聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用課件

1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用分子生物學(xué)

1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用分子生物學(xué)2022/11/27^2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)是生命科學(xué)界的重大發(fā)明，是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測(cè)的靈敏度，理論上其檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到一個(gè)細(xì)胞、甚至一個(gè)分子的水平。

2022/11/27^2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase2022/11/27^3PCR發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的發(fā)明人，一般公認(rèn)是凱利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。1983年4月穆利斯萌發(fā)了PCR的構(gòu)想;1985關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表;1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn),并于當(dāng)年11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀；1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來；1990Cetus科學(xué)家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法；1991TaqMan技術(shù)發(fā)表；九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開；1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)。2022/11/27^3PCR發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的發(fā)明人，一般公2022/11/27^4引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/11/27^4引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合2022/11/27^5KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2022/11/27^5KaryB.Mullis2022/11/27^6PCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測(cè)其他……2022/11/27^6PCR的應(yīng)用研究2022/11/27^7PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在體內(nèi)，DNA復(fù)制是周期性的，所以基因擴(kuò)增的數(shù)量有限；PCR技術(shù)在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因子，通過對(duì)溫度的控制，使DNA不斷位于變性、復(fù)性和合成的循環(huán)中，達(dá)到擴(kuò)增DNA的目的。2.PCR基本原理2022/11/27^7PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留2022/11/27^8模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸圖6-1PCR原理示意圖2022/11/27^8模板DNA94℃變性55℃退火72℃2022/11/27^91234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/11/27^91234522557294時(shí)間（mi2022/11/27^10PCR產(chǎn)物生成曲線擴(kuò)增產(chǎn)物循環(huán)次數(shù)指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增平臺(tái)期2022/11/27^10PCR產(chǎn)物生成曲線擴(kuò)增產(chǎn)物循環(huán)次數(shù)2022/11/27^11PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)PFU(空斑形成單位)細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA2022/11/27^11PCR的特點(diǎn)靈敏度高2022/11/27^12反應(yīng)體系：（五要素）

模板（template）引物(primer)人工合成的兩段寡核苷酸序列，決定RCP的特異性。3.PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA2022/11/27^12反應(yīng)體系：（五要素）3.PCR2022/11/27^13PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率，特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子；引發(fā)效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。2022/11/27^13PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在2022/11/27^14引物的長(zhǎng)度

典型的引物為18-24個(gè)核苷酸，在一定范圍內(nèi)引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性；引物長(zhǎng)度的上限主要與反應(yīng)效率有關(guān)，所以一般又不能太長(zhǎng)，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于72℃，即Taq酶的最適溫度。引物設(shè)計(jì)基本原則2022/11/27^14引物的長(zhǎng)度典型的引2022/11/27^15PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

一般來說，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在普通PCR以200～500bp為宜；實(shí)時(shí)熒光PCR則為50～150bp。2022/11/27^15PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度一般來說，P2022/11/27^16引物的均衡性和GC含量

引物中堿基組成應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高(非特異性擴(kuò)增)或過低（特異性降低）都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/11/27^16引物的均衡性和GC含量2022/11/27^17引物溶解溫度（Tm值）

引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.

如果引物中的G+C含量相對(duì)偏低,則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng),而保證一定的退火溫度.Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/11/27^17引物溶解溫度（Tm值）2022/11/27^18引物自身

引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗;引物3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA需嚴(yán)格配對(duì)，并最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。

5’端序列對(duì)PCR影響不如3’端大，常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。

2022/11/27^18引物自身2022/11/27^19使用PrimerPremier5.0等軟件設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊

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2022/11/27^19使用PrimerPremier2022/11/27^202022/11/27^202022/11/27^212022/11/27^212022/11/27^22-

DNA聚合酶(DNApolymerase)

PCR發(fā)明初期，不耐熱的Klenow片段耐熱的TaqDNA聚合酶－良好的熱穩(wěn)定性：92.5、95、97.5℃時(shí)，半衰期分別為130、40、5～6min；－良好的延伸效率：在75～80℃時(shí)延伸效率最高，每個(gè)酶蛋白分子的延伸速度可達(dá)150個(gè)核苷酸/s；－無3′－5′外切酶活性，缺乏校正功能；2022/11/27^22-DNA聚合酶(DNApol2022/11/27^23dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:一般組成：50mMKCl,10-50mM,Tris-Cl(室溫PH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl：促進(jìn)引物退火，高濃度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性；Tris-Cl：調(diào)節(jié)pH值，使反應(yīng)體系偏堿性；MgCl2

：調(diào)節(jié)TaqDNA聚合酶活性、影響引物退火，PCR產(chǎn)物的特異性等2022/11/27^23dNTP:包括dATP、dTTP2022/11/27^241）PCR反應(yīng)成分（1）模板一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)條件2022/11/27^241）PCR反應(yīng)成分（1）模板PC2022/11/27^25（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermus

aquaticus，水生棲熱菌)

0.5-5U/100l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2022/11/27^25（2）引物濃度2022/11/27^26（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度

四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2022/11/27^26（4）dNTP2022/11/27^27（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。對(duì)于大多數(shù)的PCR引物來說，Mg2+濃度為1.5mmol/L是適宜的，如果擴(kuò)增效果不好，則調(diào)整鎂離子的濃度可能會(huì)有所幫助。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2022/11/27^27（5）Mg2+Mg2+是DNA2022/11/27^282）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94℃,30s～1min。(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定，一般比引物Tm值約低5℃。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性，但特異性低。熱啟動(dòng)：在第一輪擴(kuò)增前必須使模版DNA完全變性，一般94℃，變性5分鐘2022/11/27^282）循環(huán)參數(shù)熱啟動(dòng)：在第一輪擴(kuò)增前2022/11/27^29（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。（1~3min)（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-30次次數(shù)過多：產(chǎn)生“平臺(tái)效應(yīng)”錯(cuò)誤摻入率增加2022/11/27^29（3）延伸2022/11/27^304.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法PCR產(chǎn)物測(cè)序熒光PCR2022/11/27^304.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法凝膠電2022/11/27^31(一)瓊脂糖凝膠電泳法基本原理：DNA在電泳緩沖液中帶負(fù)電荷，將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于負(fù)極端的加樣孔，在電場(chǎng)力的作用下DNA涌向正極，并且由于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，不同DNA分子量及構(gòu)型的DNA涌動(dòng)率不同；在電泳過程中，凝膠中的EB將嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復(fù)合物發(fā)出橙紅色熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比；不同濃度的凝膠分辨DNA的有效范圍不同。操作簡(jiǎn)單，但存在EB污染。2022/11/27^31(一)瓊脂糖凝膠電泳法基本原理：操2022/11/27^32聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：分辨力高，長(zhǎng)度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2022/11/27^32聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：2022/11/27^33(二)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶可識(shí)別特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息用途：傳染病病原體基因分型人類基因的變異性研究。是診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型的常用方法2022/11/27^33(二)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性2022/11/27^34PCR-RFLP法：

限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內(nèi)切酶2022/11/27^34PCR-RFLP法：限制性內(nèi)2022/11/27^35(三)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡(jiǎn)稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。2022/11/27^35(三)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PC2022/11/27^36PCR-SSCP過程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

解鏈構(gòu)像DAN原理過程2022/11/27^36PCR-SSCP過程2022/11/27^37優(yōu)點(diǎn)及作用：方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要。該方法和其他方法相比有較高的檢測(cè)率。首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。不足之處：只能作為一種突變檢測(cè)方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測(cè)序；電泳條件要求較嚴(yán)格；另外，由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時(shí)，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。2022/11/27^37優(yōu)點(diǎn)及作用：方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，2022/11/27^38(四)核酸探針雜交法(1)點(diǎn)雜交（dotblot）(2)反向點(diǎn)雜交（reversedotblot）(3)微孔板夾心雜交（microplatehybridization）(4)熒光探針雜交(5)Southern印跡雜交（Southernblot）2022/11/27^38(四)核酸探針雜交法2022/11/27^39樣品正對(duì)照負(fù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量

污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)擴(kuò)增過某個(gè)片段，就有可能以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生污染。因此，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候絕對(duì)不要忘了負(fù)對(duì)照。用紫外燈破壞污染物也是一個(gè)辦法5.PCR常見問題及分析2022/11/27^39樣品正對(duì)照負(fù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量污染是2022/11/27^40(1)假陽性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②陽性對(duì)照的污染。③標(biāo)本之間的交叉污染。④在采集標(biāo)本時(shí)，其他污染源帶來的污染。⑤使用帶有污染的試劑。預(yù)防措施：2022/11/27^40(1)假陽性預(yù)防措施：2022/11/27^41(2)假陰性假陰性是PCR反應(yīng)中另一個(gè)易出現(xiàn)的問題。造成的原因也比較多。可以歸納以下幾方面原因。1)標(biāo)本處理的原因。①處理標(biāo)本時(shí)，靶DNA丟失。②處理標(biāo)本時(shí)，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。③標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。2022/11/27^41(2)假陰性2022/11/27^422)PCR試劑問題。

①引物設(shè)計(jì)不合理。②TaqDNA聚合酶失活。

③

Mg2+濃度過低或是沒有加。3)PCR擴(kuò)增過程中的問題①PCR擴(kuò)增儀故障。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。

4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時(shí)沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。2022/11/27^422)PCR試劑問題。2022/11/27^43(3)引物二聚體形成引物二聚體的原因有：⑴兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)。⑵引物比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。2022/11/27^43(3)引物二聚體2022/11/27^44(4)非特異性PCR產(chǎn)物造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防措施：①引物特異性不高或用量太大，應(yīng)更換引物或降低用量；②TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量太大，應(yīng)更換酶或降低酶使用量；③Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)整其濃度；④退火溫度過低，可提高退火溫度；⑤延伸時(shí)間過長(zhǎng)，可減少延伸時(shí)間；⑥熱循環(huán)次數(shù)過多，應(yīng)適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。2022/11/27^44(4)非特異性PCR產(chǎn)物2022/11/27^456.PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）擴(kuò)增長(zhǎng)片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR2022/11/27^456.PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（2022/11/27^46圖6-3巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR（一）巢式PCR（nestedPCR）

2022/11/27^46圖6-3巢式PCR原理示意圖外2022/11/27^47提高反應(yīng)的特異性2022/11/27^47提高反應(yīng)的特異性2022/11/27^48RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA

雜化雙鏈RNA酶單鏈cDNAＤＮＡ聚合酶雙鏈cDNA（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）2022/11/27^48RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA2022/11/27^49one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。TthDNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄功能和DNA聚合功能。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42℃）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37℃），常用的逆轉(zhuǎn)錄引物有三種：①隨機(jī)引物；②Oligo（dT），只適合于3′端帶有poly(A)尾的mRNA；③特異性引物，只適合于逆轉(zhuǎn)錄目的RNA序列。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，再做PCR。2022/11/27^49one-stepRT-PCR：在2022/11/27^50經(jīng)濟(jì)2022/11/27^50經(jīng)濟(jì)2022/11/27^51（三）多重PCR（multiplexPCR）

PCR一般由一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，以此手段診斷疾病的效率低。為提高效率，常采用多重PCR技術(shù)。該技術(shù)是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。2022/11/27^51（三）多重PCR（multiple2022/11/27^52用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物2022/11/27^52用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。2022/11/27^53乳頭瘤病毒（ＨＰＶ）檢驗(yàn)及分型

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性中僅次于乳腺癌。我國每年有宮頸癌新發(fā)病例１３.１５萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的２８.２％。臨床科學(xué)研究表明，ＨＰＶ持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的直接原因。ＨＰＶ可分為高危型和低危型兩種，不同的ＨＰＶ亞型在致癌性方面存在很大的差別。至今發(fā)現(xiàn)的ＨＰＶ病毒約有１２３種，至少有２０種高危型ＨＰＶ會(huì)構(gòu)成子宮頸癌。所以提早診斷ＨＰＶ感染，對(duì)ＨＰＶ尤其是高危型ＨＰＶ進(jìn)行檢驗(yàn)和分型極為重要。

2022/11/27^53乳頭瘤病毒（ＨＰＶ）檢驗(yàn)及分型宮2022/11/27^54（四）重組PCR（recombinantPCR）將兩個(gè)不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術(shù)主要應(yīng)用于DNA片段的任何位置引入點(diǎn)突變、插入、缺失以及兩個(gè)不相鄰片段的連接。其基本原理是將突變堿基、插入或缺失片段、或一種物質(zhì)的幾個(gè)基因片段的部分堿基設(shè)計(jì)在引物中，先分段對(duì)模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到的產(chǎn)物是一重組合的DNA。2022/11/27^54（四）重組PCR（recombin2022/11/27^55引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復(fù)性延伸異源部分雙鏈DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d

再次PCR5'5'3'3'（四）重組PCR（recombinantPCR）2022/11/27^55引物a引物c引物b引物d5'3'2022/11/27^56（五）錨定PCR（anchoredPCR，APCR）用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA例如，T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因5'端具有高度可變性。2022/11/27^56（五）錨定PCR（anchored2022/11/27^57（六）不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50～100:1。在PCR最初10-15個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個(gè)循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時(shí)單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列的要求。2022/11/27^57（六）不對(duì)稱PCR（asymmet2022/11/27^58已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（X）限制酶X酶切連接未知序列（七）反向PCR（inversePCR）2022/11/27^58已知序列PCR用途：限制酶切點(diǎn)（X2022/11/27^59（八）定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。定量PCR定量的理論依據(jù)：理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2n

其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù)n為擴(kuò)增次數(shù)；理論上PCR擴(kuò)增效率為100%，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不完全，即每一次擴(kuò)增中，模板不是呈2的倍增長(zhǎng)；實(shí)際應(yīng)為：Y=X(1+E)n

，其中E代表擴(kuò)增效率：E=參與復(fù)制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個(gè)PCR擴(kuò)增過程中不是固定不變的。通常X在1～105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時(shí)，E相對(duì)穩(wěn)定，原始模板以相對(duì)固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；2022/11/27^59（八）定量PCR（Quantiti2022/11/27^601．PCR定量DNA

一個(gè)或兩個(gè)拷貝的特定靶序列的細(xì)胞株即是標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)理想來源，也可使用含特定靶序列的質(zhì)粒DNA作為對(duì)照，將待檢樣品與一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照一起擴(kuò)增，檢測(cè)PCR產(chǎn)物，即可推知靶序列的含量。2．PCR定量mRNA(1)mRNA相對(duì)定量－靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量與內(nèi)源性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物量的比值

(2)競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量mRNA(3)cRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量mRNA2022/11/27^602022/11/27^61實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）與普通PCR的區(qū)別

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)與普通PCR的區(qū)別普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)2022/11/27^61實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-FQ-P2022/11/27^62如何對(duì)初始模板定量?熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？RealtimePCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)2022/11/27^62RealtimePCR實(shí)時(shí)監(jiān)2022/11/27^63實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析2022/11/27^63實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹2022/11/27^64實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件2022/11/27^64實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理----2022/11/27^65實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99

真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值2022/11/27^65實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---2022/11/27^66實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value2022/11/27^66實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---2022/11/27^67實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性2022/11/27^67實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---2022/11/27^68熒光定量PCR原理理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率XCt=X0(1+Ex)Ct=NlogX0=-

log(1+Ex)*Ct+logNXCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù)最后結(jié)論：LogX0與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量2022/11/27^68熒光定量PCR原理理想的PCR反應(yīng)2022/11/27^69

標(biāo)準(zhǔn)曲線（使用外參照物的定量PCR）

將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行RealtimePCR，就會(huì)按照起始DNA濃度由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。再由Ct值與起始模版的對(duì)數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，就可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品與標(biāo)品一樣，也可得到Ct值，并將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模版量。2022/11/27^69標(biāo)準(zhǔn)曲線（使用外參照物2022/11/27^70熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon2022/11/27^70熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？非特異性熒光標(biāo)記2022/11/27^71SYBRGreenISYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光（SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位）變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析2022/11/27^71SYBRGreenISY2022/11/27^72SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission雙鏈熒光染料SYBR-GreenI熒光染料原理示意圖2022/11/27^72SYBR-GreenI5’3’52022/11/27^73SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission2022/11/27^73SYBR-GreenI5’3’52022/11/27^74Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe公司的一個(gè)專利產(chǎn)品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申請(qǐng)2022/11/27^74Real-TimePCR，SYB2022/11/27^75熒光強(qiáng)度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI游離Tm是熔解曲線的特征值：SYBRGreenI熔解曲線分析當(dāng)雙鏈DNA解鏈一半時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，此時(shí)的溫度為溶解溫度。Tm值與PCR產(chǎn)物序列有關(guān)，對(duì)某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物其值是固定的。溶解曲線的一次曲線溶解曲線的負(fù)一次微分曲線2022/11/27^75熒光強(qiáng)度的變化是由于SYBRGr2022/11/27^76融解曲線的作用采用SYBRGreenI熒光嵌合法檢測(cè)時(shí)，可以通過溶解曲線分析，確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體2022/11/27^76融解曲線的作用采用SYBRGre2022/11/27^77

優(yōu)點(diǎn)對(duì)DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針靈敏度較高便宜

缺點(diǎn)易與非特異性雙鏈結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)引物特異性要求較高SYBRgreen的優(yōu)缺點(diǎn)2022/11/27^77優(yōu)點(diǎn)2022/11/27^78TaqMan技術(shù)TaqMan探針探針?biāo)庑碗s交探針5′3′與目標(biāo)序列互補(bǔ)5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針2022/11/27^78TaqMan技術(shù)TaqMan探針探2022/11/27^79TaqMan探針工作原理Taq酶：5′外切酶活性每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)2022/11/27^79TaqMan探針工作原理Taq酶：2022/11/27^80TaqMan應(yīng)用范圍鑒定PCR產(chǎn)物(定性）定量起始模板濃度單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)2022/11/27^80TaqMan應(yīng)用范圍鑒定PCR2022/11/27^81

優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列的高特異性

--陰性結(jié)果確定引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)性比較好

缺點(diǎn)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高TaqMan優(yōu)缺點(diǎn)2022/11/27^81優(yōu)點(diǎn)2022/11/27^82molecularbeacon技術(shù)檢測(cè)靶基因的部分隨著每次擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其熒光強(qiáng)度也增加，因而它可以反映每次擴(kuò)增末期擴(kuò)增產(chǎn)物積累的量。分子信標(biāo)2022/11/27^82molecularbeacon2022/11/27^83

熒光定量PCR的臨床應(yīng)用?遺傳疾病的早期診斷?腫瘤的診斷?抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)?病情評(píng)估和預(yù)后判斷?新藥驗(yàn)證?輸血源的篩選?母嬰傳播的控制與觀察2022/11/27^832022/11/27^84聚合酶鏈反應(yīng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化2022/11/27^84聚合酶鏈反應(yīng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化2022/11/27^85PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是具有極高的敏感性，其反應(yīng)過程與以往其他任何一種檢驗(yàn)診斷技術(shù)相比，都易受到各種自身和外部因素的影響。所以，制定一套適應(yīng)當(dāng)前基因診斷實(shí)驗(yàn)的基本要求并使PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序已迫在眉睫。2022/11/27^85PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是具有極高的敏2022/11/27^86一.PCR實(shí)驗(yàn)診斷的基本原則二.PCR操作程序標(biāo)準(zhǔn)化（一）上崗人員培訓(xùn)制度（二）標(biāo)準(zhǔn)化PCR診斷實(shí)驗(yàn)室（三）PCR標(biāo)準(zhǔn)化操作程序

1．試劑配制、分裝及保存

2．標(biāo)本的采集與處理

3．基因擴(kuò)增及其實(shí)驗(yàn)條件的選擇

4．?dāng)U增產(chǎn)物檢測(cè)

5．PCR結(jié)果的判讀（四）污染的預(yù)防及污染源的標(biāo)準(zhǔn)化處理2022/11/27^86一.PCR實(shí)驗(yàn)診斷的基本原則2022/11/27^87閾值高度：是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

2022/11/27^87閾值高度：是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度88聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用分子生物學(xué)

1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用分子生物學(xué)2022/11/27^89聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)是生命科學(xué)界的重大發(fā)明，是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測(cè)的靈敏度，理論上其檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到一個(gè)細(xì)胞、甚至一個(gè)分子的水平。

2022/11/27^2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase2022/11/27^90PCR發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的發(fā)明人，一般公認(rèn)是凱利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。1983年4月穆利斯萌發(fā)了PCR的構(gòu)想;1985關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表;1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn),并于當(dāng)年11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀；1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來；1990Cetus科學(xué)家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法；1991TaqMan技術(shù)發(fā)表；九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開；1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)。2022/11/27^3PCR發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的發(fā)明人，一般公2022/11/27^91引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/11/27^4引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合2022/11/27^92KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2022/11/27^5KaryB.Mullis2022/11/27^93PCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測(cè)其他……2022/11/27^6PCR的應(yīng)用研究2022/11/27^94PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在體內(nèi)，DNA復(fù)制是周期性的，所以基因擴(kuò)增的數(shù)量有限；PCR技術(shù)在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因子，通過對(duì)溫度的控制，使DNA不斷位于變性、復(fù)性和合成的循環(huán)中，達(dá)到擴(kuò)增DNA的目的。2.PCR基本原理2022/11/27^7PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留2022/11/27^95模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸圖6-1PCR原理示意圖2022/11/27^8模板DNA94℃變性55℃退火72℃2022/11/27^961234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/11/27^91234522557294時(shí)間（mi2022/11/27^97PCR產(chǎn)物生成曲線擴(kuò)增產(chǎn)物循環(huán)次數(shù)指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增平臺(tái)期2022/11/27^10PCR產(chǎn)物生成曲線擴(kuò)增產(chǎn)物循環(huán)次數(shù)2022/11/27^98PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)PFU(空斑形成單位)細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA2022/11/27^11PCR的特點(diǎn)靈敏度高2022/11/27^99反應(yīng)體系：（五要素）

模板（template）引物(primer)人工合成的兩段寡核苷酸序列，決定RCP的特異性。3.PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA2022/11/27^12反應(yīng)體系：（五要素）3.PCR2022/11/27^100PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率，特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子；引發(fā)效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。2022/11/27^13PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在2022/11/27^101引物的長(zhǎng)度

典型的引物為18-24個(gè)核苷酸，在一定范圍內(nèi)引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性；引物長(zhǎng)度的上限主要與反應(yīng)效率有關(guān)，所以一般又不能太長(zhǎng)，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于72℃，即Taq酶的最適溫度。引物設(shè)計(jì)基本原則2022/11/27^14引物的長(zhǎng)度典型的引2022/11/27^102PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

一般來說，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在普通PCR以200～500bp為宜；實(shí)時(shí)熒光PCR則為50～150bp。2022/11/27^15PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度一般來說，P2022/11/27^103引物的均衡性和GC含量

引物中堿基組成應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高(非特異性擴(kuò)增)或過低（特異性降低）都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/11/27^16引物的均衡性和GC含量2022/11/27^104引物溶解溫度（Tm值）

引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.

如果引物中的G+C含量相對(duì)偏低,則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng),而保證一定的退火溫度.Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/11/27^17引物溶解溫度（Tm值）2022/11/27^105引物自身

引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗;引物3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA需嚴(yán)格配對(duì)，并最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。

5’端序列對(duì)PCR影響不如3’端大，常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。

2022/11/27^18引物自身2022/11/27^106使用PrimerPremier5.0等軟件設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊

按鈕，界面如下：

2022/11/27^19使用PrimerPremier2022/11/27^1072022/11/27^202022/11/27^1082022/11/27^212022/11/27^109-

DNA聚合酶(DNApolymerase)

PCR發(fā)明初期，不耐熱的Klenow片段耐熱的TaqDNA聚合酶－良好的熱穩(wěn)定性：92.5、95、97.5℃時(shí)，半衰期分別為130、40、5～6min；－良好的延伸效率：在75～80℃時(shí)延伸效率最高，每個(gè)酶蛋白分子的延伸速度可達(dá)150個(gè)核苷酸/s；－無3′－5′外切酶活性，缺乏校正功能；2022/11/27^22-DNA聚合酶(DNApol2022/11/27^110dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:一般組成：50mMKCl,10-50mM,Tris-Cl(室溫PH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl：促進(jìn)引物退火，高濃度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性；Tris-Cl：調(diào)節(jié)pH值，使反應(yīng)體系偏堿性；MgCl2

：調(diào)節(jié)TaqDNA聚合酶活性、影響引物退火，PCR產(chǎn)物的特異性等2022/11/27^23dNTP:包括dATP、dTTP2022/11/27^1111）PCR反應(yīng)成分（1）模板一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)條件2022/11/27^241）PCR反應(yīng)成分（1）模板PC2022/11/27^112（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermus

aquaticus，水生棲熱菌)

0.5-5U/100l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2022/11/27^25（2）引物濃度2022/11/27^113（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度

四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2022/11/27^26（4）dNTP2022/11/27^114（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。對(duì)于大多數(shù)的PCR引物來說，Mg2+濃度為1.5mmol/L是適宜的，如果擴(kuò)增效果不好，則調(diào)整鎂離子的濃度可能會(huì)有所幫助。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2022/11/27^27（5）Mg2+Mg2+是DNA2022/11/27^1152）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94℃,30s～1min。(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定，一般比引物Tm值約低5℃。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性，但特異性低。熱啟動(dòng)：在第一輪擴(kuò)增前必須使模版DNA完全變性，一般94℃，變性5分鐘2022/11/27^282）循環(huán)參數(shù)熱啟動(dòng)：在第一輪擴(kuò)增前2022/11/27^116（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。（1~3min)（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-30次次數(shù)過多：產(chǎn)生“平臺(tái)效應(yīng)”錯(cuò)誤摻入率增加2022/11/27^29（3）延伸2022/11/27^1174.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法PCR產(chǎn)物測(cè)序熒光PCR2022/11/27^304.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法凝膠電2022/11/27^118(一)瓊脂糖凝膠電泳法基本原理：DNA在電泳緩沖液中帶負(fù)電荷，將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于負(fù)極端的加樣孔，在電場(chǎng)力的作用下DNA涌向正極，并且由于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，不同DNA分子量及構(gòu)型的DNA涌動(dòng)率不同；在電泳過程中，凝膠中的EB將嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復(fù)合物發(fā)出橙紅色熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比；不同濃度的凝膠分辨DNA的有效范圍不同。操作簡(jiǎn)單，但存在EB污染。2022/11/27^31(一)瓊脂糖凝膠電泳法基本原理：操2022/11/27^119聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：分辨力高，長(zhǎng)度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2022/11/27^32聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：2022/11/27^120(二)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶可識(shí)別特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息用途：傳染病病原體基因分型人類基因的變異性研究。是診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型的常用方法2022/11/27^33(二)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性2022/11/27^121PCR-RFLP法：

限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內(nèi)切酶2022/11/27^34PCR-RFLP法：限制性內(nèi)2022/11/27^122(三)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡(jiǎn)稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。2022/11/27^35(三)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PC2022/11/27^123PCR-SSCP過程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

解鏈構(gòu)像DAN原理過程2022/11/27^36PCR-SSCP過程2022/11/27^124優(yōu)點(diǎn)及作用：方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要。該方法和其他方法相比有較高的檢測(cè)率。首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。不足之處：只能作為一種突變檢測(cè)方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測(cè)序；電泳條件要求較嚴(yán)格；另外，由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時(shí)，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。2022/11/27^37優(yōu)點(diǎn)及作用：方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，2022/11/27^125(四)核酸探針雜交法(1)點(diǎn)雜交（dotblot）(2)反向點(diǎn)雜交（reversedotblot）(3)微孔板夾心雜交（microplatehybridization）(4)熒光探針雜交(5)Southern印跡雜交（Southernblot）2022/11/27^38(四)核酸探針雜交法2022/11/27^126樣品正對(duì)照負(fù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量

污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)