腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ团c抗腦缺血課件

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ湍X缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛣?dòng)物模型是醫(yī)學(xué)藥學(xué)研究中的一個(gè)重要手段，尤其對(duì)于缺血性腦血管病，能即刻制造或模擬血流下降或阻斷，只有利用動(dòng)物模型才能進(jìn)行。動(dòng)物模型具有方便、快捷、條件可控、腦缺血程度一致等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，腦缺血的研究進(jìn)展有利于各種動(dòng)物模型的廣泛應(yīng)用。建立和選擇理想的缺血性腦損傷動(dòng)物模型，對(duì)于缺血性腦血管病研究具有重要意義。腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛯?duì)以下研究具有很重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值:(1)不同腦缺血狀態(tài)下的病理學(xué)改變；(2)缺血半暗帶的研究；(3)再灌注損傷；(4)缺血本身導(dǎo)致的病理生理學(xué)變化；(5)干預(yù)治療對(duì)缺血性損害的保護(hù)作用；(6)缺血性損害的部分機(jī)制等。一、全腦缺血模型(Globalcerebralischemiamodels)

全腦缺血模型是完全阻斷或驟然降低大腦的血流，造成全腦缺血。近年來(lái)利用嚙齒類動(dòng)物復(fù)制全腦缺血模型，在缺血性腦損傷的研究中較為廣泛。共同特點(diǎn)：缺血暫時(shí)廣泛地影響各個(gè)腦區(qū)，但病理改變發(fā)生在易損區(qū)。大鼠四血管阻斷模型[TheFour-VesselOcclusion(4VO)ModelintheRat]大鼠四腦動(dòng)脈阻塞模型：雙側(cè)椎動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷。用3％水合氯醛麻醉（300mg/kg,ip.）。然后于枕骨下作1cm左右切口，暴露第一頸椎左右兩個(gè)橫突孔，以1411高頻小電刀插入橫突孔燙閉雙側(cè)椎動(dòng)脈。24h后乙醚麻醉狀態(tài)下切開(kāi)顱頂皮膚，于矢狀縫與冠狀縫相交及顳骨與人字縫相交處分別埋植腦電極，接于SJ-42多導(dǎo)生理記錄儀，以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄大鼠的腦電圖（EEG）及翻正反射恢復(fù)時(shí)間。將大鼠仰臥位固定，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。大鼠清醒狀態(tài)下用小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，可見(jiàn)大鼠意識(shí)和翻正反射消失，眼變白，豎毛，呼吸加快。30min后去除動(dòng)脈夾，造成再灌注模型。再灌同時(shí)股靜脈注射60mg/kg伊文思藍(lán)。60min后大鼠斷頭取腦，然后用生理鹽水和丙酮混合液（3：7v/v）制成10%勻漿（W/V）。離心，取上清液，在620nm處測(cè)吸光度表示腦組織中伊文思藍(lán)含量，以此反映受試藥對(duì)腦血管通透性的影響。優(yōu)點(diǎn)：①可產(chǎn)生嚴(yán)重的腦缺血。可較好地模擬臨床上多種原因造成的全腦缺血性損傷過(guò)程；②缺血一定時(shí)間后可按實(shí)驗(yàn)要求重新開(kāi)啟動(dòng)脈夾進(jìn)行再灌注。缺點(diǎn)：①成功率低，約50%；②操作相對(duì)復(fù)雜、不能一次完成，動(dòng)物的死亡率高。該方法適合于腦缺血的急性實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)仍被廣泛應(yīng)用。線栓法(threadembolismmethod)線栓法：是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者制備MCAO動(dòng)物模型最常用的方法。該方法是Koizumi于1986年發(fā)明的。在1989年，Longa對(duì)這種方法加以改進(jìn)，而后廣泛用于實(shí)驗(yàn)性腦缺血研究。目前在腦缺血實(shí)驗(yàn)中多采用Longa改進(jìn)的線栓法。2、線栓的插入頸外動(dòng)脈切口插入法：此種方法可以用來(lái)制備腦缺血、腦缺血再灌注模型。由頸總動(dòng)脈分叉處向頭端依次游離，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈的分支：枕骨下動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，切斷頸外動(dòng)脈使其主干游離備用。然后分離頸內(nèi)動(dòng)脈，用絲線在頸外動(dòng)脈根部打一松扣，夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。圖1大鼠顱底內(nèi)外血管（部分）模式圖3、線栓法制備動(dòng)物模型的影響因素栓線法大鼠MCAO模型在國(guó)際上已被廣泛采用。但仍有很多因素可影響該模型缺血程度的穩(wěn)定，如動(dòng)物體重、栓線的直徑及插入深度、肝素的使用等，會(huì)遇到有的動(dòng)物無(wú)腦缺血癥狀或癥狀很輕，有的動(dòng)物癥狀很重或死亡。因此，必須充分考慮建立模型過(guò)程中的影響因素。 （1）線栓的選擇 線栓的選擇直接關(guān)系著造模的成功與否。一般選擇為外科尼龍線，直徑有3-0、4-0兩種。但許多學(xué)者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用0.20～0.26mm的進(jìn)口魚線代替4-0外科手術(shù)線，由于其韌性好，硬度也較佳，進(jìn)線時(shí)較4-0手術(shù)線順利，有利于模型的制備，且較經(jīng)濟(jì)。由于直徑和線質(zhì)量硬度的不同而導(dǎo)致梗塞灶部位和體積的變化。一般來(lái)說(shuō)，選擇標(biāo)準(zhǔn)是不能太硬，這樣很容易刺破血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血；也不能太軟，當(dāng)線栓進(jìn)入大腦前動(dòng)脈時(shí)能感到阻力，也就是再插線會(huì)見(jiàn)到線彎曲，太軟則彎曲不明顯。在選擇使用魚線時(shí)，最好用細(xì)砂紙打磨頭端，并將頭端沾蠟5mm左右，造模成功率較高。

（3）動(dòng)物體重 文獻(xiàn)報(bào)道大鼠體重指標(biāo)為250-330g。要確保所使用線栓能夠阻塞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的MCA；手術(shù)前應(yīng)禁食過(guò)夜，避免大鼠血糖不穩(wěn)定；麻醉劑用量對(duì)手術(shù)的影響。五、缺血性腦損傷的評(píng)價(jià)方法在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，常用的評(píng)價(jià)缺血損傷的方法有以下幾種。（一）形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)1、光鏡觀察 將腦組織染色后放在光學(xué)顯微鏡下觀察，可以看到腦缺血后神經(jīng)元腫脹、輪廓不清、空泡樣變性及核固縮等一系列病理形態(tài)學(xué)變化，從而對(duì)缺血損害做出評(píng)價(jià)。

3、TTC染色采用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)對(duì)腦組織染色，其原理是TTC和活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的triphenylformazan（TTF），用來(lái)表示細(xì)胞的活力。結(jié)合圖像分析技術(shù)觀測(cè)梗塞范圍。通過(guò)測(cè)量梗塞體積來(lái)衡量腦缺血的嚴(yán)重程度。是評(píng)價(jià)腦缺血損傷常用的指標(biāo)。圖2TTC染色：正常腦組織為深紅色，梗死區(qū)為灰白色

（二）神經(jīng)機(jī)能學(xué)評(píng)價(jià)1、行為學(xué)評(píng)價(jià)多采用Longa評(píng)分。Longa的神經(jīng)功能缺損5分制標(biāo)準(zhǔn)為：

0分：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀，活動(dòng)正常；

1分：提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外展，緊貼胸壁（圖3）；

2分：爬行時(shí)出現(xiàn)向非手術(shù)側(cè)轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象）；

3分：行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒；

4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。圖3Longa神經(jīng)行為評(píng)分（1分）

2、腦電圖觀察局灶性腦缺血會(huì)引起腦電波的抑制，缺血區(qū)腦電圖出現(xiàn)波幅降低，頻率減慢.水合氯醛以其體內(nèi)代謝產(chǎn)物三氯乙醇發(fā)揮麻醉作用，對(duì)呼吸抑制作用較其它中樞麻醉藥小，大劑量可引起呼吸和心血管系統(tǒng)抑制，引起血壓降低和酸中毒。其鎮(zhèn)痛作用較弱。實(shí)驗(yàn)中多采用3%水合氯醛(300mg/kg)進(jìn)行麻醉。（二）腦溫

實(shí)驗(yàn)中溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞損傷。腦溫下降2～3℃對(duì)缺血性腦損傷，尤其皮質(zhì)損傷具有明顯的保護(hù)作用。亞低溫均可抑制腦缺血損傷.在缺血期低溫必須持續(xù)1～2h才能起到保護(hù)作用，持續(xù)時(shí)間<30min則無(wú)效。亞低溫保護(hù)腦的可能機(jī)制：降低腦耗氧量和能量代謝、減少乳酸堆積;減輕炎性因子的損害;保護(hù)血腦屏障;減輕腦水腫及降低顱內(nèi)壓等。因此，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制動(dòng)物腦實(shí)質(zhì)的溫度。（三）血糖

葡萄糖水平可影響腦損傷程度.高血糖→缺血后的腦梗死體積↑→缺血性損傷↑。其機(jī)制可能與糖酵解增加，乳酸堆積引起酸中毒有關(guān)。葡萄糖通過(guò)酵解可產(chǎn)生2分子丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生2分子ATP。在有氧條件下，丙酮酸會(huì)在丙酮酸脫氫酶作用下，進(jìn)行代謝，并在線粒體內(nèi)經(jīng)一系列反應(yīng)產(chǎn)生CO2和36分子ATP；但在缺血缺氧時(shí)，丙酮酸脫氫酶活性受抑制，此時(shí)丙酮酸則在乳酸脫氫酶作用下產(chǎn)生乳酸，局部腦組織PH下降。因此，當(dāng)葡萄糖由有氧氧化轉(zhuǎn)化為無(wú)氧酵解時(shí)，不但使能量產(chǎn)生減少，還可引起腦組織局部環(huán)境酸度增加。腦缺血后，由于腦血流的減少，葡萄糖供應(yīng)的減少可能會(huì)限制乳酸的產(chǎn)生量。如果此時(shí)增加葡萄糖的血漿濃度，大量糖就會(huì)通過(guò)酵解產(chǎn)生乳酸，從而加重酸中毒。因此控制血糖水平對(duì)模型的損傷程度也非常重要?？稍谀Ｐ椭谱髦?，動(dòng)物統(tǒng)一禁食12h。

（四）血壓和血?dú)?/p>

血壓對(duì)腦梗死模型有一定影響，高血壓的動(dòng)物缺血改變出現(xiàn)早，而全身低血壓也會(huì)加重腦損傷，因此，實(shí)驗(yàn)應(yīng)常規(guī)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓。腦缺血時(shí)，血?dú)鈱?duì)損傷程度也有較大影響，高碳酸血癥和酸中毒明顯增加腦梗死體積。模型制作時(shí)，應(yīng)抽取血樣進(jìn)行血?dú)夥治?，測(cè)定動(dòng)脈血氧，二氧化碳分壓，氧飽和度和血液酸度。麻醉時(shí)配合人工呼吸可維持較穩(wěn)定的血