實時熒光定量PCR具體實驗步驟

以下實驗步驟僅供參考：樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細胞，室溫放置 5分鐘使其完全溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0."2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體 15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。④RNA清洗移去上清液，每 1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少 1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA質(zhì)量檢測1）紫外吸收法測定1/9先用稀釋用的 TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量 RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計 260nm和280nm處的吸收值，測定 RNA溶液濃度和純度。①濃度測定A260下讀值為1表示40μgRNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml。具體計算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260=0."21RNA濃度=0."21 ×100×40μg/ml=840或 μg/ml0."84 μg/μl取5ul用來測量以后，剩余樣品 RNA為35μl，剩余RNA總量為：35μl ×0."84 μg/μl=29."4 μg②純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1."8到2."1。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定①制膠2/91g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10ml的10×MOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12."3M)。10×MOPS電泳緩沖液濃度成分0.4M MOPS，pH7."00.1M乙酸鈉0.01M EDTA灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。②準備RNA樣品取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。③電泳上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。④紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體3/9RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。3樣品cDNA合成①反應體系序號反應物劑量1逆轉(zhuǎn)錄buffer2μl上游引物0."2μl下游引物0."2μldNTP0."1μl逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV0."5μlDEPC水5μlRNA模版2μl總體積10μl輕彈管底將溶液混合， 6000rpm短暫離心。②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0."5μl，37℃水浴60分鐘。4/9③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。4梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR①β-actin陽性模板的標準梯度制備陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為10，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。②反應體系如下：標準品反應體系序號反應物劑量1SYBRGreen1染料10μl2陽性模板上游引物F0."5μl3陽性模板下游引物R0."5μl4dNTP0."5μl5/9Taq酶1μl陽性模板DNA5μlddH2O32."5μl8總體積50μl輕彈管底將溶液混合， 6000rpm短暫離心。管家基因反應體系：序號反應物劑量SYBRGreen1染料10μl內(nèi)參照上游引物F0."5μl3內(nèi)參照下游引物 R0."5μldNTP0."5μlTaq酶1μl待測樣品cDNA5μlddH2O32."5μl6/98總體積50μl輕彈管底將溶液混合， 6000rpm短暫離心。③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘，然后93℃1分鐘，55℃2分鐘，共40個循環(huán)。5制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的 DNA模板①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的 cDNA模板進行PCR反應。反應體系：序號反應物劑量1 10×PCR緩沖液2."5ul2 MgCl2溶液1."5ul3上游引物F0."5ul4下游引物R0."5uldNTP混合液3ulTaq聚合酶1ulcDNA1ul加水至總體積為25ul7/9輕彈管底將溶液混合， 6000rpm短暫離心。35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）；72oC延伸5分鐘。②PCR產(chǎn)物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋:將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋:設定PCR產(chǎn)物濃度為1×10，依次稀釋至 109108107106105104幾個濃度梯度。6待測樣品的待測基因?qū)崟r定量 PCR①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。體系配置如下：序號反應物劑量SYBRGreen1染料10ul上游引物1ul8/93下游引物1uldNTP1ulTaq聚合酶2ul待測樣品cDNA5ulddH2O30ul8總體積50ul輕彈管底將溶液混合， 6000rpm短暫離心。②將配制好的PCR反應溶液置于RealtimePCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然后按93℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。7實時定量PCR使用引物列表引物設計軟件：PrimerPremier5."0，并遵循以下原則：引