《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)及氨基酸的顏色反應(yīng)一、目的意義1、學(xué)習(xí)幾種鑒定氨基酸與蛋白質(zhì)的一般方法及其原理。2、學(xué)習(xí)和了解一些鑒定蛋白質(zhì)的特殊顏色反應(yīng)及其原理。二、實(shí)驗(yàn)原理1、雙縮脲反應(yīng)1801這一呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有多個與雙縮脲相似的鍵，因此也具有雙縮脲的顏色反應(yīng).借此可以鑒定蛋白質(zhì)的存在或測定其含量。應(yīng)當(dāng)指出，雙縮脲反應(yīng)并非蛋白質(zhì)的特異顏色反應(yīng)，因?yàn)榉埠须逆I的物質(zhì)并不都是蛋白質(zhì).2、茚三酮反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及氨基酸（除脯氨酸和羥脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反應(yīng).該反應(yīng)十分靈敏，1:1500000濃度的氨基酸水溶液就能呈現(xiàn)反應(yīng)。因此，此反應(yīng)廣泛用于氨基酸的定量測定.3、黃色反應(yīng)含有苯環(huán)側(cè)鏈的（特別是含酪氨酸）蛋白質(zhì)溶液與硝酸共熱時，呈黃色（硝基化合物)，再加堿則變?yōu)槌赛S色，此反應(yīng)也稱為黃蛋白反應(yīng)。HOOH+ HNO HO NO +HO3 2 2OHHO NO2 + NaOH O N1 OHPAGEPAGE5三、儀器與試劑1、試劑(1)蛋白質(zhì)溶液：取10mL100mL,攪拌均勻后用紗布過濾得上清液。（2)。30。。30。50.5%苯酚溶液。(3）0.1％茚三酮－乙醇溶液:稱取0。1g茚三酮，溶于100mL95％乙醇。(4）10%NaOH溶液、1％硫酸銅溶液、尿素、濃硝酸.2、儀器：試管及試管夾、酒精燈。四、操作方法1、雙縮脲反應(yīng)(1)此時，尿素已縮合為雙縮脲并放出氨氣（可由氣味辨別1mL10％NaOH溶液，振蕩使其溶解，再加入11%.(2）另取1支試管，加入1mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL10%NaOH溶液搖勻，然后再加入2滴1%的硫酸銅溶液。搖勻觀察其顏色變化.(3)注意事項(xiàng)加入的硫酸銅不可過量，否則會產(chǎn)生藍(lán)色的氫氧化銅，從而掩蓋了雙縮脲反應(yīng)的粉紅色。(4）記載上述實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果,并解釋現(xiàn)象.2、茚三酮反應(yīng)3,0.30.50.1％茚三酮－乙醇溶液，混勻后在小火上加熱煮沸1－2min,放置冷卻，觀察顏色變化。在濾紙的不同部位分別滴上一滴。30.5%0.1%茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察斑點(diǎn)出現(xiàn)及其顏色。(3）記載上述實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果，并解釋現(xiàn)象。3、黃色反應(yīng)向6個試管中按下表加試劑,觀察現(xiàn)象并記錄。管號123 4 56材料蛋白質(zhì)溶液指甲0。5％苯頭發(fā) 0.3％色氨酸0。3％酪氨酚酸加入量(滴)4少許少許 4 44濃硝酸（滴）22020 4 44酒精燈加熱煮沸現(xiàn)象現(xiàn)象10％NaOH后現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)中沉淀析出（渾濁現(xiàn)象，此現(xiàn)象叫蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用一、目的意義二、實(shí)驗(yàn)原理鹽析現(xiàn)象是指—般蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性鹽至一②分子所帶電荷被中和。鹽溶現(xiàn)象為低鹽濃度可使蛋白質(zhì)的溶解度增加,實(shí)驗(yàn)時要加足夠量的鹽。蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程,用鹽析方法沉淀蛋白質(zhì)時，較少引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析或用水稀釋時又可溶解。三、儀器與試劑1、試劑⑴蛋白質(zhì)溶液:取10mL雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后用紗布過濾得上清液。⑵飽和硫酸銨溶液；⑶10％氫氧化鈉溶液；⑷1%硫酸銅溶液.四、操作方法1、取蛋白質(zhì)溶液約2mL于試管中,加入過量的飽和硫酸銨溶液,混勻后靜置3分鐘則析出沉淀。（二）重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)一、目的意義二、實(shí)驗(yàn)原理溶液pH,重金屬鹽類（如Pb2+Cu2+Hg2+及Ag+等）易與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。在使用某些重金屬鹽（,否則將引起沉淀再溶解，此時的溶解為生成憎水膠體的緣故。三、儀器與試劑1、試劑⑴蛋白質(zhì)溶液（與雙縮脲反應(yīng)相同；⑵5％CuSO4溶液；⑶3％AgNO3溶液。四、操作方法1、取試管2支各加蛋白質(zhì)溶液1mL.2、向各管分別滴加2－3滴加5％CuSO4溶液、3％AgNO3溶液，觀察各管所生成的沉淀。3、在硫酸銅產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀的試管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，繼續(xù)加入5％CuSO4溶液，觀察沉淀的溶解。(三）有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)一、目的意義二、實(shí)驗(yàn)原理生物堿是植物中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。凡能使生物堿沉淀，或能與生物堿作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)，稱為生物堿試劑。如鞣酸、苦味酸和磷鎢酸等。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH,溶液中的蛋白亦能被有機(jī)酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最為靈敏而且特異，因此廣泛地被,為首選沉淀劑，只能沉淀蛋白質(zhì)，不能沉淀其水解產(chǎn)物，加熱可除去。三、儀器與試劑1、試劑⑴蛋白質(zhì)溶液(與雙縮脲反應(yīng)相同）;⑵5％三氯醋酸溶液；⑶5％單寧酸溶液。四、操作方法1、取蛋白質(zhì)溶液1mL于試管中，加數(shù)滴三氯醋酸溶液,觀察現(xiàn)象。2、取蛋白質(zhì)溶液1mL于試管中，加數(shù)滴單寧酸溶液，觀察現(xiàn)象.實(shí)驗(yàn)三氨基酸的紙層析一、目的意義1、了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法.2、學(xué)習(xí)紙層析的操作技術(shù)，分離鑒定未知樣品的氨基酸成分。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析法屬于分配層析法的一種，是以濾紙作為惰性支持物。濾紙纖維上分布大量的親水性羥基，因此能吸附水作為固定相，通常把有機(jī)溶劑作為流動相。將樣品在濾紙上（此點(diǎn)稱為原點(diǎn)因而不同溶質(zhì)隨流動相移動的速率不等，于是從點(diǎn)樣的一端向另一端展開時，樣品中不同溶質(zhì)被分離開來，形成距原點(diǎn)距離不等的層析點(diǎn)。樣品被分離后在紙層析圖譜上的位置，是用比移值Rf來表示的（某物質(zhì)的Rf借此可作定性分析依據(jù)。三、儀器與試劑1、試劑（1）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:1％的甘氨酸、脯氨酸。（2)混合氨基酸溶液：將1%的甘氨酸、脯氨酸也按1％濃度制成混合溶液。（3）展層劑：將20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，與15毫升水混合，充分振蕩,靜止后分層，放出下層水層后備用。(4)顯色劑：0.1%2、儀器層析缸規(guī)格，垂直型、層析濾紙（事先裁成)吹風(fēng)（,每組一個、三角板、鉛筆和干紙巾（學(xué)生自帶，每組一套、毛細(xì)管。四、操作方法1、準(zhǔn)備濾紙：三個點(diǎn)，每隔2CM+。2、點(diǎn)樣：每個樣品用毛細(xì)管點(diǎn)3次，每次點(diǎn)完后用電吹風(fēng)吹干。一個樣品用一支毛細(xì)管。3、飽和平衡:在缸底部玻璃突起的一側(cè)加入10-15ml展層劑，另一側(cè)先不加；讓濾紙都放先放到未加展層劑的干燥一側(cè),然后蓋上蓋子平衡飽和20分鐘.（可寫試驗(yàn)報告，簡單講課)410-15ml側(cè)開始層析。5、結(jié)束層析:等到展層劑上升到距離濾紙上端3cm左右，就拿出濾紙，用鉛筆劃線描出液體6PAGEPAGE18的上邊界，然后用電吹風(fēng)吹干。6、茚三酮顯色:把濾紙放在桌面上，整張紙用滴管滴加滿茚三酮溶液，再用熱風(fēng)吹干，直到有結(jié)果出現(xiàn)。7、計(jì)算RF值：用鉛筆描出每個氨基酸的區(qū)域，測量距離計(jì)算甘氨酸和脯氨酸的Rf值.(每個組需將該濾紙夾在組長的實(shí)驗(yàn)報告中，并注明是第幾組）五、結(jié)果計(jì)算1、用鉛筆將層析結(jié)果輪廓和中心點(diǎn)描出來，計(jì)算各種氨基酸的Rf值.2、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。六、作業(yè)題1、若展開劑高于點(diǎn)樣線，對最終的層析結(jié)果有何影響？2、點(diǎn)樣時，樣品濃度太高或斑點(diǎn)之間間距過小，對最終的層析結(jié)果有何影響？實(shí)驗(yàn)四牛奶中酪蛋白的制備一、目的意義1、學(xué)習(xí)從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。2、掌握等電點(diǎn)沉淀法提取蛋白質(zhì)的方法.二、實(shí)驗(yàn)原理牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白,含量約為3。5g/100mL。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，不溶于水、醇、有機(jī)溶劑,等電點(diǎn)為4。7。利用等電點(diǎn)時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物,除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。三、儀器與試劑1、試劑（1）95％乙醇；（2）無水乙醚；(3）0.2mol/LpH4。7醋酸—-醋酸鈉緩沖液：先配A液與B液，A液：0。2mol/L醋酸鈉溶液，稱NaAC·3H2O54.44g，定容至2000mL;B0。2mol/L（99.8％)12.0gA1770mL,B1230mLpH4。73000mL。(）=：1(V/。（5）10％醋酸溶液2、儀器：新鮮牛奶；臺式離心機(jī)、抽濾裝置、精密pH試紙、恒溫水浴鍋、燒杯、溫度計(jì)、50ml大離心管.四、操作方法1、酪蛋白的粗提20mL43pH4720mL，對照精密pH%醋酸溶液調(diào)pH4.7（肉眼可見絮狀物質(zhì)。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心10分鐘（3000r/min).棄去清液，得酪蛋白粗制品。2、酪蛋白的純化（1）40ml（事先檢查真空泵是否已加滿水。(2)在沉淀中加入30mL（注意不要沾壁1（1（3）將沉淀攤開在干燥濾紙上，電爐上烘干,得酪蛋白純品。（4)準(zhǔn)確稱重,計(jì)算含量和得率。五、結(jié)果計(jì)算X＝m 100V式中:XmLVm。六、注意事項(xiàng)1度計(jì)測定。2、精制過程用乙醚是揮發(fā)性、有毒的有機(jī)溶劑，最好在通風(fēng)櫥內(nèi)操作.3七、作業(yè)題1、試驗(yàn)中,分別加入乙醇、乙醚洗滌沉淀的作用是什么？2、試驗(yàn)中,你覺得影響最終酪蛋白純度和得率的因素可能會有哪些？請簡單分析實(shí)驗(yàn)五酵母RNA的提取一、目的意義掌握稀堿法提取RNA的原理和方法，學(xué)會抽濾操作。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%～10.0%,而DNA。03％～0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成RNA,,.,然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH25RNA.三、儀器與試劑1、試劑⑴0.2％氫氧化鈉溶液；⑵酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl；⑶95%乙醇；⑷乙醚;2四、操作方法13g干酵母粉于研缽中（1030克，大研缽中磨，再分裝給各個組），加入30mL(103002%NaOH,。2:100mL（95度20分鐘10沉淀?xiàng)壢?上清液移到20mL10min.3:待RNA,4000r/min5分鐘。4棄去上清液30ml,轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾，繼而再用20ml5、稱重計(jì)算：稱量所得RNA粗品的重量。五、結(jié)果計(jì)算X＝m100V式中：X──RNA粗品含量，g/100g酵母；V──酵母的質(zhì)量,g；m──收獲RNA粗品的質(zhì)量，g。六、作業(yè)題1、RNA的含量測定還有其它方法嗎？試舉例簡單說明2、沸水浴的作用是什么？實(shí)驗(yàn)六糖的呈色反應(yīng)和定性鑒定（一）Fehling試驗(yàn)一、目的意義了解鑒定還原糖的方法及其原理.二、實(shí)驗(yàn)原理費(fèi)林試劑是含有硫酸銅和酒石酸鉀鈉的氫氧化鈉溶液。硫酸銅與堿溶液混合加熱,則生成黑色的氧化銅沉淀。若同時有還原糖存在,則產(chǎn)生黃色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。試劑中加入酒石酸鉀鈉，它與C2液內(nèi)保持一定濃度的氫氧化銅。費(fèi)林試劑是一種弱的氧化劑，它不與酮和芳香醛發(fā)生反應(yīng)。三、儀器與試劑1、試劑甲：稱取34。5g硫酸銅溶于500mL蒸餾水中。2、試劑乙:稱取125gNaOH137g酒石酸鉀鈉溶于500mL蒸餾水中，貯存于具橡皮塞玻璃瓶中.臨用前，將試劑甲和試劑乙等量混合成Fehling試劑。3、1;1淀粉溶液（先配好四、操作方法Fehling搖勻后,42～3min，取出冷卻，觀察沉淀和顏色變化。（二）Benedict試驗(yàn)(班氏試驗(yàn)）一、目的意義二、實(shí)驗(yàn)原理BenedictFehlingBenedict試劑利用檸檬酸作為Cu2+Fehling試劑弱，靈敏度高，干擾因素少。三、儀器與試劑1Benedict試劑（班氏試劑：將170g檸檬酸鈉和100g無水碳酸鈉溶于800mL水中另將17g100mL1000mL。該試劑可長期使用。2、1％葡萄糖溶液;1％蔗糖溶液；1％淀粉溶液。四、操作方法2mLBenedict4,5出后冷卻，觀察各管中的顏色變化。五、作業(yè)題:1、除這兩個試驗(yàn)方法外,還有其它何種辦法鑒別還原糖和非還原糖？請簡述實(shí)驗(yàn)七淀粉的提取和性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一、目的意義1、熟悉淀粉與碘的呈色反應(yīng)。2、了解淀粉的提取方法和水解條件及產(chǎn)物。二、實(shí)驗(yàn)原理1、淀粉的提取,谷類、果實(shí)、種子、塊莖中含量豐富。工業(yè)用的淀粉主要從玉米、甘薯、馬鈴薯中制取。淀粉是一種白色粉末，不溶于冷水，在熱水里淀粉顆粒會膨脹，有一部分淀粉溶解在水里，另.2、淀粉與碘的顯色反應(yīng)直鏈淀粉遇碘呈藍(lán)色，支鏈淀粉遇碘呈紫紅色,糊精遇碘呈藍(lán)紫、紫、橙等顏色。這些顯色反應(yīng)的靈敏度很高，可用作鑒別淀粉的定量和定性的方法，也可用它來分析碘的含量。淀粉和碘的顯色反應(yīng)除了吸附原因外,主要是由于生成包合物的緣故。直鏈淀粉是由α-葡萄糖分子縮合而成螺旋狀的長長的螺旋體,每個葡萄糖單元都仍有羥基暴露在螺旋外。碘分子跟這些羥基作用,使碘分子嵌入淀粉螺旋體的軸心部位.碘跟淀粉的這種作用叫做包合作用,生成物叫做包合物。淀粉跟碘生成的包合物的顏色,跟淀粉的聚合度或相對分子質(zhì)量有關(guān)。在一定的聚合度或200－98032000－160000,在支鏈上的直鏈平均聚合度20－28，這樣形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，顯棕紅色、紅色、淡紅色等。表2－1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的顏色葡萄糖單位的聚合度3。87。412.918.320.229.334.7以上包合物的顏色無色淡紅紅棕紅紫色藍(lán)紫色藍(lán)色淀粉跟碘生成的包合物不穩(wěn)定，易被乙醇、氫氧化鈉和熱等作用，使顏色褪去，而只在pH=43、淀粉的水解,的淀粉在小腸里胰臟分泌出的淀粉酶的作用下，繼續(xù)進(jìn)行水解，生成麥芽糖。麥芽糖在腸液供人體組織的營養(yǎng)需要。反應(yīng)過程為：（C6H12O5）m→（C6H10O5）n→C12H22O11→C6H12O6淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖三、儀器與試劑1、試劑(1)0.1％淀粉液5mL蒸餾水）、10％NaOH20%H2SO4溶液、10％Na2CO3溶液。（2）2％碘液:將碘化鉀20g及碘10g溶于100mL水中。使用前稀釋10倍。班氏（Benedict）試劑：見糖的呈色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。2、儀器:生馬鈴薯、組織搗碎機(jī)、紗布、布氏漏斗、抽濾瓶、水浴鍋、試管夾、量筒、燒杯、白瓷板、試管。四、操作方法1、淀粉的提?。ㄑ菔?實(shí)驗(yàn)不再做）生馬鈴薯去皮，切碎,稱取50g，加少量水，搗碎勻漿,用四層紗布過濾，除去粗顆粒,濾液中淀粉很快沉淀，然后用水多次洗滌淀粉,再抽濾后濾餅放在表面上風(fēng)干即可。2、淀粉與碘的反應(yīng)（1)取少量自制淀粉于白瓷板孔內(nèi)，加碘液兩滴，觀察顏色。（2)取試管一支，加入0。1％的淀粉液6mL,碘液兩滴，搖勻，觀察顏色變化。另取試管兩支，將前述淀粉液均分為三等份并編號做如下實(shí)驗(yàn)：又觀察顏色變化。10％NaOH溶液幾滴，觀察顏色變化號管加入乙醇4mL,觀察顏色變化。記3、淀粉的水解(1）14mL20.5g4mL20%3～4min。（2）把試管2中的一部分溶液倒入試管3中,留作下一步實(shí)驗(yàn)用。(3）向試管1和試管2中加入幾滴碘溶液，觀察現(xiàn)象.（4）320%Na2CO3pHCO2氣泡冒完為止2mL記載上述實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果，并解釋現(xiàn)象。六、作業(yè)題：1、在加熱的過程中，為什么碘與淀粉會呈現(xiàn)不同的顏色反應(yīng)？實(shí)驗(yàn)八油脂氧化酸敗的定性檢驗(yàn)及定量測定一、目的意義1、進(jìn)一步掌握油脂氧化酸敗的機(jī)理。2、學(xué)會油脂氧化酸敗的定性檢驗(yàn)及酸值測定的操作技術(shù).二、實(shí)驗(yàn)原理凝聚物酸值是評定油品酸敗程度的指標(biāo)之一，它是指中和1g油脂中游離脂肪酸所消耗的氫氧化(m→三、儀器與試劑1、試劑⑴0.1%間苯三酚乙醚溶液；⑵濃鹽酸；2∶10.1mol/L示劑呈中性；⑷酚酞指示劑：1％乙醇溶液；⑸0.1000mol/L氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液;⑹花生油(新鮮與不新鮮樣品各1種)。2、儀器：恒溫水浴、錐形瓶、試管及試管架、量筒、25mL比色管、滴定管、容量瓶。四、操作方法㈠油脂氧化酸敗的定性檢驗(yàn)1、間苯三酚乙醚溶液法（克萊斯氏環(huán)氧丙醛反應(yīng))取試樣2mL2m10s2mL10s結(jié)果表示：下層呈桃紅色或紅色表示油脂已酸敗,下層呈淺粉紅色或黃色表示未酸敗。㈡油脂酸值的測定3g30mL（2－30.1mol/L氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至初現(xiàn)微紅色,且300.1mol/L氫氧化鉀溶液的用量。五、結(jié)果計(jì)算VC56.11X= m──試樣的酸值（以氫氧化鉀計(jì)，mg/；VCm56.11──與1.0mL氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)臍溲趸浐量藬?shù)。六、注意事項(xiàng)1、間苯三酚乙醚法試驗(yàn)、酸值測定,切忌明火。2、酸值測定中，如油樣色澤深,可減少試樣用量或適當(dāng)增加混合溶劑的用量;如因色深判斷終點(diǎn)困難，可改換指示劑,用堿性藍(lán)6B、百里酚酞做指示劑或用酚酞試紙作外指示。3、測定蓖蔴油酸度時,只用中性乙醇而不用混合溶劑。4、光線會促進(jìn)空氣對試劑的氧化,應(yīng)注意避光存放試劑；實(shí)驗(yàn)九維生素C的定量測定一、目的意義2，6－二氯靛酚法測定維生素C二、實(shí)驗(yàn)原理維生素C又稱抗壞血酸，還原型抗壞血酸能還原染料2，6－二氯靛酚鈉鹽，本身則氧化成脫氫抗壞血酸。在酸性溶液中,2，6－二氯靛酚鈉離子呈紅色,被還原后變?yōu)闊o色.三、儀器與試劑1、試劑（1）2%草酸溶液；(2)0.001N2,6－二氯靛酚鈉溶液：稱取碳酸氫鈉52mg溶解在200mL熱蒸餾水中,然后稱取2，6－二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氫鈉溶液中。冷卻定容至250mL，過濾至棕色瓶內(nèi)，保存在冰箱中.每次使用前，用標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸標(biāo)定其滴定度。2、儀器：勻漿機(jī)、小錐形瓶、酸式滴定管、研缽、容量瓶、移液管、小離心管等。四、操作方法1、樣液的制備及滴定100g(x/8，x50；8)mL50mL2％草酸溶液定容搖勻。每次量取20mL－二氯酚靛酚鈉溶液進(jìn)行滴定呈現(xiàn)淡粉紅色，并在15－30秒內(nèi)不褪色，滴定過程必須迅速，不要超過2分鐘.平行試驗(yàn)進(jìn)行2次，記錄消耗2，6－二氯酚靛酚鈉溶液的用量。2、滴定滴定管裝入，滴定至提取液,另取10mL2%草酸按上法作空白對照試驗(yàn)，記錄消耗2，6－二氯酚靛酚鈉溶液的用量。五、結(jié)果計(jì)算M=[（V—VC×0