干擾素的工藝制備流程課件

基因工程藥物--干擾素的制備

1什么是干擾素概念(interferon,IFN)：機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個(gè)類型。1.1天然干擾素的分類

1.

根據(jù)來(lái)源、基因序列和氨基酸組成分類

◆

I型干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω

來(lái)源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)(較弱）

其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。

◆

II型干擾素：干擾素γ（IFN)

來(lái)源：活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生功能：免疫調(diào)節(jié)

不同來(lái)源的干擾素1.2重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ2基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝干擾素生產(chǎn)工藝路線上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:一、目的基因的分離與擴(kuò)增1.破碎細(xì)胞，用Trizol法提取總的RNA2.將生產(chǎn)干擾素的人白細(xì)胞的mRNA分級(jí)分離然后進(jìn)行凝膠電泳切取目的基因片段3.用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA4.以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物5.人工加尾形成“粘性末端”三、重組體引入宿主細(xì)胞

將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。五、分析保存

對(duì)基因工程大腸桿菌進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，并保存菌種。干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝1．菌種培養(yǎng)取－70℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)18±2小時(shí)后，進(jìn)行吸光值測(cè)定和發(fā)酵液雜菌檢查。2．種子罐培養(yǎng)將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3～4小時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時(shí)取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌

3.發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0。級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時(shí)。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)5～6.5小時(shí)。同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達(dá)9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細(xì)胞衰老。或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測(cè)。菌體于－20℃冰柜中保存時(shí)，不得超過12個(gè)月。每保存3個(gè)月，檢查一次活性。3.干擾素的分離純化工藝過程

3.1、干擾素分離工藝過程3.2、干擾素的純化工藝過程(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。破碎菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。(2)預(yù)處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。（4）初級(jí)分離

鹽析:硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。(2)沉淀與疏水層析

等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白

洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導(dǎo)值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。(3)無(wú)菌過濾分裝0.22μm濾膜過濾干擾素溶液分裝－20℃以下的冰箱中保存。半成品檢定（1）效價(jià)測(cè)定

用細(xì)胞病變抑制法，以Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定中必須用國(guó)家或國(guó)際參考品校準(zhǔn)為國(guó)際單位。（2）蛋白質(zhì)含量測(cè)定福林-酚法，以中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。（3）比活性效價(jià)的國(guó)際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。（4）純度電泳純度用非還原型SDS法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測(cè)定純度應(yīng)在95%以上。（5）相對(duì)分子量測(cè)定還原型SDS，加樣量不地域微克，同時(shí)用已知相對(duì)分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對(duì)照，以遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算相對(duì)分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。（6）殘余外源性DNA含量測(cè)定用放射性核素或生物素探針法測(cè)定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。（7）殘余血清IgG含量測(cè)定在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法時(shí)必須進(jìn)行此項(xiàng)檢定。（8）殘余抗生素活性測(cè)定半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。（9）紫外光譜掃描

檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在280±2納米。（10）肽圖測(cè)定用CNBr裂解法，測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。（11）等電點(diǎn)測(cè)定等電聚焦電泳。（12）除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn)。成品檢定（1）物理性狀凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。（2）鑒別試驗(yàn)應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定。（3）水分測(cè)定用卡氏法，應(yīng)低于3%。（4）無(wú)菌試驗(yàn)同半成品。（5）熱原質(zhì)試驗(yàn)同半成品檢定。

（6）干擾素效價(jià)測(cè)定同半成品檢定，效價(jià)不應(yīng)低于標(biāo)示量。（7）安全試驗(yàn)取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無(wú)紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。

取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注射劑量按人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動(dòng)物全部存活，說明成品合格。4國(guó)內(nèi)基因工程藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r

我國(guó)的生物技術(shù)藥物卻一直苦于缺