實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與無菌操作規(guī)范

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆占?xì)胞培育的基本觀點(diǎn)認(rèn)識細(xì)胞培育的基本條件掌握沖洗和消毒的基本方法學(xué)習(xí)細(xì)胞培育使用液的配制及準(zhǔn)備方法【實(shí)驗(yàn)原理】1.體外培育（invitroculture)的基本觀點(diǎn)將活體構(gòu)造成分（甚至個體）從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)拿出，放在近似于體內(nèi)生計(jì)環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。依據(jù)體外培育的構(gòu)造成分，可將體外培育人為地分為：組織培育（tissueculture）、器官培育（organculture）、細(xì)胞培育（cellculture)1）器官培育（OrganCulture）培育的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生計(jì)、生長和保持必定功能的方法。2）組織培育(TissueCulture)是指從生物體內(nèi)拿出活的組織（多指組織塊）在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下，使之生計(jì)和生長并保持其構(gòu)造和功能的方法。3）細(xì)胞培育(CellCulture)是指將活細(xì)胞（特別是分別的細(xì)胞）在體外進(jìn)行培育的方法。組織細(xì)胞培育的長處可以長時間察看細(xì)胞的生命活動簡單控制實(shí)驗(yàn)條件，有益于生物學(xué)研究簡單直接收集細(xì)胞及亞細(xì)胞構(gòu)造的圖象便于各樣細(xì)胞染色辦理和標(biāo)志培育細(xì)胞的單調(diào)性，有益于清除擾亂要素體外培育技術(shù)的應(yīng)用：基礎(chǔ)研究：細(xì)胞生物學(xué)以致整個生命科學(xué)研究中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。被培育的組織或細(xì)胞是優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)資料。細(xì)胞培育寬泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究之中生產(chǎn)實(shí)踐：疫苗生產(chǎn)、藥物研制與腫瘤防治等醫(yī)學(xué)實(shí)踐供給了嶄新的手段組織細(xì)胞培育的基本條件（1）無污染的環(huán)境條件（2）合適的溫度:由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定35－37℃(人和哺乳動物細(xì)胞)3）氣體環(huán)境與pH環(huán)境：(人和哺乳動物細(xì)胞)4）營養(yǎng)條件5）其余條件：等滲條件、附著底物無污染的環(huán)境條件凡混入細(xì)胞培育環(huán)境中對細(xì)胞生計(jì)有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。（1）污染的種類A．物

理污染:溫度:解決對策：孵箱放在溫度較恒定的房間中,培育液從冰箱拿出后在室溫?cái)R置放射線與輻射:解決對策：試劑四周不可以放同位素,盡量不放在帶有玻璃門的冰箱中.振動:解決對策：孵箱四周不可以放惹起振動的設(shè)施.其余：灰塵、玻璃殘?jiān)?解決對策：嚴(yán)格沖洗.B.化學(xué)污染水:解決對策：用雙蒸和三蒸水配液和沖洗容器（此刻用純水儀millipore超純水）容器:生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留（鉛、砷）;消毒劑和沖洗劑的殘留;鋁箔和包裹紙殘留解決對策：培育用各樣器皿的嚴(yán)格沖洗（泡酸）培育箱:co2混有有毒氣體;消毒劑和沖洗劑的殘留解決對策：購買高質(zhì)量的CO2C.生物污染

.細(xì)菌、霉菌和酵母:易被發(fā)現(xiàn),易造成隱性污染病毒:最難發(fā)現(xiàn)和除去,嚴(yán)格的宿主性,自限性支原體：污染嚴(yán)重,難發(fā)現(xiàn),難除去原蟲、昆蟲：其余細(xì)胞系：解決對策：實(shí)驗(yàn)用品嚴(yán)格滅菌，無菌操作同一時間只傳同一種細(xì)胞,每種細(xì)胞要有獨(dú)自的液體成立細(xì)胞庫，每三個月改換一次細(xì)胞沖洗與滅菌除掉各樣玻璃或塑料器皿上對細(xì)胞生長有影響的各樣雜質(zhì)以及除去附著在其上的各樣微生物及化學(xué)物質(zhì)，改良玻璃表面性質(zhì)，有益于細(xì)胞的粘著和生長。沖洗和消毒能否完全直接關(guān)系到體外培育的成敗。（1）沖洗玻璃器皿：培育瓶、吸管、滴管、試管等浸泡在清水中，洗刷→烘干→浸酸→沖刷（15遍自來水后3遍蒸餾水→倒置烤干→包裝→干熱消毒膠塞（舊）：用加入適當(dāng)清洗靈的水溶液煮沸30分鐘，自來水沖刷→蒸餾水漂洗3次→晾干→包裝→濕熱滅菌→烘干備用膠塞（新）：水中浸泡→2%NaOH煮10-20min→自來水沖刷10次→1%HCl浸泡30min→自來水沖10次，蒸餾水洗3次→晾干→包裝→濕熱滅菌→烘干備用。金屬器材：自來水洗→75%酒精擦→濕熱滅菌、包裝→烘干備用或許自來水沖10次，蒸餾水3次→晾干→包裝→濕熱滅菌→烘干備用（2）細(xì)胞及組織培育用品的包裝1．局部包裝：濾器，培育瓶口全包裝：膠塞、瓶蓋、金屬器材、注射器、小的瓶皿等（3）細(xì)胞及組織培育用品的消毒與滅菌射線消毒:用鈷60等發(fā)出的射線消毒滅菌。適合用于量大或不適做高壓、干熱或過濾辦理的培育用品，如塑料制品等。紫外線消毒:DNA損害，臭氧，雙氧水。合用于空氣、主要用于培育室空氣、操作臺、塑料、培育皿和培育板等表面消毒.【注意事項(xiàng)】：空氣消毒時燈管應(yīng)距地面m之內(nèi)；臺面的消毒應(yīng)在80cm之內(nèi)；培育器皿的消毒在30cm之內(nèi)。不要讓紫外線照耀人的皮膚。干熱滅菌:高溫變性，160℃保溫90－120min合用于玻璃器皿【注意事項(xiàng)】溫度降至100℃之下才能開烤箱門。濕熱滅菌:高溫變性。121度，15磅30分或115度，10磅20分。合用于膠塞、瓶蓋、玻璃器皿、濾器、槍頭塑料物件、PBS、LB等不易產(chǎn)生積淀的液體過濾除菌：合用于培育基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等對熱不穩(wěn)固的試劑及藥物化學(xué)消毒:來蘇%)、新潔爾滅（%）、乙醇（70-75%）、乳酸、過氧乙酸%)火焰消毒：僅限于無菌操作過程，在火焰近處并經(jīng)過炙烤進(jìn)行。用于培育瓶、滴管、試管、吸管等。注意：等用品冷卻后放可接觸活的組織和細(xì)胞。抗生素的抑菌作用：青霉素、鏈霉素各100單位/mL培育基均衡鹽D–Hanks緩沖液的配制均衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）主假如由無機(jī)鹽、葡萄糖構(gòu)成。它的作用是保持細(xì)胞浸透壓均衡，保持pH穩(wěn)固及供給簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其余試劑等。D-Hank‘s與Hank’s的一個主要差別是前者不含有Ca2+、Mg2+，所以D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液。D–Hanks的配制配方（

1000mL）：KCl

；KH2PO4g；NaCL8g

；

g；NaHCO3g；酚紅（2%，1mL）————可不加【實(shí)驗(yàn)儀器、資料、試劑及用品】1.細(xì)胞培育用品：玻璃器皿；濾器；塑料及橡膠制品

;濾膜；棉花；酒精燈等2.藥品及試劑：

KCl;KH2PO4;NaCl;Na2HPO4;NaHCO3

酒精;新潔爾滅【實(shí)驗(yàn)步驟】無菌室及互動顯微鏡室、儀器的使用規(guī)則針頭濾器的安裝與滅菌：安裝濾膜（μm圓滑面向上），高壓滅菌。–Hanks緩沖液的配制及滅菌辦理。練習(xí)沖洗培育瓶。練習(xí)包瓶子、塞子、插槍頭、切蓋玻片，移液管塞棉花等。%酒精配置、酒精棉球制作以及酒精燈內(nèi)酒精增添。配新潔爾滅消毒水。練習(xí)培育基瓶蓋的開啟與蓋上。9.無菌室的打掃：自來水拖地、擦桌子及超凈臺，而后%新潔爾滅擦。CO2培育箱滅菌：新潔爾滅擦，而后75%乙醇擦?！舅紤]題】干燥箱滅菌的溫度是多少？滅菌結(jié)束后要注意什么？答：干熱滅菌

:

高溫變性，

160℃保溫

90－120min

合用于玻璃器皿【注意事項(xiàng)】溫度降至

100℃之下才能開烤箱門。濕熱滅菌

:高溫變性。

121度，15

磅

30分或

115度，10磅

20分。合用于膠塞、瓶蓋、玻璃器皿、濾器、槍頭

塑料物件、

PBS、LB等不易產(chǎn)生積淀的液體二氧化碳培育箱的使用注意事項(xiàng)是什么？培育箱:co2混有有毒氣體;消毒劑和沖洗劑的殘留解決對策：購買高質(zhì)量的CO2哪些物件合適于高壓滅菌？合用于一般培育基、生理鹽水、手術(shù)器材、玻璃容器及注