實(shí)驗(yàn)一 感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化課件

實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定的基本原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理感受態(tài)細(xì)胞(CompetentCells)：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，能允許外源DNA分子進(jìn)入。轉(zhuǎn)化(Transformation)：將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前常用的轉(zhuǎn)化方法為電轉(zhuǎn)化法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法簡(jiǎn)便易行，轉(zhuǎn)化效率高，但需要專門的電轉(zhuǎn)化儀；化學(xué)轉(zhuǎn)化不需要額外的設(shè)備，成本較低。致敏過程：用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作；細(xì)菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)短時(shí)間420C熱激處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物；復(fù)蘇：細(xì)菌在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時(shí)間，使抗性的表型表達(dá)后再轉(zhuǎn)到含抗性的選擇性培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出來的菌落即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌落；影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)(5x107個(gè)/mL)感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量試劑的質(zhì)量外源DNA的質(zhì)量與數(shù)量器皿的潔凈度污染—盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行三、器材與試劑1.材料大腸桿菌菌株Top10、重組質(zhì)粒。2.設(shè)備恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、低溫冰箱、恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)、微量移液槍、1.5mL離心管。3.試劑LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素母液(Ampicillin,Amp)、含Amp的LB固體培養(yǎng)基、0.1mol/LCaCl2滅菌溶液，IPTG,x-gal。

四、實(shí)驗(yàn)流程（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備：1.預(yù)培養(yǎng)：接一單菌落到3mLLB培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜；2.取0.4mL預(yù)培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含40mLLB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，370C、250rpm振蕩培養(yǎng)2.5～3小時(shí)（OD6000.4～0.5）；3.將菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，冰上放置10min；4.離心5000rpm，40C，5min；5.倒出培養(yǎng)液，將管倒置，使培養(yǎng)液流盡；6.菌體加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl21.0mL，輕吹并懸浮細(xì)胞，冰上10min；7.離心5000rpm，40C，5min，去上清；8.用冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2100μL用槍輕吹懸浮細(xì)胞，冰上操作；9.此為感受態(tài)細(xì)胞，若儲(chǔ)存則需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C凍存。（二）轉(zhuǎn)化及復(fù)蘇：1.取100μL感受態(tài)細(xì)胞，加入重組DNA20μL

（50ng)；

取100μL感受態(tài)細(xì)胞，加入20μL無菌水（陰性對(duì)照1）；取100μL感受態(tài)細(xì)胞,加入對(duì)照DNA20μL

（陰性對(duì)照2）

用槍頭混勻，冰上放置20min。陰性對(duì)照的目的？2.420C循環(huán)水浴熱激90秒3.冰浴2分鐘4.每管加800μLLB液體培養(yǎng)基，370C慢搖40min（120～140rpm）5.40C，5000rpm離心2min，棄去600μL，取