現(xiàn)代基因工程-05怎樣獲得特定基因的克隆課件

基因工程

第五講：怎樣獲得特定基因的克隆HowtoObtainaCloneofaSpecificGene

基因克隆實(shí)驗(yàn)中，成敗的關(guān)鍵往往取決于能否設(shè)計(jì)出一個(gè)合適的方案，將目的基因直接或間接地從其他重組體中挑選出來(lái)。一旦解決了這個(gè)問(wèn)題，獲得了目的基因的克隆，分子生物學(xué)家就能利用多種技術(shù)從這個(gè)基因中獲取各種有用的生物信息。講課提綱5.1篩選的難題5.2直接篩選目的基因5.3從基因文庫(kù)中鑒定克隆5.4鑒定克隆的方法5.1.1兩種獲得目的基因的基本策略雖然獲得目的基因的方法有多種，但都是由兩種基本的方法演變而來(lái)。

(1)直接篩選目的基因

即在克隆實(shí)驗(yàn)中所獲得的所有克隆都是目的基因的克隆。絕大多數(shù)情況，篩選是在平板檢出階段進(jìn)行。

(2)從基因文庫(kù)中鑒定目的基因

需要對(duì)基因文庫(kù)的單個(gè)克隆進(jìn)行分析，以選擇所需的目的基因。直接篩選目的基因的方法：因其快速、清晰的優(yōu)點(diǎn)受到青睞。但不能應(yīng)用于所有的基因。在當(dāng)前很多生物的完整基因組文庫(kù)已經(jīng)建立的情況下，需要用后一種方法獲得目的基因的克隆。

質(zhì)粒R-5帶有4種抗生素的抗性基因：卡那霉素、氯霉素、鏈霉素和磺胺類(lèi)藥劑。

EcoRI酶切產(chǎn)生的13個(gè)片段中，有一個(gè)含有卡那霉素抗性基因。首先將R6-5的EcoRI所有酶切片段插到某個(gè)載體上的EcoRI位點(diǎn)(如pBR322)。連接物中混合有這13個(gè)不同重組體的多拷貝，其中一組攜帶有卡那霉素抗性基因。trpA-突變株可用于克隆正常的trpA基因首先從一野生型菌株中純化出完整的DNA，用一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，再連于載體上。這樣產(chǎn)生出的無(wú)數(shù)重組DNA分子中將會(huì)有一個(gè)攜帶了完整的trpA基因[圖8-4(a)]。而該基因來(lái)自于野生型菌株，是有功能的trpA基因。

用這些連接混合物轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌TrpA-細(xì)胞[圖8-4(b)]，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化體仍然是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，只有少數(shù)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒才含有正常的ttrpA基因拷貝。這些非營(yíng)養(yǎng)缺陷型重組體不再依賴(lài)培養(yǎng)基中的色氨酸，因?yàn)檗D(zhuǎn)化進(jìn)去的trpA基因可以直接產(chǎn)生色氨酸合成酶[圖8-4(c)]。將這些轉(zhuǎn)化體接種于基本成分培養(yǎng)基上(無(wú)任何添加成分，特別是無(wú)色氨酸)，就可以進(jìn)行直接篩選[圖8-4(d)]。營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化體不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，出現(xiàn)的菌落就是含有克隆的trpA基因的轉(zhuǎn)化體。5.2.2標(biāo)志獲救的范圍與局限雖然標(biāo)志獲救可用于獲得許多基因，但仍有兩方面的局限性。

(1)必須要有與待測(cè)基因?qū)?yīng)的突變株。

(2)需要只有野生型才能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。標(biāo)志獲救適用于多數(shù)編碼生物合成酶的基因，因?yàn)檫@些基因的克隆可通過(guò)類(lèi)似用于trpA的方法在基本培養(yǎng)基上篩選出來(lái)。這一技術(shù)并不局限于大腸桿菌，甚至不局限于細(xì)菌；在酵母和絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中，利用標(biāo)志獲救同樣可以篩選克隆基因。大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株也可以作為宿主篩選來(lái)源于其他生物體的基因。通常，來(lái)自其他細(xì)菌或酵母的酶，因與大腸桿菌中相應(yīng)的酶有著足夠的相似性，能夠在大腸桿菌中發(fā)揮同樣的用，使得克隆的基因可以把宿主恢復(fù)成野生型。5.3.1基因文庫(kù)基因組文庫(kù)(圖6-4)：是某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆的數(shù)目足夠大，使這一生物體的每一個(gè)基因都能包含進(jìn)去?；蚪M文庫(kù)的制備需以下步驟：純化全細(xì)胞DNA，部分限制性酶切得到適當(dāng)大小片段，插入到合適的載體上。通常選用的載體有：

λ置換載體、黏端質(zhì)粒、酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或者P1載體(圖8-5)。5.3.2并非所有的基因都同時(shí)表達(dá)大部分多細(xì)胞生物體的一個(gè)典型特征是細(xì)胞的特化。每種細(xì)胞都含有完整而相同的所有基因，但在不同的細(xì)胞類(lèi)型中，有的基因開(kāi)啟而有的基因是關(guān)閉的。因?yàn)槿魏我环N細(xì)胞中都只有部分基因表達(dá)，利用這一事實(shí)來(lái)制備基因文庫(kù)：制作文庫(kù)的起始材料不是DNA而是mRNA。以mRNA為起始材料所得的克隆只包含整個(gè)細(xì)胞所有基因的一部分。當(dāng)目的基因在某一細(xì)胞類(lèi)型中高表達(dá)時(shí)，這種利用mRNA的克隆方法顯得特別有用。例如，麥醇溶蛋白是小麥中一種重要的營(yíng)養(yǎng)蛋白，在發(fā)育的小麥種子中，編碼的麥醇溶蛋白基因高水平表達(dá)。這些細(xì)胞中總mRNA的30％是麥醇溶蛋白的mRNA。顯然，如果從小麥種子中克隆mRNA，將會(huì)得到大量特異表達(dá)麥醇溶蛋白的克隆。5.3.3mRNA可通過(guò)cDNA進(jìn)行克隆信使RNA本身是不能與載體相連的，但它可以通過(guò)合成cDNA(complementaryDNA)轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA雙鏈。關(guān)鍵：逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA單鏈為模板合成互補(bǔ)的DNA多核苷酸鏈)。一旦合成cDNA后，雜交鏈中的RNA可用RNaseH處理使之降解。剩余的RNA片段可作為引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二條鏈。形成的雙鏈DNA片段可連接到載體上進(jìn)行克隆。得到的cDNA克隆代表了最初制備時(shí)的mRNA。在從小麥種子中提出的mRNA而建立的cDNA文庫(kù)中，麥醇溶蛋白的mRNA克隆占了很大比例。其他的克隆雖然也存在，但此時(shí)篩選麥醇溶蛋白cDNA克隆遠(yuǎn)比在整個(gè)小麥完整的基因組中進(jìn)行篩選容易。5.4鑒定克隆的方法制備好合適的文庫(kù)后，可利用許多方法對(duì)目的克隆進(jìn)行鑒定。雖然有一些方法是通過(guò)檢測(cè)克隆基因的翻譯產(chǎn)物來(lái)鑒定重組體的，但往往直接鑒定正確的重組體DNA分子更為容易。這將用到一項(xiàng)重要的技術(shù)—雜交探針(hybridizationprobing)技術(shù)。5.4.1互補(bǔ)核酸鏈的相互雜交任意兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對(duì)的趨勢(shì)。但形成的大多數(shù)分子對(duì)由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。但如果多聚核苷酸鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，堿基對(duì)的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。這一現(xiàn)象不僅僅發(fā)生在單鏈DNA分子之間形成DNA雙螺旋，單鏈RNA分子之間以及單鏈RNA與單鏈DNA之間也可以雜交。如果用目的基因的互補(bǔ)DNA或RNA作探針，就可利用核酸雜交(nucleicacidhybridization)鑒定出特定的重組體克隆。5.4.2用于菌落和噬菌斑的雜交探針技術(shù)重組體DNA分子無(wú)論是存在于菌落中還是存在于噬菌斑中，都可以用雜交探針技術(shù)鑒定出來(lái)。由于一項(xiàng)20世紀(jì)70年代發(fā)展而來(lái)的新技術(shù)，我們并不需要純化每一個(gè)重組體。這項(xiàng)技術(shù)就是原位雜交技術(shù)。首先把菌落或是噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或是尼龍膜上，處理除去雜質(zhì)，只留下DNA。通常以上處理步驟同時(shí)會(huì)使DNA分子變性，雙螺旋之間的氫鍵會(huì)斷裂。如所用的是硝酸纖維膜，短時(shí)間的80℃的加熱會(huì)使這些單鏈DNA分子牢牢結(jié)合到膜上；如果使用的是尼龍膜，處理方法相應(yīng)的改為紫外光照射。DNA分子與膜結(jié)合的部分是它們磷酸化的五碳糖主鏈，這樣它們的堿基是自由的，可以和互補(bǔ)的核酸分子配對(duì)。方法：然后把探針加上標(biāo)簽，加熱變性，再加到適宜核酸退火的化學(xué)溶液中與膜結(jié)合。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，等雜交已經(jīng)發(fā)生后，洗去沒(méi)有結(jié)合的探針，干燥，現(xiàn)在就可以檢測(cè)結(jié)合的探針的位置。傳統(tǒng)的方法是給探針標(biāo)記上放射性的核苷酸。標(biāo)記的方法：缺口翻譯、末端填平、隨機(jī)引物法(randompriming)[圖8-10]。其中隨機(jī)引物法可以產(chǎn)生高活性的探針，能夠探測(cè)出與膜結(jié)合得很少量的DNA分子。用以上方法，雜交信號(hào)的位置可以通過(guò)放射自顯影探測(cè)出來(lái)。不過(guò)，放射性標(biāo)記已不再流行，部分是因?yàn)樗鼘?duì)研究人員身體的傷害，部分是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)產(chǎn)生的放射性污染物的處理問(wèn)題。已開(kāi)發(fā)出來(lái)的大量的非放射性方法，圖8-11解釋了其中兩種操作流程。第一種方法：使用dUTP和生物素(biotin)反應(yīng)；生物素是一種有機(jī)分子，與抗生物素蛋白(或親和素，avidin)有很高的親和性。再用反應(yīng)產(chǎn)物去標(biāo)記探針，使探針帶上生物素。雜交后，用結(jié)合熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白去檢出探針的位置。這種方法與放射性標(biāo)記具有相同的敏感度，正變得越來(lái)越流行。另一種方法：將探針DNA分子用辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase)標(biāo)記;

辣根過(guò)氧化物酶有降解魯米諾(氨基苯二酰肼)的活性，同時(shí)伴有化學(xué)熒光信號(hào)的發(fā)出。與放射自顯影類(lèi)似，這種熒光信號(hào)可以被普通膠卷記錄下來(lái)。5.4.3雜交探針實(shí)際應(yīng)用的例子從菌落或是噬菌斑中鑒定某個(gè)特定重組體的方法能否成功的一個(gè)前提：是否可以得到合適的核酸分子作探針。探針至少與被克隆的基因有著部分序列的互補(bǔ)性。當(dāng)試驗(yàn)的目的是要獲得某個(gè)原本不了解的基因時(shí)，要用什么來(lái)作為探針呢?

實(shí)際上，可以通過(guò)已有的有關(guān)該基因的信息來(lái)確定探針的性質(zhì)?？梢钥紤]以下3個(gè)可能性：

(1)目標(biāo)基因在某種細(xì)胞類(lèi)型中高表達(dá)，可以考慮從這種特定細(xì)胞類(lèi)型的文庫(kù)中篩選該基因。

(2)該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列已知或者部分已知。

(3)該基因?qū)儆谀硞€(gè)已知的家族。用高豐度重組體作探針?lè)治鯿DNA文庫(kù)

當(dāng)我們想獲得在某種類(lèi)型的細(xì)胞中有相對(duì)較高的表達(dá)量的基因克隆時(shí)，則先制備該細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。如制備正在發(fā)育的小麥種子的cDNA文庫(kù)中，有相當(dāng)大比例的克隆是麥醇溶蛋白基因的mRNA。鑒定麥醇溶蛋白克?。河梦膸?kù)中的某一個(gè)cDNA克隆作探針去檢測(cè)文庫(kù)中的其他克隆(圖8-12)。隨機(jī)選擇一個(gè)克隆，純化重組DNA分子，作上標(biāo)記，用作探針檢測(cè)其他克隆。用不同的克隆作探針重復(fù)以上步驟，直到發(fā)現(xiàn)某一個(gè)克隆可以與文庫(kù)中相當(dāng)大比例的克隆相雜交。這個(gè)豐富存在的cDNA被認(rèn)為很可能是麥醇溶蛋白，并進(jìn)一步作更細(xì)致地分析以確定，如進(jìn)行DNA測(cè)序或是分離它的表達(dá)產(chǎn)物。用于編碼特定表達(dá)產(chǎn)物的基因的寡核苷酸探針由于蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了四十多年，很多蛋白質(zhì)的序列也是已知的。如果已知氨基酸序列，就可以用遺傳密碼來(lái)預(yù)測(cè)相應(yīng)基因的DNA序列。這種預(yù)測(cè)通常是不精確的，因?yàn)橹挥屑琢虬彼岷蜕彼釋?duì)應(yīng)一個(gè)三聯(lián)體密碼，其他所有的氨基酸都至少由兩個(gè)密碼子編碼。然而，在大多數(shù)情況下，編碼同一個(gè)氨基酸的密碼子是有一定聯(lián)系的。例如丙氨酸，被GCA，GCT，GCG和GCC編碼，三聯(lián)體密碼的三分之二可以很明確地預(yù)測(cè)出來(lái)的。以細(xì)胞色素c為例說(shuō)明細(xì)胞色素c是一種需氧生物的呼吸鏈中起重要作用的蛋白質(zhì)。早在1963年，就測(cè)出了來(lái)源于酵母的細(xì)胞色素c的氨基酸序列，結(jié)果顯示在圖8-13中。這個(gè)序列包含一個(gè)片段，從第59個(gè)氨基酸起分別是Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met。由遺傳密碼可知，編碼這個(gè)六肽的DNA序列是TGG-GAT／C-GAA／G-AAT／C-AAT/C-ATG。盡管存在16種不同的可能序列，但18個(gè)核苷酸中有14個(gè)是可以精確地預(yù)測(cè)出來(lái)的。

實(shí)驗(yàn)室中，長(zhǎng)度小于50bp的寡核苷酸序列是可以很容易被合成出來(lái)的(圖8-14)。據(jù)預(yù)測(cè)的核苷酸序列，可以合成所需的寡核苷酸探針，有可能用這個(gè)探針鑒定目的基因。細(xì)胞色素c這個(gè)例子中，合成編碼Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met的16種可能的寡核苷酸序列；分別使用16種探針或是混合作為一個(gè)探針庫(kù)，檢測(cè)酵母的基因組或是cDNA文庫(kù)(圖8-15)。其中將會(huì)有一個(gè)探針是正確的序列，能夠和細(xì)胞色素c基因的那個(gè)區(qū)域相雜交，而雜交的信號(hào)將指示出是哪一個(gè)克隆攜帶了該基因。從細(xì)胞色素c的蛋白序列中選出另外一個(gè)不同的片段，據(jù)此合成另一套寡核苷酸探針，用來(lái)檢驗(yàn)第一次檢出的結(jié)果。但是第二個(gè)片段的選擇一定要注意：例如緊挨著上次選擇的另一個(gè)六肽Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn，可能被幾千種不同的18bp的DNA序列編碼，很明顯不是一個(gè)合適的選擇。用于鑒定相關(guān)基因的異種探針技術(shù)比較來(lái)源于不同生物、編碼同一種蛋白質(zhì)的兩個(gè)基因時(shí)，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)它們有著很高的序列相似性，這反映了在進(jìn)化過(guò)程中基因結(jié)構(gòu)的保守性。因此，根據(jù)其中一個(gè)物種基因合成的探針往往也能夠與另一個(gè)物種基因進(jìn)行很牢固的雜交。盡管兩個(gè)DNA分子并不是完全互補(bǔ)的，只要能夠形成足夠多的核苷酸配對(duì)，雜交雙鏈仍然是很穩(wěn)定的[圖8-16(a)]。異種探針技術(shù)(heterologousprobing)：利用這種不同來(lái)源的DNA分子相應(yīng)序列間的雜交鑒定克隆的。例如，前面用寡核苷酸探針技術(shù)鑒定出了酵母的細(xì)胞色素c，可以作為雜交探針來(lái)鑒定其他生物中的細(xì)胞色素c基因，如脈孢菌(Neurosporacrassa)中的細(xì)胞色素c基因。盡管它們并不完全配對(duì)，但足夠多的氫鍵保證了雜交結(jié)構(gòu)的形成，通過(guò)放射自顯影探測(cè)出雜交信號(hào)[圖8-16(b)]。試驗(yàn)的操作條件會(huì)有一些變化，因?yàn)殡s交結(jié)構(gòu)并不是很穩(wěn)定，有可能在放射自顯影前丟失掉探針。異種探針技術(shù)還可以用來(lái)鑒定同種生物內(nèi)的相關(guān)基因。例如，前面部分鑒定出了小麥的麥醇溶蛋白的cDNA克隆，用它作探針檢測(cè)整個(gè)小麥的基因組文庫(kù)，它雜交的不僅僅是它自身的基因，還會(huì)有一些其他的基因[圖8-16(c)]。它們都是與麥醇溶蛋白cDNA相關(guān)的基因，只在核苷酸序列上有著輕微的不同。這是因?yàn)辂湸既艿鞍缀拖嚓P(guān)蛋白，形成了一個(gè)多基因家族(multigenefamily)成員編碼的復(fù)雜群體。一旦克隆了這個(gè)家族中的一個(gè)基因，用異種探針技術(shù)可以把該家族中的其他成員分離出來(lái)。5.4.4基于檢測(cè)克隆基因產(chǎn)物的鑒定技術(shù)要從一個(gè)基因文庫(kù)中鑒定某一特定的重組體，通常會(huì)優(yōu)先考慮雜交探針技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)有著很好的操作性，而且由于近幾年來(lái)的