皮膚科細胞培養(yǎng)及臨床應用-課件

細胞培養(yǎng)涉及的基本知識2022/12/31細胞培養(yǎng)涉及的基本知識2022/12/11最常見的兩種生長型細胞貼壁依賴性細胞(Anchorage-dependentcells)

貼附于不起化學作用的物質(玻璃、或塑料等無活性物質)的表面生長、生存和維持。懸浮培養(yǎng)細胞(Suspensionculture)

細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖。2022/12/32最常見的兩種生長型細胞貼壁依賴性細胞(Anchorage-d細胞培養(yǎng)中常用的幾個術語細胞系(Cellline)：

原代培養(yǎng)物經首次傳代成功后即成細胞系。連續(xù)傳代連續(xù)傳代

連續(xù)細胞系有限細胞系

(已建成的細胞系)

2022/12/33細胞培養(yǎng)中常用的幾個術語細胞系(Cellline)：202細胞株(Cellstrain):

由具有某些特性與標志的細胞選擇或克隆化而派生的亞系。細胞周期(Cellcycle)

細胞前一次分裂結束開始至本次分裂結束所經歷的時相過程。

4個時期：S期：DNA合成期

M期：有絲分裂期

G1期：有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期

G2期：DNA復制結束至有絲分裂開始的間隙期

G0期：某種原因導致細胞不再沿周期進行，進入休眠狀態(tài)2022/12/34細胞株(Cellstrain):2022/12/14細胞一代時間(Cellgenerationtime)

單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。群體倍增時間(Populationdoublingtime)

在對數生長期進行計算的細胞增加一倍所需要的時間。2022/12/35細胞一代時間(Cellgenerationtime)20克隆(Clone)

單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體，它們的遺傳特性相同。細胞融合(Cellfusion)

體外培養(yǎng)條件下，經化學試劑、病毒或物理方法誘發(fā)，使不同體細胞融合成雜交細胞(Hybrid)。細胞匯合(Confluence)

器皿中培養(yǎng)的細胞彼此匯合形成單層。2022/12/36克隆(Clone)2022/12/16原代培養(yǎng)(Primaryculture)

從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(Passage)(Subculture)

細胞從一個培養(yǎng)器皿轉移至另一個培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。再培養(yǎng)(Reculture)

單層細胞不經任何丟失而轉移到新鮮培養(yǎng)基中的過程。2022/12/37原代培養(yǎng)(Primaryculture)2022/12/1集落形成率(Platingefficiency)

細胞接種到培養(yǎng)器皿內所形成的集落的百分率。

單個細胞集落克隆形成率(Cloningefficiency)群體密度(Populationdensity)

培養(yǎng)器皿內，每單位面積或體積中的細胞數(細胞數/cm2)。飽和密度(Saturationdensity)

特定條件下，培養(yǎng)器皿中能達到的最高細胞數

(細胞數/cm2或細胞數/cm3)。2022/12/38集落形成率(Platingefficiency)2022/培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)(MEM)

無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基血清基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)完全培養(yǎng)基2022/12/39培養(yǎng)基培養(yǎng)基2022/12/19基本培養(yǎng)基的組分

四大類物質無機鹽氨基酸維生素碳水化合物

pH指示劑酚紅2022/12/310基本培養(yǎng)基的組分2022/12/110常用基本培養(yǎng)基

RPMI1640應用最廣泛

DMEM高糖型4500g/L葡萄糖，低糖型1000g/L葡萄糖

HamF12無血清培養(yǎng)基常用的基礎培養(yǎng)基

199……2022/12/311常用基本培養(yǎng)基2022/12/111培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)細胞的首選培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基根據細胞株特點、實驗需要選擇用生長曲線、集落形成率等指標選擇2022/12/312培養(yǎng)基的選擇2022/12/112培養(yǎng)基配制時的注意事項

嚴格按說明書要求添加必要成分

NaHCO3

谷氨酰胺

HEPES------

各成分順序溶解配制培養(yǎng)基用水、器皿滅菌分裝、保存

2022/12/313培養(yǎng)基配制時的注意事項2022/12/113培養(yǎng)基添加成分

NaHCO3

一般按說明書要求添加封閉式培養(yǎng)用5.6%或7.4%液調節(jié)谷氨酰胺易降解，使用前添加使用終濃度0.002mol/LHEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)

主要作用為防止培養(yǎng)基pH迅速變動使用終濃度0.01-0.015mol/L2022/12/314培養(yǎng)基添加成分2022/12/114完全培養(yǎng)基的添加成分牛血清

小牛血清：取自出生10～30天的小牛。新生牛血清：取自出生24小時之內的新生牛。胎牛血清：取自剖腹產的胎?；蛐呐K穿刺方法獲得。

2022/12/315完全培養(yǎng)基的添加成分牛血清202血清的主要作用

提供細胞生長所需的基本營養(yǎng)物質。

(激素、生長因子、結合蛋白)

提供貼壁和擴展因子(纖連蛋白,層粘連蛋白)。對培養(yǎng)中的細胞提供保護作用。

抗蛋白酶成分對細胞釋放的蛋白酶起中和作用終止貼壁細胞消化傳代中所用胰蛋白酶的作用血清蛋白的粘度保護懸浮培養(yǎng)攪拌時細胞所受的機械損傷2022/12/316血清的主要作用2022/12/116使用血清的缺點

改變細胞在體內的正常狀態(tài)促進某些細胞生長同時抑制另一類細胞生長。所含物質對細胞生長的影響或毒性作用批間成分的一致性支原體、病毒的潛在污染性2022/12/317使用血清的缺點2022/12/117血清質量的判斷

質量鑒定報告理化性質微生物檢測

促生長效果(培養(yǎng)細胞檢測)

克隆形成率、貼壁率測定連續(xù)傳代培養(yǎng)

外觀判斷

透明清亮土黃色或棕黃色無沉淀或及少量沉淀較粘稠2022/12/318血清質量的判斷2022/12/118血清的使用與貯存

滅活處理:56℃水浴,30分鐘(去除補體)

貯存條件:分裝

-20℃長期貯存,避免反復凍融

4℃,<1個月融化步驟:-20℃4℃室溫使用濃度:5%～20%,常用10%

臨用前添加于培養(yǎng)基中

2022/12/319血清的使用與貯存2022/12/119無血清培養(yǎng)基用途觀察生長因子對細胞的作用,需排除其它生長因子的干擾作用

測定細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力

大規(guī)模培養(yǎng)細胞，獲得分泌產物

2022/12/320無血清培養(yǎng)基用途2022/12/120無血清培養(yǎng)基的組成

基礎培養(yǎng)基

HamF12:DMEM=1:1

添加組分

促貼壁物質（細胞外基質，如纖連蛋白,層粘連蛋白）促生長因子及激素酶抑制劑（終止胰酶消化作用，保護細胞，如大豆胰酶抑制劑）

……2022/12/321無血清培養(yǎng)基的組成2022/12/121更換無血清培養(yǎng)基的注意事項針對性強直接適應連續(xù)適應逐步降低血清濃度

2022/12/322更換無血清培養(yǎng)基的注意事項2022/12/122無蛋白培養(yǎng)基(PFM)

不含動物蛋白的培養(yǎng)基，以添加植物水解物替代動物激素、生長因子。

用途

生物技術產品生產2022/12/323無蛋白培養(yǎng)基(PFM)

2022/12/123

限定化學成分培養(yǎng)基(CDM)

培養(yǎng)基中所有成分明確，不含動物蛋白，也不添加植物水解物，而使用一些已知結構與功能的小分子化合物(短肽、植物激素等)。用途

分析細胞分泌產物2022/12/324限定化學成分培養(yǎng)基(CDM)2022/12/124

細胞培養(yǎng)中的其它用液平衡鹽溶液

PBSHank’s液

D-Hank’s液

------2022/12/325細胞培養(yǎng)中的其它用液2022/1消化液

胰酶溶液(0.1～0.25%)D-Hank’s液配制最佳pH值：8～9

EDTA溶液(0.02%)

用于解離細胞(破壞細胞間的連接)

與胰酶混合用于消化貼壁牢的細胞

膠原酶溶液(0.1～0.3mg/L)

不易損傷細胞，不受Ca2+

、Mg2+及血清抑制2022/12/326消化液2022/12/126細胞培養(yǎng)的生長測定血細胞計數法

細胞密度(個/ml)=平均細胞數×104×稀釋倍數

影響方法精確性的因素

貼壁細胞消化的時間細胞懸液的均勻性細胞濃度合適2022/12/327細胞培養(yǎng)的生長測定血細胞計數法2022/12/127臺盼藍染色法

正常細胞不染色，死亡細胞呈藍色。

細胞活力(%)=(總細胞數-著色細胞數)÷總細胞數×100%

注意為一種粗略的檢測存活細胞的方法，不能準確放映細胞活力差異。判斷時間2022/12/328臺盼藍染色法2022/12/128MTT比色法

活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮唑鹽(MTT)，還原成紫色不溶性結晶物，沉積于細胞中。用酸性異丙醇或DMSO溶解后，于酶標儀上測定光吸收值。紫色不溶性結晶物形成的多少與活細胞數目和功能狀態(tài)相關。

細胞存活率=試驗組光吸收值÷對照組光吸收值×100%

MTT法特點高濃度血清的影響簡便迅速。不接觸同位素，敏感性與同位素法接近。

2022/12/329MTT比色法2022/12/129細胞生長曲線法

可觀察同一代細胞的增殖過程。根據生長曲線分析細胞增殖速度，確定具體實驗﹑細胞傳代的最佳時間。

方法總培養(yǎng)時間7天計數每24小時細胞數目繪制細胞生長曲線

潛伏期原代細胞24-96h

傳代細胞6-24h

對數生長期

3-5d

倍增時間

停滯期

2022/12/330細胞生長曲線法2022/12/1303H-TdR摻入法

3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到細胞新合成的DNA中，通過測定3H放射性脈沖數，計算細胞的增殖活性。

特點被標記的細胞為S期細胞，3H-TdR摻入量放映DNA合成的快慢。放射性損害。需要特殊實驗室和特殊設備。2022/12/3313H-TdR摻入法2022/12/131細胞培養(yǎng)中的傳代換液問題原代培養(yǎng)后的第一次傳代原代培養(yǎng)方法細胞活性細胞類型和特點接種密度培養(yǎng)條件常規(guī)傳代傳代時間對數生長期傳代比例原瓶細胞分于2-4瓶貼壁細胞酶充分消化2022/12/332細胞培養(yǎng)中的傳代換液問題原代培養(yǎng)后的第一次傳代2022/12二.角質形成細胞培養(yǎng)問題2022/12/333二.角質形成細胞培養(yǎng)問題2022/12/133

角質形成細胞培養(yǎng)方法

組織塊培養(yǎng)法

3T3細胞為滋養(yǎng)層培養(yǎng)法膠原為滋養(yǎng)層培養(yǎng)法氣—液交界面培養(yǎng)法無血清培養(yǎng)法2022/12/334角質形成細胞培養(yǎng)方法2022/12/134組織塊培養(yǎng)法

將表皮塊貼附在培養(yǎng)瓶壁上,角質形成細胞逐漸從組織塊邊緣爬行長出。特點

穩(wěn)定可靠獲得的細胞數量有限細胞生長周期長成纖維細胞污染2022/12/335組織塊培養(yǎng)法2022/12/1353T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法

3T3細胞經絲裂霉素C或γ-射線預處理(失去分裂增殖功能)后,低密度接種在培養(yǎng)瓶壁上,再將角質形成細胞種植在此細胞滋養(yǎng)層上。

3T3細胞

小鼠胚胎瘤成纖維細胞株滋養(yǎng)層作用促使角質形成細胞的貼附和生長,并形成集落,最后融合成復層鱗狀上皮接觸性抑制成纖維細胞生長

2022/12/3363T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法2022/12/1363T3細胞促進角質形成細胞粘附和生長的途徑:

產生基質成分,促進角質形成細胞貼壁。分泌促進角質形成細胞有絲分裂的活性因子。通過細胞間相互作用,調節(jié)與角質形成細胞增殖相關的生物因子。

2022/12/3373T3細胞促進角質形成細胞粘附和生長的途徑:2022/12/3T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法特點

細胞接種密度低、增殖速度快且細胞生長穩(wěn)定。

3T3細胞逐漸被擠壓,隨著角質形成細胞集落不斷擴大形成冠狀,然后被壓縮成條索狀,最后脫落且消失。

3T3細胞培養(yǎng)過程中會分泌異種蛋白和抗原,用它作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人角質形成細胞或人工表皮,移植后可能引起異種排斥反應。培養(yǎng)過程中角質形成細胞角化明顯。

改進法：向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子、能增加細胞內

cAMP水平的試劑（霍亂毒素等）。2022/12/3383T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法特點2022/12/138膠原滋養(yǎng)層培養(yǎng)法

角質形成細胞的貼壁率玻璃培養(yǎng)瓶2.8%～7%,

塑料培養(yǎng)瓶14%

預鋪膠原的塑料培養(yǎng)瓶70%～80%2022/12/339膠原滋養(yǎng)層培養(yǎng)法2022/12/139膠原促進角質形成細胞粘附、生長的機制細胞外基質的主要成分,促進細胞貼壁。覆蓋培養(yǎng)瓶壁上不利于角質形成細胞粘附、生長的化學基團。為角質形成細胞提供粘附所需的特異性化學基團。為角質形成細胞的生長提供必要營養(yǎng)。2022/12/340膠原促進角質形成細胞粘附、生長的機制2022/12/140氣—液界面培養(yǎng)法

使表皮細胞在更接近正常人體的生理狀態(tài)下生長和分化。培養(yǎng)皿內加上一層鋪墊,再將皮膚角質形成細胞接種其上,加入的培養(yǎng)液不超過鋪墊水平,細胞通過鋪墊吸收營養(yǎng)維持其生長發(fā)育。(接種在鋪墊上的細胞先進行浸泡性培養(yǎng)，一定時間后鋪墊支架升到氣-液界面繼續(xù)培養(yǎng)，使角質形成細胞完成終末分化。)

2022/12/341氣—液界面培養(yǎng)法2022/12/141

鋪墊動物或人的尸體的皮膚真皮玻璃纖維片膠原膜或尼龍網膠原膜和尼龍網的貼合物。

Transwell培養(yǎng)皿特點

能培養(yǎng)出多層類似正常皮膚的細胞層次，與正常皮膚非常接近。2022/12/342鋪墊動物或人的尸體的皮膚真皮2022/1無血清培養(yǎng)法

含血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法特點

必須在培養(yǎng)液中加入一定比例的血清以利于細胞生長,但所含因素變化大,不明因素多,成份復雜。影響角質形成細胞生理和病理生理等的精細研究(對表皮細胞的生長調節(jié)機制,培養(yǎng)表皮細胞因子的釋放,特殊抗原和受體的表達研究等)。

2022/12/343無血清培養(yǎng)法2022/12/143

無血清培養(yǎng)法特點

技術要求較高。培養(yǎng)基中需添加牛腦垂體提取物(WBPE)或豬腦垂體提取物(PWPE)。排除了復雜的血清成分對人角質形成細胞的不利因素影響。為角質形成細胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢。2022/12/344無血清培養(yǎng)法特點2022/12/144MCDB153無血清培養(yǎng)基角質形成細胞培養(yǎng)基。適用于低密度接種的傳代表皮細胞的生長,但原代培養(yǎng)時細胞克隆形成率較低,不能滿足較高密度細胞生長的需要。細胞以單層方式向外生長,但細胞之間缺乏橋粒連接,不能形成表皮皮片。培養(yǎng)液中的牛腦垂體提取物或豬腦垂體提取物價格昂貴，瘋牛病的危險。2022/12/345MCDB153無血清培養(yǎng)基2022/12/145角質形成細胞無血清培養(yǎng)基(DKSFM,Gibco

)

去除牛腦垂體提取物。保留對角質形成細胞的促生長作用,同時抑制成纖維細胞生長。角質形成細胞貼壁快,增殖迅速,細胞長滿單層后,呈現出典型的鋪路石狀,細胞呈多角形。細胞免疫組化染色抗角蛋白抗體染色陽性。整個培養(yǎng)周期中,角質細胞呈現出基底細胞形狀,細胞表面沒有分泌物。操作簡便易行,安全適用,避免了以膠原或3T3細胞為滋養(yǎng)層法的缺點。2022/12/346角質形成細胞無血清培養(yǎng)基(DKSFM,Gibco)2022影響角質形成細胞培養(yǎng)的因素皮膚標本的來源

正常人外科包皮環(huán)切手術棄之皮膚標本運輸和保存

無菌容器

短時間存放于平衡鹽溶液,長時間存放于營養(yǎng)液中。標本預處理

清洗、去除組織、剪切2022/12/347影響角質形成細胞培養(yǎng)的因素2022/12/147表皮和真皮的分離

胰蛋白酶

分離基底細胞和上面的細胞。既破壞橋粒又破壞半橋粒結構。消化時間過長,丟失部分基底細胞。消化時間過短,表皮和真皮分離不完全,混有成纖維細胞。2022/12/348表皮和真皮的分離2022/12/148中性蛋白酶

主要分解IV型膠原和纖維粘連蛋白。作用于表皮和真皮的結合處。只破壞半橋粒結構。獲得的角質形成細胞活力較高,增殖迅速,融合成片的速度快。減少成纖維細胞污染。可獲得含有完整基底層細胞的表皮。

Dispase(GIBCO)

中性蛋白酶分離表皮和真皮,再用胰蛋白酶消化表皮成為單個的細胞。2022/12/349中性蛋白酶2022/12/149培養(yǎng)液中主要的添加物

胰島素氫化可的松三碘甲狀腺原氨酸霍亂毒素轉鐵蛋白表皮生長因子

……2022/12/350培養(yǎng)液中主要的添加物2022/12/150主要添加物的作用促進細胞的葡萄糖和氨基酸的吸收。促進細胞的粘附和增殖。促進細胞的合成代謝。提高細胞內第二信使cAMP水平。降低鐵離子對細胞的毒性。促進角質形成細胞的有絲分裂。2022/12/351主要添加物的作用2022/12/151鈣離子濃度

與表皮細胞體外培養(yǎng)的多層化有關,鈣離子濃度低至一定濃度時,細胞的分層現象消失。低鈣(0.05～0.15mM)時角質形成細胞不分化,

細胞增殖最佳;當鈣離子濃度上升到1.0mM時,

角質形成細胞發(fā)生分化,顯示生長。2022/12/352鈣離子濃度2022/12/152角質形成細胞株(系)應用

COLO-16株

來自于鱗狀上皮癌的人角質形成細胞。

HaCaT株

永生化的正常人皮膚角質形成細胞(>140

代)。2022/12/353角質形成細胞株(系)應用2022/12/153三.細胞培養(yǎng)技術在皮膚病相關領域中的應用

2022/12/354三.細胞培養(yǎng)技術在皮膚病相關領域中的應用

2022/12/

微載體培養(yǎng)細胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長,通過輕輕攪拌使細胞維持懸浮狀態(tài)。

特點不增加培養(yǎng)容器表面積或培養(yǎng)基容積的前提下提高培養(yǎng)表面積。

省卻了容器等的清洗和準備工作。細胞與培養(yǎng)液的分離簡單。減少繁復的操作步驟,降低污染率。提高產率。

微載體制作材料的進展

葡聚糖纖維素

聚乙烯和二氧化硅,聚苯乙烯明膠2022/12/355微載體在化妝品功效研究中的應用

傳統(tǒng)皮膚細胞培養(yǎng)方法的應用

單層ＫＣ的培養(yǎng)技術---皮膚組織獲取和化妝品研發(fā)

培養(yǎng)黑素細胞---美白化妝品活性成分篩選朗格罕細胞、ＫＣ和Ｔ淋巴細胞共同培養(yǎng)

---體外篩選化妝品過敏作用

富含Merkel細胞的表皮細胞懸液培養(yǎng)

---局部應用藥物的耐受機制研究2022/12/356在化妝品功效研究中的應用

傳統(tǒng)皮膚細胞培養(yǎng)方法的應用2022成纖維細胞的培養(yǎng)

---抗衰老化妝品活性成分開發(fā)中應用(篩選中草藥有效成分的抗衰老活性)---化妝品生理功效研究中應用

2022/12/357成纖維細胞的培養(yǎng)2022/12/157皮膚細胞的“三維培養(yǎng)”

器官型培養(yǎng)(氣-液體交界面ＫＣ培養(yǎng))

分離、培養(yǎng)皮膚的ＫＣ,使其在體外擴增,然后將其接種于真皮類似物上,暴露于空氣中,使表皮正常分化,形成類似天然表皮的復層組織(體外重建表皮)。真皮類似物去表皮真皮膠原基質惰性材料

應用

真皮類似物和重建表皮的組合形成具有表皮和真皮的簡化的人皮膚。用成纖維細胞研究從表皮透過的化妝品活性物質的生物學效應,了解表、真皮之間的相互作用。將其他細胞(內皮細胞、白細胞)引入真皮類似層,擴大測試系統(tǒng)的使用范圍。2022/12/358皮膚細胞的“三維培養(yǎng)”2022/12/158皮膚器官培養(yǎng)

活體皮膚于體外培養(yǎng)，并使其保持其一定的結構和功能。

培養(yǎng)方法

液體浸沒的皮膚器官培養(yǎng)氣-液面交界的皮膚器官培養(yǎng)

應用化妝品對皮膚急性刺激毒性研究2022/12/359皮膚器官培養(yǎng)2022/12/159

在化妝品研發(fā)中的應用

延緩皮膚衰老化妝品

以皮膚ＫＣ和成纖維細胞為受試對象,尋找或篩選具有抗衰老活性物質,確定該物質基本毒性情況。(觀察對兩種細胞增殖能力及活性的影響)

研究外界因素對皮膚的藥理學或毒理學作用。

(如ＵＶ、藥物及化妝品等)

將損傷作用作為模型進行化妝品的干預研究

2022/12/360在化妝品研發(fā)中的應用皮膚美白產品

將活的黑色素細胞引入重建真皮類似環(huán)境，作為體外皮膚美白劑的初篩模型。光生物學研究,如防曬劑的效果評價。

2022/12/361皮膚美白產品2022/12/161化妝品配方及成品的毒理學研究

單層皮膚細胞培養(yǎng)外來化學物的代謝及最初的刺激和過敏反應。

皮膚三維培養(yǎng)化妝品的細胞毒性、有效性研究及局部應用化合物(藥用化妝品、表面活性劑、滲透劑和殺菌劑等)效果評價。

2022/12/362化妝品配方及成品的毒理學研究2022/12/162毛發(fā)用化妝品

以毛根鞘上皮細胞為對象,進行護發(fā)活性物質的篩選以及毛發(fā)用化妝品毒性測試研究。2022/12/363毛發(fā)用化妝品2022/12/163基礎研究

皮膚三維培養(yǎng)(重建表皮、真皮類似物)---化妝品和洗護發(fā)產品對人體皮膚的刺激性研究

---重建表皮可用于研究表皮終末分化以及研究表皮細胞分化調節(jié)物、表皮對刺激反應機制；化妝品經皮吸收和化妝品對屏障功能的保護作用

---真皮類似物用來研究真皮層的組成及生理功能

---重建表皮+真皮類似物共培養(yǎng)系統(tǒng)用來研究皮膚生理代謝、化合物的光毒性、ＵＶ效應和防曬劑的作用2022/12/364基礎研究2022/12/164體外細胞培養(yǎng)模型

角質形成細胞黑色素細胞朗罕氏細胞成纖維細胞皮脂細胞2022/12/365體外細胞培養(yǎng)模型2022/12/165細胞培養(yǎng)評估方法及指標

評估目的細胞模型評估指標

毒性2,3-Ｄ細胞培養(yǎng)細胞形態(tài),細胞活性

(中性紅MTT,LDH,PEG2)

美白黑素細胞培養(yǎng)黑素的生成黑素細胞和酪氨到酶活性角朊細胞共培養(yǎng)

3-Ｄ細胞培養(yǎng)抗衰老成纖維細胞培養(yǎng)細胞增殖,膠原蛋白,

角朊細胞培養(yǎng)彈性蛋白,3-Ｄ細胞培養(yǎng)粘多糖等的生成2022/12/366細胞培養(yǎng)評估方法及指標2022/12/166在基因工程藥物血藥

濃度測定中的應用

特定依賴細胞株培養(yǎng)法

以藥物對特定依賴細胞的增殖或抑制、細胞數目的增減為量效指標。細胞增殖法:促進特定依賴細胞株增殖,

抑制增殖法:抑制細胞增殖

2022/12/367在基因工程藥物血藥

濃度測定中的應用特定依賴細胞株培養(yǎng)法2細胞培養(yǎng)量效指標的測定方法

[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法(3H-TdR)59Fe核素標記法四氮唑鹽法(MTT)

直接計數法其他間接法2022/12/368細胞培養(yǎng)量效指標的測定方法2022/12/168細胞毒性的觀察方法

放射性同位素攝入法

3H-胸腺嘧啶--

3H-亮氨酸--培養(yǎng)基中摻入3H-亮氨酸，根據3H-亮氨酸在細胞內含量測定細胞內蛋白質合成情況。

同位素法特點揭示細胞分子水平的動態(tài)變化,是研究細胞代謝狀態(tài)的重要手段。放射性損害。需要特殊實驗室和特殊設備。

四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)

2022/12/369細胞毒性的觀察方法2022/12/169

熒光染色法

乙酰乙酸熒光素法

當細胞受到損傷時,細胞膜的選擇通透性屏障作用消失,利用乙酰乙酸熒光素和溴化乙錠快速進出細胞膜受損的細胞特點。在熒光顯微鏡下迅速區(qū)分受損細胞。2022/12/370熒光染色法2022/12/170

發(fā)光細胞活力測試

采用一種獨特的、穩(wěn)定性熒光素酶來檢測有活力細胞。熒光素酶利用熒光素、氧和ATP作為反應底物，產生氧化熒光素，并以光的形式釋放能量。由于熒光素酶反應需要ATP，因而反應產生光的總量和反映有活力細胞數的ATP總量呈正比。產生的發(fā)光信號和培養(yǎng)基中的有活力細胞數呈正比。

特點適用于高通量應用，測試大批量樣品可快速得到結果。需要特殊的發(fā)光儀或CCD相機讀取發(fā)光信號。

2022/12/371發(fā)光細胞活力測試2022/12/171流式細胞光度術(FCM法)

利用鞘流原理,使被熒光標記的單個懸浮細胞排成單列,按重力方向流動。細胞被激光照射后發(fā)射熒光,檢測器可逐個對細胞的熒光強度進行測定。

特點對細胞測定能力為30-60萬個細胞/分鐘,同時可對細胞的核酸,蛋白質酶、細胞周期分布等八種參數進行測定。2022/12/372流式細胞光度術(FCM法)2022/12/172在藥物開發(fā)中的應用藥物篩選模型整體動物水平組織器官水平細胞分子水平細胞分子水平藥物篩選模型細胞系的生物學特征較為一致，用于觀察藥物對細胞形態(tài)及生理特征的影響，判斷藥物療效及其毒性。材料用量少，藥物作用機制較明確，實現大規(guī)模篩選，縮短新藥篩選周期。2022/12/373在藥物開發(fā)中的應用藥物篩選模型2022/12/173

模型優(yōu)勢

大樣本量的篩選(擴大篩選對象和范圍)。一藥多篩(樣品量少，珍貴藥物多模型篩選，擴大新藥范圍)。高通量藥物篩選(HTS)

計算機控制的自動化大規(guī)模篩選體系。利用細胞培養(yǎng)制出的新藥

基因工程藥物細胞工程藥物2022/12/374模型優(yōu)勢2022/12/174細胞培養(yǎng)中的藥物試驗問題細胞的選擇敏感株原代細胞性別系(株)

藥物的溶解和保存溶劑的選擇藥物劑量半效劑量(ID50)

選擇合適指標粗略估算法借用藥物LD50精確計算藥物作用時間接種后約第48小時(指數生長期)

時-效曲線

2022/12/375細胞培養(yǎng)中的藥物試驗問題2022/12/175思考題

1.應用細胞培養(yǎng)技術進行實驗研究中細胞生長、活力及細胞毒的測定方法

2.角質形成細胞體外生長特點2022/12/376思考題2022/12/176

謝謝！2022/12/377謝謝！2022/12/177謝謝！78謝謝！787979細胞培養(yǎng)涉及的基本知識2022/12/380細胞培養(yǎng)涉及的基本知識2022/12/11最常見的兩種生長型細胞貼壁依賴性細胞(Anchorage-dependentcells)

貼附于不起化學作用的物質(玻璃、或塑料等無活性物質)的表面生長、生存和維持。懸浮培養(yǎng)細胞(Suspensionculture)

細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖。2022/12/381最常見的兩種生長型細胞貼壁依賴性細胞(Anchorage-d細胞培養(yǎng)中常用的幾個術語細胞系(Cellline)：

原代培養(yǎng)物經首次傳代成功后即成細胞系。連續(xù)傳代連續(xù)傳代

連續(xù)細胞系有限細胞系

(已建成的細胞系)

2022/12/382細胞培養(yǎng)中常用的幾個術語細胞系(Cellline)：202細胞株(Cellstrain):

由具有某些特性與標志的細胞選擇或克隆化而派生的亞系。細胞周期(Cellcycle)

細胞前一次分裂結束開始至本次分裂結束所經歷的時相過程。

4個時期：S期：DNA合成期

M期：有絲分裂期

G1期：有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期

G2期：DNA復制結束至有絲分裂開始的間隙期

G0期：某種原因導致細胞不再沿周期進行，進入休眠狀態(tài)2022/12/383細胞株(Cellstrain):2022/12/14細胞一代時間(Cellgenerationtime)

單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。群體倍增時間(Populationdoublingtime)

在對數生長期進行計算的細胞增加一倍所需要的時間。2022/12/384細胞一代時間(Cellgenerationtime)20克隆(Clone)

單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體，它們的遺傳特性相同。細胞融合(Cellfusion)

體外培養(yǎng)條件下，經化學試劑、病毒或物理方法誘發(fā)，使不同體細胞融合成雜交細胞(Hybrid)。細胞匯合(Confluence)

器皿中培養(yǎng)的細胞彼此匯合形成單層。2022/12/385克隆(Clone)2022/12/16原代培養(yǎng)(Primaryculture)

從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(Passage)(Subculture)

細胞從一個培養(yǎng)器皿轉移至另一個培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。再培養(yǎng)(Reculture)

單層細胞不經任何丟失而轉移到新鮮培養(yǎng)基中的過程。2022/12/386原代培養(yǎng)(Primaryculture)2022/12/1集落形成率(Platingefficiency)

細胞接種到培養(yǎng)器皿內所形成的集落的百分率。

單個細胞集落克隆形成率(Cloningefficiency)群體密度(Populationdensity)

培養(yǎng)器皿內，每單位面積或體積中的細胞數(細胞數/cm2)。飽和密度(Saturationdensity)

特定條件下，培養(yǎng)器皿中能達到的最高細胞數

(細胞數/cm2或細胞數/cm3)。2022/12/387集落形成率(Platingefficiency)2022/培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)(MEM)

無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基血清基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)完全培養(yǎng)基2022/12/388培養(yǎng)基培養(yǎng)基2022/12/19基本培養(yǎng)基的組分

四大類物質無機鹽氨基酸維生素碳水化合物

pH指示劑酚紅2022/12/389基本培養(yǎng)基的組分2022/12/110常用基本培養(yǎng)基

RPMI1640應用最廣泛

DMEM高糖型4500g/L葡萄糖，低糖型1000g/L葡萄糖

HamF12無血清培養(yǎng)基常用的基礎培養(yǎng)基

199……2022/12/390常用基本培養(yǎng)基2022/12/111培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)細胞的首選培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基根據細胞株特點、實驗需要選擇用生長曲線、集落形成率等指標選擇2022/12/391培養(yǎng)基的選擇2022/12/112培養(yǎng)基配制時的注意事項

嚴格按說明書要求添加必要成分

NaHCO3

谷氨酰胺

HEPES------

各成分順序溶解配制培養(yǎng)基用水、器皿滅菌分裝、保存

2022/12/392培養(yǎng)基配制時的注意事項2022/12/113培養(yǎng)基添加成分

NaHCO3

一般按說明書要求添加封閉式培養(yǎng)用5.6%或7.4%液調節(jié)谷氨酰胺易降解，使用前添加使用終濃度0.002mol/LHEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)

主要作用為防止培養(yǎng)基pH迅速變動使用終濃度0.01-0.015mol/L2022/12/393培養(yǎng)基添加成分2022/12/114完全培養(yǎng)基的添加成分牛血清

小牛血清：取自出生10～30天的小牛。新生牛血清：取自出生24小時之內的新生牛。胎牛血清：取自剖腹產的胎?；蛐呐K穿刺方法獲得。

2022/12/394完全培養(yǎng)基的添加成分牛血清202血清的主要作用

提供細胞生長所需的基本營養(yǎng)物質。

(激素、生長因子、結合蛋白)

提供貼壁和擴展因子(纖連蛋白,層粘連蛋白)。對培養(yǎng)中的細胞提供保護作用。

抗蛋白酶成分對細胞釋放的蛋白酶起中和作用終止貼壁細胞消化傳代中所用胰蛋白酶的作用血清蛋白的粘度保護懸浮培養(yǎng)攪拌時細胞所受的機械損傷2022/12/395血清的主要作用2022/12/116使用血清的缺點

改變細胞在體內的正常狀態(tài)促進某些細胞生長同時抑制另一類細胞生長。所含物質對細胞生長的影響或毒性作用批間成分的一致性支原體、病毒的潛在污染性2022/12/396使用血清的缺點2022/12/117血清質量的判斷

質量鑒定報告理化性質微生物檢測

促生長效果(培養(yǎng)細胞檢測)

克隆形成率、貼壁率測定連續(xù)傳代培養(yǎng)

外觀判斷

透明清亮土黃色或棕黃色無沉淀或及少量沉淀較粘稠2022/12/397血清質量的判斷2022/12/118血清的使用與貯存

滅活處理:56℃水浴,30分鐘(去除補體)

貯存條件:分裝

-20℃長期貯存,避免反復凍融

4℃,<1個月融化步驟:-20℃4℃室溫使用濃度:5%～20%,常用10%

臨用前添加于培養(yǎng)基中

2022/12/398血清的使用與貯存2022/12/119無血清培養(yǎng)基用途觀察生長因子對細胞的作用,需排除其它生長因子的干擾作用

測定細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力

大規(guī)模培養(yǎng)細胞，獲得分泌產物

2022/12/399無血清培養(yǎng)基用途2022/12/120無血清培養(yǎng)基的組成

基礎培養(yǎng)基

HamF12:DMEM=1:1

添加組分

促貼壁物質（細胞外基質，如纖連蛋白,層粘連蛋白）促生長因子及激素酶抑制劑（終止胰酶消化作用，保護細胞，如大豆胰酶抑制劑）

……2022/12/3100無血清培養(yǎng)基的組成2022/12/121更換無血清培養(yǎng)基的注意事項針對性強直接適應連續(xù)適應逐步降低血清濃度

2022/12/3101更換無血清培養(yǎng)基的注意事項2022/12/122無蛋白培養(yǎng)基(PFM)

不含動物蛋白的培養(yǎng)基，以添加植物水解物替代動物激素、生長因子。

用途

生物技術產品生產2022/12/3102無蛋白培養(yǎng)基(PFM)

2022/12/123

限定化學成分培養(yǎng)基(CDM)

培養(yǎng)基中所有成分明確，不含動物蛋白，也不添加植物水解物，而使用一些已知結構與功能的小分子化合物(短肽、植物激素等)。用途

分析細胞分泌產物2022/12/3103限定化學成分培養(yǎng)基(CDM)2022/12/124

細胞培養(yǎng)中的其它用液平衡鹽溶液

PBSHank’s液

D-Hank’s液

------2022/12/3104細胞培養(yǎng)中的其它用液2022/1消化液

胰酶溶液(0.1～0.25%)D-Hank’s液配制最佳pH值：8～9

EDTA溶液(0.02%)

用于解離細胞(破壞細胞間的連接)

與胰酶混合用于消化貼壁牢的細胞

膠原酶溶液(0.1～0.3mg/L)

不易損傷細胞，不受Ca2+

、Mg2+及血清抑制2022/12/3105消化液2022/12/126細胞培養(yǎng)的生長測定血細胞計數法

細胞密度(個/ml)=平均細胞數×104×稀釋倍數

影響方法精確性的因素

貼壁細胞消化的時間細胞懸液的均勻性細胞濃度合適2022/12/3106細胞培養(yǎng)的生長測定血細胞計數法2022/12/127臺盼藍染色法

正常細胞不染色，死亡細胞呈藍色。

細胞活力(%)=(總細胞數-著色細胞數)÷總細胞數×100%

注意為一種粗略的檢測存活細胞的方法，不能準確放映細胞活力差異。判斷時間2022/12/3107臺盼藍染色法2022/12/128MTT比色法

活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮唑鹽(MTT)，還原成紫色不溶性結晶物，沉積于細胞中。用酸性異丙醇或DMSO溶解后，于酶標儀上測定光吸收值。紫色不溶性結晶物形成的多少與活細胞數目和功能狀態(tài)相關。

細胞存活率=試驗組光吸收值÷對照組光吸收值×100%

MTT法特點高濃度血清的影響簡便迅速。不接觸同位素，敏感性與同位素法接近。

2022/12/3108MTT比色法2022/12/129細胞生長曲線法

可觀察同一代細胞的增殖過程。根據生長曲線分析細胞增殖速度，確定具體實驗﹑細胞傳代的最佳時間。

方法總培養(yǎng)時間7天計數每24小時細胞數目繪制細胞生長曲線

潛伏期原代細胞24-96h

傳代細胞6-24h

對數生長期

3-5d

倍增時間

停滯期

2022/12/3109細胞生長曲線法2022/12/1303H-TdR摻入法

3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到細胞新合成的DNA中，通過測定3H放射性脈沖數，計算細胞的增殖活性。

特點被標記的細胞為S期細胞，3H-TdR摻入量放映DNA合成的快慢。放射性損害。需要特殊實驗室和特殊設備。2022/12/31103H-TdR摻入法2022/12/131細胞培養(yǎng)中的傳代換液問題原代培養(yǎng)后的第一次傳代原代培養(yǎng)方法細胞活性細胞類型和特點接種密度培養(yǎng)條件常規(guī)傳代傳代時間對數生長期傳代比例原瓶細胞分于2-4瓶貼壁細胞酶充分消化2022/12/3111細胞培養(yǎng)中的傳代換液問題原代培養(yǎng)后的第一次傳代2022/12二.角質形成細胞培養(yǎng)問題2022/12/3112二.角質形成細胞培養(yǎng)問題2022/12/133

角質形成細胞培養(yǎng)方法

組織塊培養(yǎng)法

3T3細胞為滋養(yǎng)層培養(yǎng)法膠原為滋養(yǎng)層培養(yǎng)法氣—液交界面培養(yǎng)法無血清培養(yǎng)法2022/12/3113角質形成細胞培養(yǎng)方法2022/12/134組織塊培養(yǎng)法

將表皮塊貼附在培養(yǎng)瓶壁上,角質形成細胞逐漸從組織塊邊緣爬行長出。特點

穩(wěn)定可靠獲得的細胞數量有限細胞生長周期長成纖維細胞污染2022/12/3114組織塊培養(yǎng)法2022/12/1353T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法

3T3細胞經絲裂霉素C或γ-射線預處理(失去分裂增殖功能)后,低密度接種在培養(yǎng)瓶壁上,再將角質形成細胞種植在此細胞滋養(yǎng)層上。

3T3細胞

小鼠胚胎瘤成纖維細胞株滋養(yǎng)層作用促使角質形成細胞的貼附和生長,并形成集落,最后融合成復層鱗狀上皮接觸性抑制成纖維細胞生長

2022/12/31153T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法2022/12/1363T3細胞促進角質形成細胞粘附和生長的途徑:

產生基質成分,促進角質形成細胞貼壁。分泌促進角質形成細胞有絲分裂的活性因子。通過細胞間相互作用,調節(jié)與角質形成細胞增殖相關的生物因子。

2022/12/31163T3細胞促進角質形成細胞粘附和生長的途徑:2022/12/3T3細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法特點

細胞接種密度低、增殖速度快且細胞生長穩(wěn)定。

3T3細胞逐漸被擠壓,隨著角質形成細胞集落不斷擴大形成冠狀,然后被壓縮成條索狀,最后脫落且消失。

3T3細胞培養(yǎng)過程中會分泌異種蛋白和抗原,用它作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人角質形成細胞或人工表皮,移植后可能引起異種排斥反應。培養(yǎng)過程中角質形成細胞角化明顯。

改進法：向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子、能增加細