白細(xì)胞基因組DNA00

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血為DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是從有核的白細(xì)胞中提取DNA。因此，從外周血中提取DNA包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：第一，破壞紅細(xì)胞，通常利用紅細(xì)胞與白細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的差異，先使紅細(xì)胞裂解，經(jīng)離心后收集白細(xì)胞；第二，白細(xì)胞裂解：使膜蛋白和核蛋白變性，游離DNA，通常是采用離子型表面活性劑使蛋白質(zhì)變性；第三，除去變性蛋白質(zhì)：通常采用蛋白沉淀劑沉淀變性蛋白質(zhì)，使DNA留在上清液中；第四，在高鹽環(huán)境下使DNA從有機(jī)溶劑如無(wú)水乙醇中析出。取材取外周血5ml,EDTA抗凝1■新鮮抗凝血，離心棄去上清液；2?取出4°C冰箱預(yù)冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向細(xì)胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml細(xì)胞壓積加入6-10ml裂解液），輕輕吹打混勻；紅細(xì)胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加雙蒸水500ml,取450ml;Tris:1?0297克加雙蒸水50ml,再加上上面的450ml,共計(jì)500ml,高壓滅菌，用時(shí)加10-20ml3?3500rpm離心8分鐘，離心棄去上層紅色清液；4?收集沉淀部分，加入Hank's液或無(wú)血清培養(yǎng)液離心洗2-3次；5?如裂解不完全可重復(fù)步驟2和3；氯仿方法提取DNA在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。原則：（1）防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。一、 試劑準(zhǔn)備1xTE:10mMTris-HCI（pH7.8）;1mMEDTA（pH8.0）。20%SDS10mg/ml蛋白酶KTris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿無(wú)水乙醇、75%乙醇二、 操作步驟（一） 材料處理白細(xì)胞處理⑴取紅細(xì)胞裂解完全后收集的沉淀，加入0.5mlTE⑵將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。⑶加20%SDS25pl,蛋白酶K（10mg/ml）25pl,混勻。⑷60P水浴1-3hr。（二） DNA提取加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。離心120O0rpmx1Omin，取上層水相到另一1.5ml離心管中。加等體積飽和酚，混勻，離心12000rpmx10min，取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心12000rpmx10min,取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。加等體積氯仿，輕輕混勻，離心12000rpmx10min，取上層水相到另一管中。加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。待絮狀物出現(xiàn)后（若沒(méi)有絮狀物或絮狀物較少，可先將離心管置于-20度冰箱冷凍1h,絮狀物即可出現(xiàn)），離心12000rpmx5min，棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌，離心12000rpmx3min，棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加20-25pLTE溶解過(guò)夜。（DNA純化方法：DNA用等體積的酚氯仿抽提一次，重復(fù)一次，加入2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉后混勻，-20度沉淀30分鐘后，12000r/min離心10分鐘，棄上清。沉淀用75%乙醇洗滌一次，12000r/min離心5分鐘，棄上清。干燥后溶于TE）（三）DNA定量和電泳檢測(cè)1.DNA定量：DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50pg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用H2O稀釋DNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50xOD260讀數(shù)x稀釋倍數(shù)/1000oDNA純品的0D260/0D280為1.8,故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計(jì)DNA的純度。若比值較高說(shuō)明含有RNA,比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。0D230/0D260的比值應(yīng)在0.4-0?5之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。2?電泳檢測(cè)：取1pg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)DNA的完整性，或多個(gè)樣品的濃度是否相同。電泳結(jié)束后在點(diǎn)樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。三、注意事項(xiàng)所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實(shí)驗(yàn)（如Southern雜交、PCR等）目的。如要求更高，可參考有關(guān)資料進(jìn)行DNA純化?；蚪MDNA的檢測(cè)取3口1D耐樣品在債8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，檢測(cè)基因組DNA的完整性。稱取適量的瓊脂糖，加入到盛有100ml0,5xTBE的燒杯中，在微波爐上加熱至融化*室溫放置；當(dāng)溫度降為約60匸時(shí)將膠倒入膠托中，根據(jù)需要插入適當(dāng)寬度的梳子，制成適當(dāng)厚度的凝膠；待凝膠凝固后將梳子拔出，將凝膠放入電泳槽申'向槽中加入0.5xTBE電泳緩沖液，液面沒(méi)過(guò)點(diǎn)樣孔；將提取的基因組DNA樣品與上樣緩沖液按5:1的比例混合均勻，加入點(diǎn)樣孔,70V電壓電泳lh;電泳結(jié)束后將凝膠放入10mg/ml 溶液中，染色2如冷,紫外燈下觀察電泳結(jié)果.裂解燈細(xì)胞2.1按1:5的比例加入RBC裂斛液+混育均勻，揺勻，放賈10mip-3G00轉(zhuǎn)/分。［1｛熾初血滙量，就是上刻度管孫而的數(shù)值h3 裂轉(zhuǎn)液）］2.2在桌面上鋪一層紙巾，去#±ffi夜（倒入水池片高曲倒扣在紙巾上，1。付鐘*注蕙師止不同刼度管之間怕血澤苒熱2.3重良操作24,2-2^作一按*此時(shí)可見(jiàn)到血紅色基本消先.剩下白細(xì)咆彼此粘纏在一起.裂解白鈿胞3.I按］：1的比例加入WEC裂舸脈劇烈隠蕩（2-2得到的沉淀驛求応金溶歡川推蕩器〕.壞刖度溫育豈至譜瀕澄新不再有機(jī)淀■:（注JM按I：1^.JOI^AWBC裂解濮劇烈戒蕩.沉淀娶求宛錄帶帳”行?廈皚育衣釣3帥価）3.2奔慮躅至完企港解=繼址魁育3D修抑取一卜.用壬苗液滝嘴透明'沉淀蛋白質(zhì)［將覩琳好的瘩液至于4度冰箱預(yù)冷I0分鐘4.2按3：1的比例加APPS（醋蘆鉀緩沖扳）,A度離3600轉(zhuǎn)/分丫3D分鐘4.3如存少趙的蛋丹威還沒(méi)有沉淀下探，轉(zhuǎn)移到斷離心輸，車(chē)復(fù)離右一狀“捉IRONA（沉提蛋白質(zhì)后*沁上淸轉(zhuǎn)移到新的剰度離嗆管，編號(hào)和上面同樣才確保一一對(duì)應(yīng)J5.1按I：1ffJltjJl加入癢丙爵（血樣酢籾異丙靜），上下崩倒10-2015：,直到看見(jiàn)劉狀核醱沉淀5.2離心B￡0D轉(zhuǎn)/分丁10分鉀5.3在桌面鋪一層紙巾，去掉上稱液，離心管倒扣在紙巾上.機(jī)淀自然干燥5A在沉淀中加Ah00^170%乙職然斤將期巧穢液個(gè)部轉(zhuǎn)移劍I.5MLBP管中.蕓鍵是轉(zhuǎn)-移絮狀樓戰(zhàn)沆錠。55離心，8000^/^-3-5分鐘'此時(shí)換小搗心機(jī)*5$在桌悔鈾一懇紙申.去抻上淸液，離心諭倒孫在紙巾上丫沆淀自然干燥5.7加AI50-200uJTE幫觸.60度溫育30-G0汕鐘，4度過(guò)4匕bDNA測(cè)捉及分轉(zhuǎn)&1取已經(jīng)辭解好的基因組DN為溶液"5u]+35u]『取蒸水人福釋20筒,.記下測(cè)盪結(jié)果：濃度，純度利體忠6.2籬破量結(jié)島初作100.U1工作液筋SEF管標(biāo)簽處貼上跤帶?一卻度漲存“DNA提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理1?溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的卩-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基)；(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pHV3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6， 因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。解聚細(xì)胞中的核蛋白。SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-...R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。溶液III--3mol/LNaAc(pH4.8)溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/LNaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA?用無(wú)水乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇(因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15—30分鐘即可。在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1?0.25mol/L?在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。6?加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理？加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。7.為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH),可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí),大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定氯仿的作用主要是使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi)，異戊醇的作用是消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫。氯仿是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，抑制RNA酶的活性，除去蛋白質(zhì)污染。基因組DNA-CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨）,是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性.在高離子強(qiáng)度的溶液中（＞0.7mol/LNaCl）,CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸?通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái).注:CTAB溶液在低于15°C時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15C.基因組DNA-CTAB法CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；卩-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變,使酚容易去除基因組DNA-CTAB法CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除多酚，減少DNA中酚的污染;同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖.基因組DNA的提取核酸分離,純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取核酸分離，純化蛋白質(zhì)的去除:酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS,異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離,純化多糖的去除:高鹽法:用乙醇沉淀時(shí),在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖.用多糖水解酶將多糖降解.在提取緩沖液中加一定量的氯苯（1/2體積），氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖?用PEG8000代替乙醇沉淀DNA在500此DNA液中加入200卩120%PEG8000（含1.2MNaCl），冰浴20min.核酸分離，純化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑:&巰基乙醇，抗壞血酸，半胱氨酸，二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑:如PVP（聚乙烯吡咯酮）,PEG（聚乙二醇），它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除:70%的乙醇洗滌核酸吸附，沉淀和溶解使