固相析出分離法課件

目的：濃縮；初步純化；將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。固相析出法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。概述固相析出分離法：生化物質(zhì)目的物經(jīng)常作為溶質(zhì)存在于溶液中，改變?nèi)芤簵l件，使它以固體形式從溶液中分離的操作技術(shù)。目的：概述固相析出分離法：生化物質(zhì)目的物經(jīng)常作為溶質(zhì)存在于溶1

固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。固相析出法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高缺點(diǎn)：針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶2

鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法固相析出法等電點(diǎn)沉淀法結(jié)晶法其它多種沉淀法結(jié)晶法：析出物為晶體。沉淀法：析出物為無定形固體。固相析出法分類鹽析法結(jié)晶法：3第一節(jié)鹽析法第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法第三節(jié)其它沉淀方法第四節(jié)結(jié)晶第一節(jié)鹽析法4第一節(jié)鹽析法一、基本原理二、影響因素三、鹽析操作第一節(jié)鹽析法一、基本原理5定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高；沉淀含大量鹽析劑，要除鹽；產(chǎn)生氨的惡臭6定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過6兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小7兩種現(xiàn)象：772022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院82022/11/30南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院882022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院92022/11/30南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院99一、基本原理10一、基本原理1010鹽析作用（saltingout）原理破壞雙電層：在高鹽溶液中，帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質(zhì)表面的電荷，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用相互減弱而能相互聚集起來。破壞水化層：中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀。鹽析作用（saltingout）原理破壞雙電層：破壞水化層11logS=-KsS——蛋白質(zhì)溶解度，g/L；—鹽離子強(qiáng)度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價；——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;Ks——鹽析常數(shù)。12鹽析和KS鹽析右圖示：鹽離子濃度與蛋白質(zhì)溶解度關(guān)系曲線，在鹽析區(qū)，符合公式logS=-Ks12鹽析和KS鹽析右圖示：鹽離子濃度與12兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作Ks鹽析法。由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。（2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作β鹽析法。由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，后期分離（結(jié)晶）13兩種類型：1313二、影響鹽析的因素1.無機(jī)鹽的種類在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價離子作用較弱陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+

＞高價陽離子陰離子的影響大于陽離子二、影響鹽析的因素1.無機(jī)鹽的種類在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類14鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)鹽析用鹽的選擇15鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑（1）價廉；（2）溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，（4）不易引起蛋白質(zhì)變性。缺點(diǎn)：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉缺點(diǎn)：16不同種類蛋白質(zhì)——所需的無機(jī)鹽量不同先后加入不同量無機(jī)鹽—分級沉淀蛋白質(zhì)2.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類：Ks、β不同蛋白溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系不同種類蛋白質(zhì)——所需的無機(jī)鹽量不同2.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類17鹽析分布曲線18鹽析分布曲線1818蛋白質(zhì)濃度不同：所需無機(jī)鹽用量不同蛋白質(zhì)濃度高：所需無機(jī)鹽量少制成品：可適當(dāng)高濃度，但濃度過高，易共沉淀重疊蛋白分級：適當(dāng)稀釋，共沉淀小，但回收率降低。3.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）濃度：2~3%不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線蛋白質(zhì)濃度不同：所需無機(jī)鹽用量不同3.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）濃度：19無機(jī)或稀鹽溶液：T↑蛋白質(zhì)溶解度↑高鹽溶液：T↑蛋白質(zhì)溶解度↓蛋白質(zhì)：室溫鹽析對溫度敏感的酶，0?C~4?C4.溫度：溫度對溶解度的影響無機(jī)或稀鹽溶液：T↑蛋白質(zhì)溶解度↑4.溫度：溫度對溶解度的影205.pH：Pl鹽析注意高鹽下pl的偏移：與負(fù)離子結(jié)合向低pH偏移，與正離子結(jié)合向高pH偏移利用蛋白質(zhì)pl的不同：可分級沉淀蛋白質(zhì)5.pH：Pl鹽析21三、鹽析操作1.鹽析用鹽的濃度表示硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。三、鹽析操作1.鹽析用鹽的濃度表示硫酸銨的加入有以下幾種方法22鹽析用鹽量的表征--飽和度：飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和濃度是767g/L定義為100%飽和度目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%飽和度時，溶解度都小于0.lmg／L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。鹽析用鹽量的表征--飽和度：飽和度（Saturation）的23調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表24鹽析方法：1）分步鹽析法(不同的鹽濃度)2）重復(fù)鹽析法高蛋白質(zhì)濃度下共沉淀→重復(fù)鹽析提高純度3）反抽提法(相同鹽濃度)2、鹽析方法和注意事項(xiàng)鹽析方法：2、鹽析方法和注意事項(xiàng)25分級鹽析法不斷提高鹽濃度：不同蛋白質(zhì)分級沉淀低飽和度：除雜蛋白，高飽和度：沉淀目的物血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分級鹽析法血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和26單酶鹽析曲線雙酶鹽析曲線單酶鹽析曲線雙酶鹽析曲線27反抽提法共沉淀→較低濃度鹽溶液溶雜蛋白大腸桿菌RNA聚合酶的制備反抽提法大腸桿菌RNA聚合酶的制備28防止“局部過濃”：慢加，攪拌溫度：不宜過低，室溫10~25?C，易失活：0~10?C時間：沉淀需經(jīng)一段老化時間（1小時）后分離注意事項(xiàng)：防止“局部過濃”：慢加，攪拌注意事項(xiàng)：29第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法一、基本原理二、影響沉淀效果的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法一、基本原理30概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)31優(yōu)點(diǎn)：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）溶劑易除去3）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；缺點(diǎn)：1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進(jìn)行。3）成本高，需防火防爆總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。優(yōu)點(diǎn)：32一、基本原理1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。

2、水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。脫水作用比靜電作用強(qiáng)一、基本原理1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引33一些溶劑的介電常數(shù)

34一些溶劑的介電常數(shù)3434二、影響沉淀效果的因素1.有機(jī)溶劑種類及用量能與水無限混溶介電常數(shù)小、沉淀強(qiáng)變性小毒性小，揮發(fā)性適中二、影響沉淀效果的因素1.有機(jī)溶劑種類及用量35常用：乙醇、丙酮（揮發(fā)肝毒性著火點(diǎn)低）和甲醇（口服毒性）介電常數(shù)：無水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；用量：（了解）常用：乙醇、丙酮（揮發(fā)肝毒性著火點(diǎn)低）和甲醇（口服毒性）362.pH的影響Pl附近、穩(wěn)定性控制溶液pH時務(wù)必使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶有相同電荷，勿使目的物與雜質(zhì)帶異電荷導(dǎo)致共沉淀。2.pH的影響37嚴(yán)格控制低溫有機(jī)溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)預(yù)冷（有機(jī)溶劑-10℃以下，蛋白質(zhì)0℃左右），在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃變性，并散熱。溫度影響有機(jī)溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。3.溫度嚴(yán)格控制低溫3.溫度38低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L），<5%少量的中性鹽：保護(hù)作用，減少蛋白質(zhì)變性，穩(wěn)定介質(zhì)pH，減少水和溶劑互溶現(xiàn)象鹽濃度較高（>0.2mol/L）：鹽溶，增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑―水溶液中的溶解度，會增加溶媒用量，沉淀物中可能夾帶鹽，需除鹽常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。4.無機(jī)鹽的含量低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L），<5%4.無機(jī)395.某些金屬離子的助沉淀作用Zn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，而活性不變，有助于沉淀，降低有機(jī)溶劑用量。胰島素精制：5.某些金屬離子的助沉淀作用Zn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白406.樣品濃度較?。喝軇┝俊?，收率↓，稀釋變性較高：共沉淀↑，分辨率↓，溶劑量↓，回收率↑，變性小蛋白質(zhì)初濃度：0.5%~2%粘多糖：1~2%6.樣品濃度較稀：溶劑量↑，收率↓，稀釋變性41

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響

收率%酶活收率酶活

6.5pH

*

適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

收率%酶活酶活

收率

1020T℃

*

適宜的溫度10~20℃

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究42第三節(jié)其它沉淀方法一、等電點(diǎn)沉淀二、成鹽沉淀法三、親和沉淀四、高分子聚合物沉淀法五、表面活性劑沉淀法第三節(jié)其它沉淀方法一、等電點(diǎn)沉淀43一、等電點(diǎn)沉淀法原理：Pl時分子表面靜電荷為零，雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。一、等電點(diǎn)沉淀法44常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用。主要：去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用。45二、成鹽沉淀法1.金屬離子沉淀所用的金屬離子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。蛋白質(zhì)和酶分子中因?yàn)楹辛u基、氨基、咪唑基和硫氫基等，均可以和上述金屬離子作用形成鹽復(fù)合物。分離沉淀→復(fù)合物分解→除金屬離子（離子交換或金屬螯合劑EDTA）二、成鹽沉淀法1.金屬離子沉淀46應(yīng)用：目的蛋白分離，去雜質(zhì)缺點(diǎn)：有時復(fù)合物分解較困難，蛋白質(zhì)易變性應(yīng)用：472.有機(jī)酸類復(fù)合鹽

含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。工業(yè)上用此法制備蛋白質(zhì)時，需采取較溫和的條件，有時還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。2.有機(jī)酸類復(fù)合鹽48單寧：結(jié)合后牢固，競爭結(jié)合法分解雷凡諾：不影響蛋白質(zhì)活性三氯乙酸（TCA）：變性，除雜蛋白單寧：結(jié)合后牢固，競爭結(jié)合法分解49

雷凡諾

雷凡諾50豬心提取液洗脫液上清液上清細(xì)胞色素C

沉淀（去除）吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析豬心提取液洗脫液吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸51三、親和沉淀法配基+可溶性載體→偶聯(lián)成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑）可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀出來它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。所以其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，而是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。三、親和沉淀法配基+可溶性載體→偶聯(lián)成載體-配基復(fù)合物（親和52親和沉淀

過程親和過程提供了一個從復(fù)雜混合物中分離提取單一產(chǎn)品的有效方法。①初始階段，將一個目標(biāo)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親合配位體絡(luò)和形成沉淀；②所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)；③用一種適當(dāng)?shù)脑噭⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)從配位體中離解出來。親和沉淀過程親和過程提供了一個從復(fù)雜混合物中分離提取53四、高分子聚合物沉淀法水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。PEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖雙水相或單高聚物其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇。無毒，對產(chǎn)品的影響小，但不易除去四、高分子聚合物沉淀法水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質(zhì)水54555555五、表面活性劑沉淀法CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）、CPC(十六烷基氯化吡啶)

：沉淀酸性多糖與多糖上的陰離子形成形成季銨絡(luò)合物，降低離子強(qiáng)度，絡(luò)合物析出。SDS：分離胰蛋白或核蛋白目的是使核酸和蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。五、表面活性劑沉淀法CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）56討論：咸鴨蛋煮熟了，蛋黃里會有油，這是什么緣故？熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)31％，為什么看不到一點(diǎn)油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經(jīng)常可以看到黃色的油滴往外流？討論：咸鴨蛋煮熟了，蛋黃里會有油，這是什么緣故？熟鴨蛋蛋黃中57蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來，乳濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就互相聚集起來，變成大油液，使得整個蛋黃變成油滋滋的，甚至流出油來了。蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的58第四節(jié)結(jié)晶定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，經(jīng)過濾、洗滌可得到純度高的晶體。

第四節(jié)結(jié)晶定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列59一、結(jié)晶過程二、過飽和溶液的形成三、提高晶體質(zhì)量的途徑一、結(jié)晶過程60飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出；一、結(jié)晶過程1.概念飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度61推動力：形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達(dá)到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當(dāng)溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度后，才可能有晶體析出。晶核：最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。首先形成晶核，微小的晶核具有較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在。2.晶體的形成結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。條件：推動力：2.晶體的形成結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形62過程：形成過飽和溶液晶核形成晶體生長過程：633.結(jié)晶曲線穩(wěn)定態(tài)：不沉淀結(jié)晶亞穩(wěn)定態(tài)：不自動生產(chǎn)結(jié)晶，加入晶體能誘導(dǎo)結(jié)晶?？刂茥l件，讓晶體緩慢長大。不穩(wěn)定態(tài)：自動沉淀結(jié)晶，大量細(xì)小結(jié)晶※結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行3.結(jié)晶曲線穩(wěn)定態(tài)：不沉淀結(jié)晶※結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行644.起晶方法自然起晶

把溶液蒸發(fā)濃縮至過飽和區(qū)（不穩(wěn)定區(qū)），則有大量晶核自然形成。但晶核數(shù)量難以控制，晶粒小。

4.起晶方法自然起晶65刺激起晶把溶液蒸發(fā)至接近過飽和線后把溶液放出，使溶液突然冷卻，進(jìn)入過飽和區(qū)形成大量晶核。當(dāng)晶核達(dá)到一定數(shù)量后，回升溫度，使溶液進(jìn)入介穩(wěn)區(qū)，停止晶核產(chǎn)生，然后再慢慢冷卻，同時攪拌，使晶核長大。

刺激起晶66晶種起晶將溶液濃縮到介穩(wěn)定區(qū)的飽和濃度后，加入一定大小和數(shù)量的晶種，同時均勻攪拌，使晶體長大。優(yōu)點(diǎn)：控制方便，產(chǎn)品晶體大小均勻。

晶種起晶67二、過飽和溶液的形成（結(jié)晶方法）1.蒸發(fā)法蒸發(fā)除去部分溶劑，在常壓或減壓下加熱除去一部分溶劑，以達(dá)到或維持過飽和度。適用于小分子化合物的結(jié)晶，受熱變性的蛋白質(zhì)或酶類不宜采用。二、過飽和溶液的形成（結(jié)晶方法）1.蒸發(fā)法682.溫度誘導(dǎo)法通過升高或降低溫度，使溶液逐漸達(dá)到飽和，可緩慢析出晶體。熱盒技術(shù)耐熱生化物質(zhì)高溫溶解→溫度逐漸下降析出晶體2.溫度誘導(dǎo)法通過升高或降低溫度，使溶液逐漸達(dá)到飽和，可緩慢693.鹽析結(jié)晶法固體鹽粉末、飽和鹽溶液（中性鹽）蛋白質(zhì)及酶類藥物制備中常用方法3.鹽析結(jié)晶法704.透析結(jié)晶法71使溶解度的變化連續(xù)又緩慢4.透析結(jié)晶法71使溶解度的變化連續(xù)又緩慢715.有機(jī)溶劑結(jié)晶常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、異丙醇、乙腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。蛋白質(zhì)變性溶劑回收6.等電點(diǎn)結(jié)晶5.有機(jī)溶劑結(jié)晶727.微量擴(kuò)散法通過氣相擴(kuò)散使樣品中溶質(zhì)達(dá)到飽和→晶體7.微量擴(kuò)散法通過氣相擴(kuò)散使樣品中溶質(zhì)達(dá)到飽和→晶體738.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)pH或加反應(yīng)劑→生成新物質(zhì)→結(jié)晶其實(shí)質(zhì)是利用化學(xué)反應(yīng)，對待結(jié)晶的物質(zhì)進(jìn)行修飾，一方面可以調(diào)節(jié)其溶解特性，同時也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)；8.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)pH或加反應(yīng)劑→生成新物質(zhì)→結(jié)晶其實(shí)質(zhì)是749.共沸蒸餾結(jié)晶共沸物的共沸點(diǎn)↓真空下共沸點(diǎn)↓真空低溫下進(jìn)行共沸蒸餾結(jié)晶常多種方法綜合應(yīng)用9.共沸蒸餾結(jié)晶共沸物的共沸點(diǎn)↓75工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容： 晶體大小、形狀和純度三、提高晶體質(zhì)量的途徑工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。三、提高761）過飽和度過飽和度值應(yīng)大至使結(jié)晶操作控制在亞穩(wěn)區(qū)內(nèi)，又保持較高的晶體生長速率，使結(jié)晶高產(chǎn)而優(yōu)質(zhì)。2）溫度（緩慢冷卻）1.晶體大小

快速冷卻或蒸發(fā)大量細(xì)小的晶體

緩慢冷卻或蒸發(fā)大而均勻的晶體1）過飽和度1.晶體大小快速冷卻或蒸發(fā)773）攪拌速度：適當(dāng)，不宜太快

攪拌的作用:

①加速溶液的熱傳導(dǎo)，加快生產(chǎn)過程。②加速溶質(zhì)擴(kuò)散過程的速率，有利于晶體成長。③使溶液的溫度均勻，防止溶液局部濃度不均，結(jié)垢等。④使晶核散布均勻，防止晶體粘連在一起形成晶簇，降低產(chǎn)品質(zhì)量。4）晶種：誘導(dǎo)結(jié)晶，控制晶體形狀大小均勻度3）攪拌速度：適當(dāng)，不宜太快攪拌的作用:4）晶種：誘導(dǎo)結(jié)782.晶體形狀晶體生長速度過飽和度溶劑pH：pH的變化，可以改變?nèi)苜|(zhì)分子的帶電性質(zhì)，是影響溶質(zhì)分子溶解度的一個重要因素。一般結(jié)晶液所選用的pH與沉淀大致相同。雜質(zhì)2.晶體形狀晶體生長速度793.晶體純度母液中的雜質(zhì)晶體越細(xì)小，雜質(zhì)越多洗滌有利提高純度結(jié)晶速度過快，易產(chǎn)生“晶蔟”，包含雜質(zhì)

雜質(zhì)對晶體的成長速率的影響較為復(fù)雜，有的雜質(zhì)能抑制晶體的成長，有的能促進(jìn)成長，有的能改變晶型。3.晶體純度母液中的雜質(zhì)雜質(zhì)對晶體的成長速率的影響較為復(fù)雜804.晶體結(jié)塊原因：粒度不齊、空氣濕度高、溫度高、受壓、貯存時間增長措施：控制粒度分布、良好外形、干燥密閉容器貯存4.晶體結(jié)塊原因：815.重結(jié)晶晶體用合適溶劑溶解后再次結(jié)晶，提高純度用于生物物質(zhì)重結(jié)晶的溶劑一般有蒸餾水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級醇等。5.重結(jié)晶晶體用合適溶劑溶解后再次結(jié)晶，提高純度82結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的一種有效手段。變性蛋白質(zhì)不能結(jié)晶，所以凡結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)都能保持天然狀態(tài)。2022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院832022/12/183南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的一種有效手段。變性蛋白質(zhì)83

谷氨酸結(jié)晶谷氨酸結(jié)晶84固相析出法的應(yīng)用固相析出法的應(yīng)用85例1：尿激酶的沉淀分離尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸附法、層析法沉淀法：金屬離子形成復(fù)合鹽脫鹽鹽析例1：尿激酶的沉淀分離尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸附法、層86Zn離子沉淀尿激酶低濃度時，zn

能選擇沉淀尿激酶。在3mM可得85-92回收率，而沉淀物的量并不多；加大Zn濃度雖然能提高有限回收率，但沉淀物量大，純度降低。沉淀量酶活Zn離子沉淀尿激酶低濃度時，zn能選擇沉淀尿激酶。在3m87EDTA溶出效應(yīng)EDTA溶出效應(yīng)88硫酸銨溶解尿激酶鋅絡(luò)合物硫酸銨的選用1)它在低濃度時可能有鹽溶作用，促進(jìn)沉淀蛋白溶解；2)因?yàn)楸旧碛蠳H4+，與Zn2+有絡(luò)合作用，有利于沉淀物溶解；3)硫酸銨為鹽析所用，在最終鹽析中，只需補(bǔ)加規(guī)定量即可，而不引入其他成分。硫酸銨溶解尿激酶鋅絡(luò)合物硫酸銨的選用89尿激酶鹽析沉淀沉淀量回收率純度尿激酶鹽析沉淀沉淀量回收率90例2：檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它在食品、醫(yī)藥、化工、皮革、環(huán)保等工業(yè)部門都有廣泛的用途。目前檸檬酸極大多數(shù)是通過微生物發(fā)酵法（黑曲霉）生產(chǎn)，提取工藝中，目前大多通過沉淀法制備（碳酸鈣沉淀及硫酸酸解）例2：檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它在食品、醫(yī)藥、91標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖加熱到70度pH1.8~2.0

過濾標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖加熱到70度pH1.8~2.0過92例3：胰蛋白酶的提取從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝胰蛋白酶原的溶解：酸性條件下穩(wěn)定溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（pI10.8)濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析）溶解激活（酶原-酶）胰蛋白酶的進(jìn)一步分離：酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同例3：胰蛋白酶的提取從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝93胰蛋白酶的提取（二）胰蛋白酶原激活濾餅溶解,加入無水CaCl2,邊加邊攪拌,最終含有0.1MCaCl2；5MNaOH調(diào)pH至8.0,加極少量胰酶攪拌，于室溫下活化8～10小時；活化完成，用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5-3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。（一）豬胰蛋白酶原的提取胰臟絞碎加入2倍體積冷乙酸(pH2.5)低溫?cái)嚢?4小時，過濾；濾液用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，放置3～4小時后，用濾紙過濾；濾液加入硫酸銨,達(dá)0.75飽和度放置過夜抽濾，得酶原粗制品。（三）胰蛋白酶的分離將激活溶液加入固體硫酸銨,達(dá)0.4飽和度,數(shù)小時后抽濾棄濾餅。濾液加入硫酸銨，飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時，抽濾棄濾液，即得胰蛋白酶粗品。胰蛋白酶的提?。ǘ┮鹊鞍酌冈せ睿ㄒ唬┴i胰蛋白酶原的提取（94例4：四環(huán)素的沉淀提取四環(huán)素由鏈霉菌發(fā)酵獲得四環(huán)素等電點(diǎn)pI=5。當(dāng)溶液的pH等于等電點(diǎn)時，四環(huán)素易從水溶液中沉淀出來（游離堿），因此可用于四環(huán)素的提取。四環(huán)素又能與尿素形成1：1的復(fù)鹽，從水溶液中沉淀出來，該復(fù)鹽溶于有機(jī)溶劑時，即分解成四環(huán)素和尿素。四環(huán)素與尿素的這一反應(yīng)具有特異性：金霉素，土霉素都不能與尿素形成復(fù)合物沉淀。利用這一性質(zhì)，可精制四環(huán)素。例4：四環(huán)素的沉淀提取四環(huán)素由鏈霉菌發(fā)酵獲得95四環(huán)素發(fā)酵液預(yù)處理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分別加0.2％(w/v)黃血鹽、硫酸鋅過濾濾洗液發(fā)酵液濾渣0.5%草酸水頂洗洗液濾液四環(huán)素發(fā)酵液預(yù)處理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分別加過濾96第一步沉淀提取沉淀粗堿濾液

7000-9000u/ml攪拌下慢慢加入濃氨水調(diào)pH4.810-15℃，攪拌30min，過濾第一步沉淀提取沉淀粗堿濾液攪拌下慢慢加入濃氨水調(diào)pH4.897第二步沉淀提取溶于尿素鹽酸溶液中（粗堿干重:尿素:水:濃HCl1:2:2:0.25）

粗堿粗堿尿素溶液沉淀四環(huán)素尿素復(fù)鹽丁醇清液丁醇懸浮溶液溶于酸性丁醇中復(fù)鹽干重:丁醇:濃HCl＝1:10:0.3

(丁醇先，攪拌下滴加HCl)濾去不溶物

濃氨水調(diào)pH4.6～4.8攪拌20min，過濾結(jié)晶第二步沉淀提取溶于尿素鹽酸溶液中粗堿粗堿尿素溶液沉淀丁醇清98思考題1.沉淀與結(jié)晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？2.何謂鹽析？其原理是什么？常用的鹽析方法有哪些？影響鹽析的主要因素有哪些？鹽析操作時常用的鹽是什么？3.有機(jī)溶劑沉淀法的主要原理是什么？影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素有哪些？4.什么是結(jié)晶？結(jié)晶過程包括哪些？在何種條件下，溶液中才有晶體析出？5.提高晶體質(zhì)量的途徑思考題1.沉淀與結(jié)晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？99目的：濃縮；初步純化；將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。固相析出法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。概述固相析出分離法：生化物質(zhì)目的物經(jīng)常作為溶質(zhì)存在于溶液中，改變?nèi)芤簵l件，使它以固體形式從溶液中分離的操作技術(shù)。目的：概述固相析出分離法：生化物質(zhì)目的物經(jīng)常作為溶質(zhì)存在于溶100

固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。固相析出法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高缺點(diǎn)：針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)固相析出操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶101

鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法固相析出法等電點(diǎn)沉淀法結(jié)晶法其它多種沉淀法結(jié)晶法：析出物為晶體。沉淀法：析出物為無定形固體。固相析出法分類鹽析法結(jié)晶法：102第一節(jié)鹽析法第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法第三節(jié)其它沉淀方法第四節(jié)結(jié)晶第一節(jié)鹽析法103第一節(jié)鹽析法一、基本原理二、影響因素三、鹽析操作第一節(jié)鹽析法一、基本原理104定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高；沉淀含大量鹽析劑，要除鹽；產(chǎn)生氨的惡臭105定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過105兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小106兩種現(xiàn)象：71062022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1072022/11/30南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院81072022/12/1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1082022/11/30南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院9108一、基本原理109一、基本原理10109鹽析作用（saltingout）原理破壞雙電層：在高鹽溶液中，帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質(zhì)表面的電荷，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用相互減弱而能相互聚集起來。破壞水化層：中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀。鹽析作用（saltingout）原理破壞雙電層：破壞水化層110logS=-KsS——蛋白質(zhì)溶解度，g/L；—鹽離子強(qiáng)度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價；——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;Ks——鹽析常數(shù)。111鹽析和KS鹽析右圖示：鹽離子濃度與蛋白質(zhì)溶解度關(guān)系曲線，在鹽析區(qū)，符合公式logS=-Ks12鹽析和KS鹽析右圖示：鹽離子濃度與111兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作Ks鹽析法。由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。（2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作β鹽析法。由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，后期分離（結(jié)晶）112兩種類型：13112二、影響鹽析的因素1.無機(jī)鹽的種類在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價離子作用較弱陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+

＞高價陽離子陰離子的影響大于陽離子二、影響鹽析的因素1.無機(jī)鹽的種類在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類113鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)鹽析用鹽的選擇114鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑（1）價廉；（2）溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，（4）不易引起蛋白質(zhì)變性。缺點(diǎn)：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉缺點(diǎn)：115不同種類蛋白質(zhì)——所需的無機(jī)鹽量不同先后加入不同量無機(jī)鹽—分級沉淀蛋白質(zhì)2.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類：Ks、β不同蛋白溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系不同種類蛋白質(zhì)——所需的無機(jī)鹽量不同2.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類116鹽析分布曲線117鹽析分布曲線18117蛋白質(zhì)濃度不同：所需無機(jī)鹽用量不同蛋白質(zhì)濃度高：所需無機(jī)鹽量少制成品：可適當(dāng)高濃度，但濃度過高，易共沉淀重疊蛋白分級：適當(dāng)稀釋，共沉淀小，但回收率降低。3.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）濃度：2~3%不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線蛋白質(zhì)濃度不同：所需無機(jī)鹽用量不同3.溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）濃度：118無機(jī)或稀鹽溶液：T↑蛋白質(zhì)溶解度↑高鹽溶液：T↑蛋白質(zhì)溶解度↓蛋白質(zhì)：室溫鹽析對溫度敏感的酶，0?C~4?C4.溫度：溫度對溶解度的影響無機(jī)或稀鹽溶液：T↑蛋白質(zhì)溶解度↑4.溫度：溫度對溶解度的影1195.pH：Pl鹽析注意高鹽下pl的偏移：與負(fù)離子結(jié)合向低pH偏移，與正離子結(jié)合向高pH偏移利用蛋白質(zhì)pl的不同：可分級沉淀蛋白質(zhì)5.pH：Pl鹽析120三、鹽析操作1.鹽析用鹽的濃度表示硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。三、鹽析操作1.鹽析用鹽的濃度表示硫酸銨的加入有以下幾種方法121鹽析用鹽量的表征--飽和度：飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和濃度是767g/L定義為100%飽和度目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%飽和度時，溶解度都小于0.lmg／L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。鹽析用鹽量的表征--飽和度：飽和度（Saturation）的122調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表123鹽析方法：1）分步鹽析法(不同的鹽濃度)2）重復(fù)鹽析法高蛋白質(zhì)濃度下共沉淀→重復(fù)鹽析提高純度3）反抽提法(相同鹽濃度)2、鹽析方法和注意事項(xiàng)鹽析方法：2、鹽析方法和注意事項(xiàng)124分級鹽析法不斷提高鹽濃度：不同蛋白質(zhì)分級沉淀低飽和度：除雜蛋白，高飽和度：沉淀目的物血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分級鹽析法血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和125單酶鹽析曲線雙酶鹽析曲線單酶鹽析曲線雙酶鹽析曲線126反抽提法共沉淀→較低濃度鹽溶液溶雜蛋白大腸桿菌RNA聚合酶的制備反抽提法大腸桿菌RNA聚合酶的制備127防止“局部過濃”：慢加，攪拌溫度：不宜過低，室溫10~25?C，易失活：0~10?C時間：沉淀需經(jīng)一段老化時間（1小時）后分離注意事項(xiàng)：防止“局部過濃”：慢加，攪拌注意事項(xiàng)：128第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法一、基本原理二、影響沉淀效果的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法一、基本原理129概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)130優(yōu)點(diǎn)：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）溶劑易除去3）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；缺點(diǎn)：1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進(jìn)行。3）成本高，需防火防爆總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。優(yōu)點(diǎn)：131一、基本原理1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。

2、水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。脫水作用比靜電作用強(qiáng)一、基本原理1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引132一些溶劑的介電常數(shù)

133一些溶劑的介電常數(shù)34133二、影響沉淀效果的因素1.有機(jī)溶劑種類及用量能與水無限混溶介電常數(shù)小、沉淀強(qiáng)變性小毒性小，揮發(fā)性適中二、影響沉淀效果的因素1.有機(jī)溶劑種類及用量134常用：乙醇、丙酮（揮發(fā)肝毒性著火點(diǎn)低）和甲醇（口服毒性）介電常數(shù)：無水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；用量：（了解）常用：乙醇、丙酮（揮發(fā)肝毒性著火點(diǎn)低）和甲醇（口服毒性）1352.pH的影響Pl附近、穩(wěn)定性控制溶液pH時務(wù)必使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶有相同電荷，勿使目的物與雜質(zhì)帶異電荷導(dǎo)致共沉淀。2.pH的影響136嚴(yán)格控制低溫有機(jī)溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)預(yù)冷（有機(jī)溶劑-10℃以下，蛋白質(zhì)0℃左右），在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃變性，并散熱。溫度影響有機(jī)溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。3.溫度嚴(yán)格控制低溫3.溫度137低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L），<5%少量的中性鹽：保護(hù)作用，減少蛋白質(zhì)變性，穩(wěn)定介質(zhì)pH，減少水和溶劑互溶現(xiàn)象鹽濃度較高（>0.2mol/L）：鹽溶，增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑―水溶液中的溶解度，會增加溶媒用量，沉淀物中可能夾帶鹽，需除鹽常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。4.無機(jī)鹽的含量低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L），<5%4.無機(jī)1385.某些金屬離子的助沉淀作用Zn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，而活性不變，有助于沉淀，降低有機(jī)溶劑用量。胰島素精制：5.某些金屬離子的助沉淀作用Zn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白1396.樣品濃度較?。喝軇┝俊章省?，稀釋變性較高：共沉淀↑，分辨率↓，溶劑量↓，回收率↑，變性小蛋白質(zhì)初濃度：0.5%~2%粘多糖：1~2%6.樣品濃度較稀：溶劑量↑，收率↓，稀釋變性140

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響

收率%酶活收率酶活

6.5pH

*

適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

收率%酶活酶活

收率

1020T℃

*

適宜的溫度10~20℃

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究141第三節(jié)其它沉淀方法一、等電點(diǎn)沉淀二、成鹽沉淀法三、親和沉淀四、高分子聚合物沉淀法五、表面活性劑沉淀法第三節(jié)其它沉淀方法一、等電點(diǎn)沉淀142一、等電點(diǎn)沉淀法原理：Pl時分子表面靜電荷為零，雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。一、等電點(diǎn)沉淀法143常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用。主要：去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用。144二、成鹽沉淀法1.金屬離子沉淀所用的金屬離子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。蛋白質(zhì)和酶分子中因?yàn)楹辛u基、氨基、咪唑基和硫氫基等，均可以和上述金屬離子作用形成鹽復(fù)合物。分離沉淀→復(fù)合物分解→除金屬離子（離子交換或金屬螯合劑EDTA）二、成鹽沉淀法1.金屬離子沉淀145應(yīng)用：目的蛋白分離，去雜質(zhì)缺點(diǎn)：有時復(fù)合物分解較困難，蛋白質(zhì)易變性應(yīng)用：1462.有機(jī)酸類復(fù)合鹽

含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。工業(yè)上用此法制備蛋白質(zhì)時，需采取較溫和的條件，有時還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。2.有機(jī)酸類復(fù)合鹽147單寧：結(jié)合后牢固，競爭結(jié)合法分解雷凡諾：不影響蛋白質(zhì)活性三氯乙酸（TCA）：變性，除雜蛋白單寧：結(jié)合后牢固，競爭結(jié)合法分解148

雷凡諾

雷凡諾149豬心提取液洗脫液上清液上清細(xì)胞色素C

沉淀（去除）吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析豬心提取液洗脫液吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸150三、親和沉淀法配基+可溶性載體→偶聯(lián)成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑）可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀出來它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。所以其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，而是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。三、親和沉淀法配基+可溶性載體→偶聯(lián)成載體-配基復(fù)合物（親和151親和沉淀

過程親和過程提供了一個從復(fù)雜混合物中分離提取單一產(chǎn)品的有效方法。①初始階段，將一個目標(biāo)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親合配位體絡(luò)和形成沉淀；②所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)；③用一種適當(dāng)?shù)脑噭⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)從配位體中離解出來。親和沉淀過程親和過程提供了一個從復(fù)雜混合物中分離提取152四、高分子聚合物沉淀法水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。PEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖雙水相或單高聚物其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇。無毒，對產(chǎn)品的影響小，但不易除去四、高分子聚合物沉淀法水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質(zhì)、表面活性劑沉淀法CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）、CPC(十六烷基氯化吡啶)

：沉淀酸性多糖與多糖上的陰離子形成形成季銨絡(luò)合物，降低離子強(qiáng)度，絡(luò)合物析出。SDS：分離胰蛋白或核蛋白目的是使核酸和蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。五、表面活性劑沉淀法CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）155討論：咸鴨蛋煮熟了，蛋黃里會有油，這是什么緣故？熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)31％，為什么看不到一點(diǎn)油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經(jīng)?？梢钥吹近S色的油滴往外流？討論：咸鴨蛋煮熟了，蛋黃里會有油，這是什么緣故？熟鴨蛋蛋黃中156蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來，乳濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就互相聚集起來，變成大油液，使得整個蛋黃變成油滋滋的，甚至流出油來了。蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的157第四節(jié)結(jié)晶定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，經(jīng)過濾、洗滌可得到純度高的晶體。

第四節(jié)結(jié)晶定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列158一、結(jié)晶過程二、過飽和溶液的形成三、提高晶體質(zhì)量的途徑一、結(jié)晶過程159飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出；一、結(jié)晶過程1.概念飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度160推動力：形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達(dá)到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當(dāng)溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度后，才可能有晶體析出。晶核：最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。首先形成晶核，微小的晶核具有較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在。2.晶體的形成結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。條件：推動力：2.晶體的形成結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形161過程：形成過飽和溶液晶核形成晶體生長過程：1623.結(jié)晶曲線穩(wěn)定態(tài)：不沉淀結(jié)晶亞穩(wěn)定態(tài)：不自動生產(chǎn)結(jié)晶，加入晶體能誘導(dǎo)結(jié)晶?？刂茥l件，讓晶體緩慢長大。不穩(wěn)定態(tài)：自動沉淀結(jié)晶，大量細(xì)小結(jié)晶※結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行3.結(jié)晶曲線穩(wěn)定態(tài)：不沉淀結(jié)晶※結(jié)晶操作通常都在亞穩(wěn)區(qū)中進(jìn)行1634.起晶方法自然起晶

把溶液蒸發(fā)濃縮至過飽和區(qū)（不穩(wěn)定區(qū)），則有大量晶核自然形成。但晶核數(shù)量難以控制，晶粒小。

4.起晶方法自然起晶164刺激起晶把溶液蒸發(fā)至接近過飽和線后把溶液放出，使溶液突然冷卻，進(jìn)入過飽和區(qū)形成大量晶核。當(dāng)晶核達(dá)到一定數(shù)量后，回升溫度，使溶液進(jìn)入介穩(wěn)區(qū)，停止晶核產(chǎn)生，然后再慢慢冷卻，同時攪拌，使晶核長大。

刺激起晶165晶種起晶將溶液濃縮到介穩(wěn)定區(qū)的飽和濃度后，加入一定大小和數(shù)量的晶種，同時均勻攪拌，使晶體長大。優(yōu)點(diǎn)：控制方便，產(chǎn)品晶體大小均勻。

晶種起晶166二、過飽和溶液的形成（結(jié)晶方法）1.蒸發(fā)法蒸發(fā)除去部分溶劑，在常壓或減壓下加熱除去一部分溶劑，以達(dá)到或維持過飽和度。適用于小分子化合物的結(jié)晶，受熱變性的蛋白質(zhì)或酶類不宜采用。二、過飽和溶液的形成（結(jié)晶方法）1.蒸發(fā)法1672.溫度誘導(dǎo)法通過升高或降低溫度，使溶液逐漸達(dá)到飽和，可緩慢析出晶體。熱盒技術(shù)耐熱生化物質(zhì)高溫溶解→溫度逐漸下降析出晶體2.溫度誘導(dǎo)法通過升高或降低溫度，使溶液逐漸達(dá)到飽和，可緩慢1683.鹽析結(jié)晶法固體鹽粉末、飽和鹽溶液（中性鹽）蛋白質(zhì)及酶類藥物制備中常用方法3.鹽析結(jié)晶法1694.透析結(jié)晶法170使溶解度的變化連續(xù)又緩慢4.透析結(jié)晶法71使溶解度的變化連續(xù)又緩慢1705.有機(jī)溶劑結(jié)晶常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、異丙醇、乙腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。蛋白質(zhì)變性溶劑回收6.等電點(diǎn)結(jié)晶5.有機(jī)溶劑結(jié)晶1717.微量擴(kuò)散法通過氣相擴(kuò)散使樣品中溶質(zhì)達(dá)到飽和→晶體7.微量擴(kuò)散法通過氣相擴(kuò)散使樣品中溶質(zhì)達(dá)到飽和→晶體1728.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)pH或加反應(yīng)劑→生成新物質(zhì)→結(jié)晶其實(shí)質(zhì)是利用化學(xué)反應(yīng)，對待結(jié)晶的物質(zhì)進(jìn)行修飾，一方面可以調(diào)節(jié)其溶解特性，同時也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)；8.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)pH或加反應(yīng)劑→生成新物質(zhì)→結(jié)晶其實(shí)質(zhì)是1739.共沸蒸餾結(jié)晶共沸物的共沸點(diǎn)↓真空下共沸點(diǎn)↓真空低溫下進(jìn)行共沸蒸餾結(jié)晶常多種方法綜合應(yīng)用9.共沸蒸餾結(jié)晶共沸物的共沸點(diǎn)↓174工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容： 晶體大小、形狀和純度三、提高晶體質(zhì)量的途徑工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。三、提高1751）過飽和度過飽和度值應(yīng)大至使結(jié)晶操作控制在亞穩(wěn)區(qū)內(nèi)，又保持較高的晶體生長速率，使結(jié)晶高產(chǎn)而優(yōu)質(zhì)。2）溫度（緩慢冷卻）1.晶體大小

快速冷卻或蒸發(fā)大量細(xì)小的晶體

緩慢冷卻或蒸發(fā)大而均勻的晶體1）過飽和度1.晶體大小快速冷卻或蒸發(fā)1763）攪拌速度：適當(dāng)，不宜太快

攪拌的作用:

①加速溶液的熱傳導(dǎo)，加快生產(chǎn)過程。②加速溶質(zhì)擴(kuò)散過程的速率，有利于晶體成長。③使溶液的溫度均勻，防止溶液局部濃度不均，結(jié)垢等。④使晶核散布均勻，防止晶體粘連在一起形成晶簇，降低產(chǎn)品質(zhì)量。4）晶種：誘導(dǎo)結(jié)晶，控制晶體形狀大小均勻度3）攪拌速度：適當(dāng)，不宜太快攪拌的作用:4）晶種：誘導(dǎo)結(jié)1772.晶體形狀晶體生長速度過飽和度溶劑pH：pH的變化，可以改變?nèi)苜|(zhì)分子的帶電性質(zhì)，是影響溶質(zhì)分子溶解度的一個重要因素。一般結(jié)晶液所選用的pH與沉淀大致相同。雜質(zhì)2.晶體形狀晶體生長速度1783.晶體純度母液中的雜質(zhì)晶體越細(xì)小，雜質(zhì)越多洗滌有利提高純度結(jié)晶速度過快，易產(chǎn)生“晶蔟”，包含雜質(zhì)

雜質(zhì)對晶體的成長速率的影響較為復(fù)雜，有的雜質(zhì)能抑制晶體的成長，有的能促進(jìn)成長，有的能改變晶型。3.晶體純度母液中的雜質(zhì)雜質(zhì)對晶體的成長速率的影響較為復(fù)雜1