抗原的表達和純化課件

一、抗原組生產(chǎn)流程Ag組的操作流程菌種接種培養(yǎng)過夜擴大培養(yǎng)誘導繼續(xù)培養(yǎng)收集菌體破碎菌體離心沉淀包涵體純化步驟可溶性蛋白純化步驟上清一、抗原組生產(chǎn)流程Ag組的操作流程菌1可溶蛋白具體生產(chǎn)步驟1、接種80ul菌種至100ml抗性培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)過夜。2、次日加入新鮮抗性培養(yǎng)基至600ml，培養(yǎng)1.5小時至活力最旺盛。3、加入0.5mM的IPTG誘導3.5小時4、收集菌體（66轉/秒×15min),棄上清，加入PBST懸浮菌體，加入200ulMPMSF,100ulEDTA(his標簽蛋白不加），冰浴下超聲破碎細胞。5、搖床4度孵育1小時。6、高速離心，133轉/秒×15min。取上清，加入600ulbeads結合過夜。7、收集beads（33轉/秒、瞬時），洗滌液洗滌3次。加入300ul洗脫液，4℃振蕩洗脫1小時，瞬時離心，取上清。再次加入300ul洗脫液，洗脫1小時，兩次洗脫液合為一管。8、將所得的上清取10ul加入10ulsamplebuffer制樣，SDS跑膠。9、根據(jù)maker的跑膠結果目測蛋白質量及濃度?？扇艿鞍拙唧w生產(chǎn)步驟1、接種80ul菌種至100ml抗性培養(yǎng)2二、實驗原理基因的表達親和層析純化可溶蛋白包涵體的純化原理SDS－PAGE電泳的基本原理二、實驗原理基因的表達3三、基因的表達在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導基因?？烧T導基因在特定環(huán)境中表達增強的過程，稱為誘導。如果基因對環(huán)境信號應答是被抑制，這種基因是可阻遏基因?？勺瓒艋虮磉_產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏

。原核生物的基因調控主要發(fā)生在轉錄水平上。原核生物的基因表達主要是負性調控，誘導物可用于去除阻遏作用。公司構建的基因工程菌采用乳糖操縱子調控系統(tǒng)。三、基因的表達在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表4（一）乳糖操縱子(lacoperon)的結構調控區(qū)CAP結合位點啟動序列操縱序列調節(jié)基因ZYAOPDNAI結構基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透性酶A：乙?；D移酶（一）乳糖操縱子(lacoperon)的結構調控區(qū)CAP5（二）阻遏蛋白的負性調節(jié)mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZYAOP沒有乳糖存在時pol（二）阻遏蛋白的負性調節(jié)mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZY6有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉錄mRNA阻遏蛋白mRNA乳糖別乳糖β-半乳糖苷酶有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉錄mRNA阻遏蛋白7（三）CAP/CRP的正性調節(jié)CAP(cataboliteactivatorprotein,分解代謝物激活蛋白)涉及到正性調節(jié).CAP又稱為CRP(cAMPreceptorprotein),lacoperon高水平轉錄必需的一個激活蛋白。葡萄糖抑制cAMP的形成。葡萄糖存在時，cAMP濃度低；僅在葡萄糖消耗完畢時,cAMP濃度增高。（三）CAP/CRP的正性調節(jié)CAP(catabolite8++++轉錄無葡萄糖，cAMP濃度高時促進轉錄ZYAOPDNACAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPCAP結合位點++++轉錄無葡萄糖，cAMP濃度高時ZYAOPDN9lacI-系統(tǒng)中，不管是否存在乳糖，三種乳糖分解代謝有關的酶得到持續(xù)表達。lacI+系統(tǒng)中，當葡萄糖存在時，不表達三種酶；然而，當存在乳糖而又缺乏葡萄糖時，這三種酶得到表達。lacI-系統(tǒng)中，不管是否存在乳糖，三種乳糖分解代謝有關的酶10乳糖操縱子受到兩種調節(jié)：阻遏蛋白的負調節(jié)和CAP的正調節(jié)，有兩道控制開關，只有兩道開關同時打開時,即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖時,基因才能夠轉錄。mRNAZYAOPDNAImRNA阻遏蛋白乳糖別乳糖β-半乳糖苷酶CAPcAMPCAPcAMPpol啟動轉錄CAPcAMP乳糖操縱子受到兩種調節(jié)：阻遏蛋白的負調節(jié)和CAP的正調節(jié)，有11（四）乳糖操縱子誘導物由于乳糖雖可誘導酶的合成，但易被β-半乳糖苷酶催化降解，并且產(chǎn)生很多復雜的動力學問題，因此人們常用安慰誘導物誘導。乳糖操縱子的安慰誘導物除了異丙基巰基半乳糖（IPTG)，還可以是巰基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。

IPTG為常用的誘導物，是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導劑,可與阻遏物結合促進基因的表達。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運送，不被大腸桿菌所分解所以濃度并不改變（四）乳糖操縱子誘導物由于乳糖雖可誘導酶的合成，但易被β-半12（五）影響蛋白表達的因素IPTG濃度：0.1-1mM0.5mM誘導溫度:28℃37℃誘導時間:3.5h（五）影響蛋白表達的因素IPTG濃度：0.1-1mM13四、親和層析純化可溶性蛋白目前我們公司生產(chǎn)的抗原絕大部分是谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白和6XHISTag融合蛋白。融合蛋白的優(yōu)點有：

(1)表達效率高；

(2)產(chǎn)生的融合蛋白比天然蛋白更穩(wěn)定，融合蛋白是避免細菌蛋白酶降解的最好措施；

(3)產(chǎn)生的蛋白質易于鑒定，純化。

GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表達方便而且基本不影響蛋白的活性四、親和層析純化可溶性蛋白目前我們公司生產(chǎn)的抗原絕大部分是谷14親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的蛋白的一類特殊層析技術。（一）親和層析技術原理親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，15通常兩個分子間特異親和力的形成有兩種情況：（1）兩個分子之間，其構形有如積木般的互補，因為范德華力的關系，產(chǎn)生特異親和力（2）兩分子之間，因為某些基團間產(chǎn)生了二級鍵，造成了吸引力。親和層析法按親和配基的親和力大小可分為兩類（1）特異性配基親和層析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值為10-7～10-15。

（2）通用性配基親和層析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金屬離子等，KD值為10-4～10-6。（二）親和層析法分類通常兩個分子間特異親和力的形成有兩種情況：（二）親和層析法分16利用了GST與GSH間酶與底物構象互補的特異性結合特性，將帶標簽的蛋白與其他蛋白分離開。其結合力是范德華力，結合力弱且需較長的結合時間，但特異性高。

GSTfusionprotein的洗脫原理是通過調節(jié)GSH濃度及洗脫時間將目的蛋白洗脫下來,洗脫液中的還原型GSH與beads上的谷胱甘肽競爭結合融合蛋白，從而將目標蛋白洗脫。

（三）GSTfusionprotein的純化

——特異性配基親和層析法利用了GST與GSH間酶與底物構象互補的特異性結合特性，將帶17此圖為Glutathionesepharose的終端結構，谷胱甘肽通過SH基團與sepharose基質的環(huán)氧乙烷基團通過環(huán)氧激活特異偶聯(lián)到sepharose上。此圖為凝膠上的手臂谷胱甘肽與GST-tag融合蛋白結合后結構，中間紅色的部分既為谷胱甘肽。此圖為Glutathionesepharose的終端結構，18GST親和純化中常見的問題1SymptomsPossibleCausesComments結合在beads上的目的蛋白過少細胞裂解效果不好延長破碎時間，加大破碎率表達的目的蛋白不溶通過抑制包涵體的形成來增加目的蛋白的可溶性目的蛋白自身的降解細胞破碎后：加大蛋白酶抑制劑；操作過程保持低溫，動作柔和，輕拿輕放。目的蛋白與beads結合時，pH值沒調好

GSTfusionprotein與beads的結合對pH值是相當敏感的pH>8.0對結合不利。一般bindingbufferpH=7.4蛋白結合后過度的洗滌為避免將一些結合不牢固的目的蛋白洗下來，要限制洗滌次數(shù)GST親和純化中常見的問題1SymptomsPossible19GST親和純化中常見的問題2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脫效果不好目的蛋白分子量太大蛋白越大，洗脫效率越低。1.適當提高洗脫液中GSH的濃度；2.提高洗脫液的鹽離子濃度（Nacl:100-500mM）；3.調節(jié)洗脫液的pH值，pH>8.0洗脫效率大于pH=7.4；4.加大洗脫體積，延長洗脫時間SDS檢測后，發(fā)現(xiàn)雜帶多目的蛋白降解可1.使用較溫和的破碎條件；2.保持低溫；3.避免破碎時蛋白產(chǎn)生氣泡；4.加入還原劑如10mMDTT于裂解液中。雜蛋白的共純化可1.增加洗滌次數(shù)；2.提高bindingbuffer鹽離子濃度（Nacl:500mM），可降低一些因為離子作用帶來的非特異性吸附；3.延長破碎后蛋白的孵育時間及133轉離心時間；4.縮短蛋白與beadsbinding時間GST親和純化中常見的問題2SymptomsPossible20（四）6XHISTag蛋白的純化

——特異性配基親和層析法蛋白質表面的一些氨基酸，例如組氨酸等能夠與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+發(fā)生特殊的相互作用。因此偶聯(lián)了合適金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性的吸附那些含有組氨酸的蛋白和對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。beads與6xHisfusionprotein間產(chǎn)生了共價鍵，結合力強但特異性差。組氨酸殘基的五元咪唑環(huán)是蛋白與Ni離子作用的關鍵。（四）6XHISTag蛋白的純化

216xHisfusionprotein的洗脫原理是通過高濃度的咪唑洗脫目的蛋白，洗脫液中的咪唑通過和金屬離子結合而高效地替換掉His標簽融合蛋白。由于一些宿主細胞蛋白上也含有組氨酸，可以結合在beads上，洗脫時也會被洗脫下來（特異性差的原因）。因此在洗滌液中加入低濃度咪唑，可以避免宿主細胞蛋白的結合。6xHisfusionprotein的洗脫原理是通過高22HIS標簽蛋白親和純化中常見的問題1SymptomsPossibleCausescomments目的蛋白無法與beads結合蛋白降解1.加大蛋白酶抑制劑；2.操作過程保持低溫，動作柔和，輕拿輕放。bindingbufferpH有錯誤調整pH=7.5蛋白鹽離子濃度太大結合前，稀釋蛋白溶液目的蛋白His-tag隱藏目的蛋白水溶性差，自身折疊將His-tag包裹隱藏起來。可嘗試在變性的條件下與beads結合，確保beads工作良好的前提下，調整一下beads結合的pH值；延長樣品與beads結合的時間一些表達量很大的雜蛋白吸附于beads上，使目的蛋白無法吸附在目的蛋白與beads結合時，向蛋白溶液內加入20mM咪唑減少非特異性吸附HIS標簽蛋白親和純化中常見的問題1SymptomsPoss23HIS標簽蛋白親和純化中常見的問題2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脫效果不好目的蛋白本身帶有一個金屬離子結合域加大洗脫液中咪唑濃度SDS檢測雜帶多宿主菌表達了一些能與HisTag共同結合在beads上的雜蛋白原因：1.有些雜蛋白本身帶有His殘基，并暴露在蛋白的表面，2.金屬螯合層析本身的特異性較弱，Ni離子不僅能與His殘基中的咪唑環(huán)結合，還可與多個其他氨基酸殘基中的基團結合1.在各buffer中都加一些非離子表面活性劑（如：Tween-20）可降低非特異性吸附；2.洗脫用階段洗脫的方法；3.梯度降低pH可減弱蛋白與金屬離子的作用力，特別適合洗脫吸附弱的蛋白，而階段咪唑洗脫屬于競爭性洗脫，可將一些吸附力強的蛋白洗下來。二者原理不同，相互配合可使單一靠咪唑洗不去的雜帶洗掉。低pH也只4-5左右，短時間內蛋白不會變性，馬上用堿中和即可。HIS標簽蛋白親和純化中常見的問題2SymptomsPoss24謝謝大家！謝謝大家！25一、抗原組生產(chǎn)流程Ag組的操作流程菌種接種培養(yǎng)過夜擴大培養(yǎng)誘導繼續(xù)培養(yǎng)收集菌體破碎菌體離心沉淀包涵體純化步驟可溶性蛋白純化步驟上清一、抗原組生產(chǎn)流程Ag組的操作流程菌26可溶蛋白具體生產(chǎn)步驟1、接種80ul菌種至100ml抗性培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)過夜。2、次日加入新鮮抗性培養(yǎng)基至600ml，培養(yǎng)1.5小時至活力最旺盛。3、加入0.5mM的IPTG誘導3.5小時4、收集菌體（66轉/秒×15min),棄上清，加入PBST懸浮菌體，加入200ulMPMSF,100ulEDTA(his標簽蛋白不加），冰浴下超聲破碎細胞。5、搖床4度孵育1小時。6、高速離心，133轉/秒×15min。取上清，加入600ulbeads結合過夜。7、收集beads（33轉/秒、瞬時），洗滌液洗滌3次。加入300ul洗脫液，4℃振蕩洗脫1小時，瞬時離心，取上清。再次加入300ul洗脫液，洗脫1小時，兩次洗脫液合為一管。8、將所得的上清取10ul加入10ulsamplebuffer制樣，SDS跑膠。9、根據(jù)maker的跑膠結果目測蛋白質量及濃度。可溶蛋白具體生產(chǎn)步驟1、接種80ul菌種至100ml抗性培養(yǎng)27二、實驗原理基因的表達親和層析純化可溶蛋白包涵體的純化原理SDS－PAGE電泳的基本原理二、實驗原理基因的表達28三、基因的表達在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導基因?？烧T導基因在特定環(huán)境中表達增強的過程，稱為誘導。如果基因對環(huán)境信號應答是被抑制，這種基因是可阻遏基因。可阻遏基因表達產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏

。原核生物的基因調控主要發(fā)生在轉錄水平上。原核生物的基因表達主要是負性調控，誘導物可用于去除阻遏作用。公司構建的基因工程菌采用乳糖操縱子調控系統(tǒng)。三、基因的表達在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表29（一）乳糖操縱子(lacoperon)的結構調控區(qū)CAP結合位點啟動序列操縱序列調節(jié)基因ZYAOPDNAI結構基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透性酶A：乙?；D移酶（一）乳糖操縱子(lacoperon)的結構調控區(qū)CAP30（二）阻遏蛋白的負性調節(jié)mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZYAOP沒有乳糖存在時pol（二）阻遏蛋白的負性調節(jié)mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZY31有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉錄mRNA阻遏蛋白mRNA乳糖別乳糖β-半乳糖苷酶有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉錄mRNA阻遏蛋白32（三）CAP/CRP的正性調節(jié)CAP(cataboliteactivatorprotein,分解代謝物激活蛋白)涉及到正性調節(jié).CAP又稱為CRP(cAMPreceptorprotein),lacoperon高水平轉錄必需的一個激活蛋白。葡萄糖抑制cAMP的形成。葡萄糖存在時，cAMP濃度低；僅在葡萄糖消耗完畢時,cAMP濃度增高。（三）CAP/CRP的正性調節(jié)CAP(catabolite33++++轉錄無葡萄糖，cAMP濃度高時促進轉錄ZYAOPDNACAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPCAP結合位點++++轉錄無葡萄糖，cAMP濃度高時ZYAOPDN34lacI-系統(tǒng)中，不管是否存在乳糖，三種乳糖分解代謝有關的酶得到持續(xù)表達。lacI+系統(tǒng)中，當葡萄糖存在時，不表達三種酶；然而，當存在乳糖而又缺乏葡萄糖時，這三種酶得到表達。lacI-系統(tǒng)中，不管是否存在乳糖，三種乳糖分解代謝有關的酶35乳糖操縱子受到兩種調節(jié)：阻遏蛋白的負調節(jié)和CAP的正調節(jié)，有兩道控制開關，只有兩道開關同時打開時,即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖時,基因才能夠轉錄。mRNAZYAOPDNAImRNA阻遏蛋白乳糖別乳糖β-半乳糖苷酶CAPcAMPCAPcAMPpol啟動轉錄CAPcAMP乳糖操縱子受到兩種調節(jié)：阻遏蛋白的負調節(jié)和CAP的正調節(jié)，有36（四）乳糖操縱子誘導物由于乳糖雖可誘導酶的合成，但易被β-半乳糖苷酶催化降解，并且產(chǎn)生很多復雜的動力學問題，因此人們常用安慰誘導物誘導。乳糖操縱子的安慰誘導物除了異丙基巰基半乳糖（IPTG)，還可以是巰基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。

IPTG為常用的誘導物，是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導劑,可與阻遏物結合促進基因的表達。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運送，不被大腸桿菌所分解所以濃度并不改變（四）乳糖操縱子誘導物由于乳糖雖可誘導酶的合成，但易被β-半37（五）影響蛋白表達的因素IPTG濃度：0.1-1mM0.5mM誘導溫度:28℃37℃誘導時間:3.5h（五）影響蛋白表達的因素IPTG濃度：0.1-1mM38四、親和層析純化可溶性蛋白目前我們公司生產(chǎn)的抗原絕大部分是谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白和6XHISTag融合蛋白。融合蛋白的優(yōu)點有：

(1)表達效率高；

(2)產(chǎn)生的融合蛋白比天然蛋白更穩(wěn)定，融合蛋白是避免細菌蛋白酶降解的最好措施；

(3)產(chǎn)生的蛋白質易于鑒定，純化。

GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表達方便而且基本不影響蛋白的活性四、親和層析純化可溶性蛋白目前我們公司生產(chǎn)的抗原絕大部分是谷39親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的蛋白的一類特殊層析技術。（一）親和層析技術原理親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，40通常兩個分子間特異親和力的形成有兩種情況：（1）兩個分子之間，其構形有如積木般的互補，因為范德華力的關系，產(chǎn)生特異親和力（2）兩分子之間，因為某些基團間產(chǎn)生了二級鍵，造成了吸引力。親和層析法按親和配基的親和力大小可分為兩類（1）特異性配基親和層析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值為10-7～10-15。

（2）通用性配基親和層析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金屬離子等，KD值為10-4～10-6。（二）親和層析法分類通常兩個分子間特異親和力的形成有兩種情況：（二）親和層析法分41利用了GST與GSH間酶與底物構象互補的特異性結合特性，將帶標簽的蛋白與其他蛋白分離開。其結合力是范德華力，結合力弱且需較長的結合時間，但特異性高。

GSTfusionprotein的洗脫原理是通過調節(jié)GSH濃度及洗脫時間將目的蛋白洗脫下來,洗脫液中的還原型GSH與beads上的谷胱甘肽競爭結合融合蛋白，從而將目標蛋白洗脫。

（三）GSTfusionprotein的純化

——特異性配基親和層析法利用了GST與GSH間酶與底物構象互補的特異性結合特性，將帶42此圖為Glutathionesepharose的終端結構，谷胱甘肽通過SH基團與sepharose基質的環(huán)氧乙烷基團通過環(huán)氧激活特異偶聯(lián)到sepharose上。此圖為凝膠上的手臂谷胱甘肽與GST-tag融合蛋白結合后結構，中間紅色的部分既為谷胱甘肽。此圖為Glutathionesepharose的終端結構，43GST親和純化中常見的問題1SymptomsPossibleCausesComments結合在beads上的目的蛋白過少細胞裂解效果不好延長破碎時間，加大破碎率表達的目的蛋白不溶通過抑制包涵體的形成來增加目的蛋白的可溶性目的蛋白自身的降解細胞破碎后：加大蛋白酶抑制劑；操作過程保持低溫，動作柔和，輕拿輕放。目的蛋白與beads結合時，pH值沒調好

GSTfusionprotein與beads的結合對pH值是相當敏感的pH>8.0對結合不利。一般bindingbufferpH=7.4蛋白結合后過度的洗滌為避免將一些結合不牢固的目的蛋白洗下來，要限制洗滌次數(shù)GST親和純化中常見的問題1SymptomsPossible44GST親和純化中常見的問題2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脫效果不好目的蛋白分子量太大蛋白越大，洗脫效率越低。1.適當提高洗脫液中GSH的濃度；2.提高洗脫液的鹽離子濃度（Nacl:100-500mM）；3.調節(jié)洗脫液的pH值，pH>8.0洗脫效率大于pH=7.4；4.加大洗脫體積，延長洗脫時間SDS檢測后，發(fā)現(xiàn)雜帶多目的蛋白降解可1.使用較溫和的破碎條件；2.保持低溫；3.避免破碎時蛋白產(chǎn)生氣泡；4.加入還原劑如10mMDTT于裂解液中。雜蛋白的共純化可1.增加洗滌次數(shù)；2.提高bindingbuffer鹽離子濃度（Nacl:500mM），可降低一些因為離子作用帶來的非特異性吸附；3.延長破碎后蛋白的孵育時間及133轉離心時間；4.縮短蛋白與beadsbinding時間GST親和純化中常見的問題2SymptomsPossible45（四）6XHISTag蛋白的純化

——特異性配基親和層析法蛋白質表面的一些氨基酸，例如組氨酸等能夠與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+發(fā)生特殊的相互作用。因此偶聯(lián)了合適金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性的吸附那些含有組氨酸的蛋白和對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。beads與6xHisfusionprotein間產(chǎn)生了共價鍵，結合力強但特異性差。組氨酸殘基的五元咪唑環(huán)是蛋白與Ni離子作用的關鍵