèi)酯相距甚遠(yuǎn)。高絲氨酸在絲氨酸之后，而高絲氨酸內(nèi)酯在組氨酸之后。計算時可將高絲氨酸和高絲氨酸內(nèi)酯相加，計算甲硫氨酸的量。第29頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六CNBr切割優(yōu)點：一般蛋白質(zhì)中甲硫氨酸含量較少，可得大的片段；專一性強，只作用于甲硫氨酸；產(chǎn)率在80%以上；作用條件溫和操作方便。注意：CNBr要新鮮，易氧化產(chǎn)生副產(chǎn)物。一般變黃后就不能用；CNBr有毒；注意在氨基酸分析同片段大小不符合時一定要注意，是否有Met漏掉；CNBr/Met=500：1可克服干擾提高產(chǎn)率；如蛋白質(zhì)中含Asp-Pro鏈，會出現(xiàn)所得肽段數(shù)目比根據(jù)Met量預(yù)計的數(shù)目多的現(xiàn)象；第30頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六其他裂解肽的方法：A：部分酶分解法：0.1NHCl在110度或6NHCl在37度水解，但特異性不強，因此對大片段和肽均不適用；B：羥胺法：反應(yīng)機理是通過羥胺作用，先形成一個琥珀酰亞胺環(huán)狀物然后導(dǎo)致肽鍵的裂解。羥胺專一性的裂解Asn-Gly的肽鏈，產(chǎn)率可達(dá)70%以上。但酸性條件下切割A(yù)sn-Pro；C：稀酸切割A(yù)sp-Pro肽鍵：蛋白質(zhì)中Asp-Pro鍵對酸不穩(wěn)定；D：CleavageatTrpresidesbyo-iodosobenzoineacid(亞碘?；郊姿幔┊a(chǎn)率：70%-100%

第31頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六酶法（小片段）：酶水解法較化學(xué)法具有較多的優(yōu)越性，使用也較廣泛，因其具有較高的專一性，而且水解產(chǎn)率較高，利用不同的酶可以獲得不同的肽的片段，加以比較就可獲得整個肽的順序。胰蛋白酶（Trypsin）最專一，一般肽鏈切割首選胰蛋白酶，但對Lys-Pro或Arg-Pro不切或較慢。胰蛋白酶是從胰臟中提取的蛋白水解酶，常含有胰凝乳蛋白酶，因此在測序時用 TPCK-Trypsin（即含有凝乳蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶）

TPCK=對甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲酮如果酶解片段過大，用Sephadex.G-50,對于小的片段可直接上HPLC第32頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六1：ModificationofLys

如果Lys或Arg在蛋白質(zhì)中過多，不能獲得大片段可用順丁烯二酸酐修飾Lys.一旦形成不被胰蛋白酶水解，在酸性條件下可去封閉，再被胰蛋白酶水解。2：ModificationofArg

丙烷-2.3-二酮或環(huán)己烷-1.2-二酮修飾，若有二硫鍵存在則環(huán)己烷-1.2-二酮則不起作用。3：ModificationofCys

通過修飾生成Lys的類似物，可被胰蛋白酶水解，從而在Cys處斷裂。對于酶切后多肽片段過多過小或過大的情況處理第33頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六小肽段（20左右氨基酸）的序列測定：

肽的氨基酸測定主要是使用Edman化學(xué)降解法，此外還有酶解法、酶解-肽譜重疊法以及氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

偶聯(lián)(FITC偶聯(lián)在多肽的N末端）裂解（三氟乙酸）轉(zhuǎn)化（強酸）pTH氨基酸的鑒定（ATZ-噻唑啉酮胺）第34頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六目前在Edman法基礎(chǔ)上產(chǎn)生一些新的方法：1。DNS-Edman序列分析法：利用DNS-Cl測定N末端殘基，用Edman法去降解多肽，然后純化少一個氨基酸殘基的多肽，再用DNS-Cl測其N-末端殘基；2。減數(shù)Edman法：利用Edman法降解肽鏈的N末端氨基酸殘基，逐次從肽鏈中除去一個N-末端殘基，并隨后分析相應(yīng)剩余肽鏈氨基酸組成，從而從每個循環(huán)中得知N端氨基酸的排列順序；3。DABITC/PITC雙偶合法；外肽二肽酶測定肽序列：（每隔2個殘基切一次）第一次，酶水解得一個二肽，純化，測定結(jié)構(gòu)；第二次先從N-末端切去一個殘基再用外肽酶水解得一個二肽，純化，測定結(jié)構(gòu)，然后兩者比較就可得被測肽的序列。

第35頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六多肽片段的重疊重疊第36頁，共44頁，2022年，5月20日，4點40分，星期六二硫鍵位置的確定：一般用二種方法：1用酶直接水解變性的蛋白：由于二硫鍵只在偏酸性條件下才穩(wěn)定（在堿性條件下易發(fā)生交換），因此常用胃蛋白酶水解，且此酶專一性低，位點多，