色譜法-研究生課件

第二章色譜分析法(Chromatography)12/6/20221內(nèi)容第一節(jié)色譜法發(fā)展簡史

第二節(jié)色譜分析法概論

第三節(jié)色譜基礎(chǔ)理論第四節(jié)色譜法的發(fā)展趨勢第五節(jié)氣相色譜法第六節(jié)高效液相色譜法12/6/20222引言

近50年中，氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層掃描法及毛細管電泳法飛速發(fā)展，形成了一門專門的科學—色譜學。

色譜學是研究物質(zhì)分離分析的一門科學，是分析化學的重要組成部分。12/6/2022312/6/20225色譜法溯源：應(yīng)用于分離植物色素將含有植物色素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。玻璃管上端立即出現(xiàn)幾種顏色的混合譜帶。用石油醚沖洗，隨著石油醚的加入，譜帶不斷地向下移動，并逐漸分開成幾個不同顏色的譜帶，繼續(xù)沖洗就可分別接得各種顏色的色素，可分別進行鑒定。色譜法由此而得名。第一節(jié)色譜法發(fā)展簡史12/6/202261903年:俄國植物學家M.S.Tswett

發(fā)現(xiàn)色譜現(xiàn)象1906年：正式命名色譜法（chromatography)30～40年代:薄層色譜與紙色譜——分離技術(shù)50年代:氣相色譜法(GC)——分離分析方法現(xiàn)代色譜法的第一個里程碑60年代：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）現(xiàn)代色譜法的第二個里程碑第一節(jié)色譜法發(fā)展簡史12/6/2022770年代：

高效液相色譜（HPLC）迅速崛起

現(xiàn)代色譜法的第三個里程碑90年代：

HPLC-MS儀器商品化80年代初：超臨界流體色譜法（SFC）80年代末：高效毛細管電泳法（HPCE）90年代：

毛細管電色譜法第一節(jié)色譜法發(fā)展簡史12/6/20228（一）定義色譜分析法簡稱色譜法或?qū)游龇?，是一種物理的或物理化學的分離分析方法。它利用混合物中不同組分在相對運動、相互不溶的兩相間分配系數(shù)的差別，經(jīng)過連續(xù)多次在兩相間的質(zhì)量交換，從而使不同組分得到分離，然后再逐一進行檢測。

第二節(jié)色譜分析法概論12/6/202210被流動相洗脫：當組分在固定相與流動相間達到動態(tài)分配平衡時，此時分配在流動相的組分部分叫做被流動相洗脫。色譜儀：可完成色譜分離并具有在線檢測器的儀器。色譜柱：將固定相裝于柱管內(nèi)構(gòu)成色譜柱。色譜分析條件：在色譜分離中，所使用的固定相、流動相、檢測器的操作條件構(gòu)成了色譜分析條件。第二節(jié)色譜分析法概論12/6/202212（三）特點

高靈敏度高選擇性高效能分析速度快應(yīng)用范圍廣

定性能力差優(yōu)點缺點第二節(jié)色譜分析法概論12/6/202214氣相色譜法（gaschromatography;GC）

以氣體為流動相的色譜法液相色譜法（liquidchromatography;LC）

以液體為流動相的色譜法超臨界流體色譜法

(supercriticalfluidchromatography;SFC）

以超臨界流體為流動相的色譜法按流動相和固定相的物理狀態(tài)分類第二節(jié)色譜分析法概論（四）分類

12/6/202215柱色譜法（columnchromatography)

將固定相裝在柱管內(nèi)構(gòu)成色譜柱，色譜過程在色譜柱內(nèi)進行的色譜法

填充柱、毛細管柱、微填充柱色譜法平板色譜法

(planechromatography)

紙色譜法、薄層色譜法、薄膜色譜法按固定相的形式分類（四）分類

12/6/202216分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法空間排阻色譜法親和色譜法化學鍵合相色譜法毛細管電泳法毛細管電色譜法按色譜過程的分離機制分類（四）分類

12/6/2022171.分配色譜法(partitionchromatography)

固定相為液態(tài)，利用樣品組分在固定相或流動相中的溶解度不同所造成的分配系數(shù)的差別而實現(xiàn)分離。

2.吸附色譜法(adsorptionchromatography

)固定相為吸附劑，靠樣品組分在吸附劑上的吸附系數(shù)（吸附能力）差別而實現(xiàn)分離。

按色譜過程的分離機制分類12/6/2022185.化學鍵合相色譜法（chemicallybondedphasechromatography,CBPC）

利用化學反應(yīng)通過共價鍵將有機分子鍵合在載體（硅膠）表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相。其分離機理為吸附和分配兩種機理兼有。

6.親和色譜法(affinitychromatography

)

固定相為鍵合親和配基的親和吸附介質(zhì)（親和吸附劑），利用配體與配基之間專一性的親和吸附作用而實現(xiàn)分離。按色譜過程的分離機制分類12/6/2022207.毛細管電泳法(capillaryelectrophoresis,CE)以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離分析技術(shù)，實際上包含電泳技術(shù)和色譜技術(shù)及其交叉內(nèi)容。8.毛細管電色譜法(capillaryelectro-chromatopraphy,CEC)將HPLC的固定相填充到毛細管中或在毛細管內(nèi)壁涂布固定相，以電滲流為流動相驅(qū)動力的色譜過程，此模式兼具電泳和液相色譜的分離機制。按色譜過程的分離機制分類12/6/202221第三節(jié)色譜基礎(chǔ)理論（一）色譜過程

色譜過程是物質(zhì)分子在相互不相溶、相對運動的兩相間分配“平衡”的過程?；旌衔镏校魞蓚€組分在兩相間的分配系數(shù)不等，則被流動相攜帶移動的速度不等——差速遷移，從而兩組分被分離。12/6/202223實現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對運動的兩相，固定相(stationaryphase)和流動相(mobilephase)。色譜分離過程是組分的分子在流動相和固定相間多次“分配”的過程。（一）色譜過程12/6/202224

樣品被流動相沖洗，通過色譜柱分離后各組分依次進入檢測器，檢測器所形成的響應(yīng)信號隨洗脫時間而繪制的曲線稱為色譜流出曲線?？v坐標為響應(yīng)信號強度，橫坐標為時間。（二）色譜流出曲線（色譜圖）第三節(jié)色譜基礎(chǔ)理論12/6/202226響應(yīng)值時間（min）基線↓←色譜峰峰寬峰高保留時間tR（二）色譜流出曲線（色譜圖）12/6/202227

從一張色譜圖上可以得到許多重要信息：根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)。根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析。根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以對組分進行定量分析。色譜峰的區(qū)域?qū)挾?，是評價色譜柱分離效能的依據(jù)。色譜峰間的距離，是評價固定相和流動相選擇是否合適的依據(jù)。12/6/202228標準偏差σ：正態(tài)分布曲線上兩拐點間距離的一半，為峰高0.607倍（0.607h）處的峰寬之半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬，W1/2=2.355σ峰寬W：

通過色譜峰兩側(cè)的拐點作切線在基線上的截距，W=4σ2.色譜峰區(qū)域?qū)挾?2/6/202230（三）色譜常用術(shù)語峰形狀：對稱形正態(tài)分布、拖尾形、前延形

3.對稱因子：用來衡量色譜峰的對稱性fs=W0.05h/2A=(A+B)/2Afs＜0.95

前延峰0.95＜fs＜1.05

對稱峰fs＞1.05

拖尾峰ABW0.5hW0.05h

h0.05h對稱因子的求算12/6/202231（三）色譜常用術(shù)語4.基線：在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線在穩(wěn)定的條件下應(yīng)為一條平行于橫軸的直線它的平直與否可反應(yīng)出實驗條件的穩(wěn)定情況噪音：各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象。漂移：基線隨時間朝某一方向緩慢的變化。12/6/202232(四)色譜參數(shù)1.保留時間tR：從進樣開始到某個組分的色譜峰頂點的時間間隔稱為該組分的保留時間。2.死時間t0：分配系數(shù)為零的組分的保留時間。3.調(diào)整保留時間tR’

tR’=tR-t0定性參數(shù)-保留值12/6/202233tR’即組份在固定相中的滯留時間。某組分由于溶解于固定相或被固定相吸附，而比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時間。調(diào)整保留時間tR’tR’是色譜法定性的基本參數(shù)。在實驗條件固定時，tR’只決定于組分的性質(zhì)。12/6/2022344.保留體積VR（洗脫體積）：流動相攜帶樣品進入色譜柱，從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時，所需通過色譜柱的流動相的體積，稱為該組分的保留體積。

定性參數(shù)-保留值VR=tR·FCFC：為流動相的流量12/6/2022355.死體積V0：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間。

①色譜柱內(nèi)流動相所占有的體積（參與色譜平衡過程）②進樣器導管、柱入口、柱出口接頭及檢測器內(nèi)腔等體積（只起峰擴展作用）6.調(diào)整保留體積VR’

VR’=VR-V0定性參數(shù)-保留值12/6/202236定量參數(shù)1.峰高(peakheight,h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的距離。

2.峰面積(peakarea,A)：色譜曲線與基線間包圍的面積。

hhA12/6/202237在溫度一定時，達到分配平衡后，樣品組分在固定相中的濃度（Cs）與在流動相中的濃度（Cm）之比。分配系數(shù)K(四)色譜參數(shù)12/6/202238分配系數(shù)K取決于組分的性質(zhì)與實驗條件（流動相、固定相、柱溫等），是組分的特征常數(shù)。在GC中，K的主要影響因素是柱溫，在固定相確定之后，主要靠調(diào)整柱溫以獲得組分間的分配系數(shù)差別及適宜的保留時間。在LC中，主要靠調(diào)整流動相的極性，以獲得組分間分配系數(shù)的差異及適宜的保留時間。分配系數(shù)K12/6/202239

在溫度一定時，達到分配平衡后，樣品組分在固定相與在流動相中的質(zhì)量之比。是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。容量因子k（分配比/質(zhì)量分配系數(shù)）(四)色譜參數(shù)12/6/202240

k與K的不同點：K取決于組分的性質(zhì)與實驗條件（流動相、固定相、柱溫等），與體積Vs、Vm

無關(guān)。而k除了與K有關(guān)的因素外，還與Vs

、Vm有關(guān)。容量因子k

（分配比/質(zhì)量分配系數(shù)）12/6/202241色譜熱力學：從統(tǒng)計熱力學的觀點出發(fā)，研究物質(zhì)的保留值隨固定相、流動相及組分分子結(jié)構(gòu)變化的規(guī)律，以便從理論上解決高選擇性色譜柱、色譜定性分析等問題。色譜動力學：研究物質(zhì)在色譜過程中的運動規(guī)律。以便解釋色譜流出曲線的形狀，探求影響色譜峰變寬的因素。為獲得高效能色譜柱系統(tǒng)提供理論上的指導，為色譜分析條件的篩選奠定理論基礎(chǔ)。(五)色譜理論第三節(jié)色譜基礎(chǔ)理論12/6/202242色譜熱力學—采用平衡過程研究方法（塔板模型法）將色譜過程假設(shè)為一串單個不連續(xù)步驟，且每個組分在每步中都能達到分配平衡。以塔板理論為代表色譜動力學—采用非平衡過程研究方法（速率模型法）將色譜過程作為一個連續(xù)流動的過程，每個組分以一定的速率通過色譜體系時并未達到分配平衡。以速率理論為代表

(五)色譜理論色譜分離是色譜熱力學過程和動力學過程的綜合表現(xiàn)。

12/6/202243分餾塔：

是分離沸點不同的混合物的一種裝置。在塔的底層加熱，利用各組分的揮發(fā)性不同，在塔板上經(jīng)過多次的氣液平衡，最終低沸點組分在塔頂?shù)牧鞒鲆褐泻扛?，高沸點組分在塔底含量高。(五)色譜理論塔板理論12/6/202244

把色譜柱看作一個分餾塔，在每個塔板的間隔內(nèi)，樣品混合物在氣液兩相中達到分配平衡。經(jīng)過多次的分配平衡后，分配系數(shù)小的組分（揮發(fā)性大的組分）先流出色譜柱（到達塔頂）。由于色譜柱的塔板相當多，因此分配系數(shù)的微小差別，即可獲得良好的分離效果。(五)色譜理論塔板理論基本觀點：分配平衡12/6/202245在柱內(nèi)一小高度H內(nèi)，組分可以很快在兩相中達到分配平衡。(H稱為理論塔板高度）載氣通過色譜柱不是連續(xù)前進，而是間歇式的，每次進氣為一個塔板體積。樣品和新鮮載氣都加在第0號塔板上，且樣品的縱向擴散可以忽略。分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。基本假設(shè)：(五)色譜理論塔板理論n0n1n2。。。。。。。。nnH12/6/202246假設(shè)一根色譜柱的理論塔板數(shù)n=5，塔板編號r=0,1,2,…,n-1.組分A的容量因子k=1，單位質(zhì)量的A進入色譜柱進行分配。12/6/202247Partitiontableofthecomponentinanyplateinacolumnwithn=5,k=1andw=1/212/6/202248A組分色譜圖

n太小，所以峰不對稱濃度最大點出現(xiàn)在N=8-9n>50時，峰趨于正態(tài)分布氣相色譜n=103~10612/6/202249(五)色譜理論塔板理論色譜柱的效能指標

理論塔板數(shù)

n——組分流過色譜柱時，在兩相間進行平衡分配的總次數(shù)理論塔板高度

H——單位理論塔板的長度12/6/202250L：色譜柱長度對于一根長度為L的色譜柱，其理論塔板數(shù)1.理論塔板數(shù)（n）與理論塔板高度（H）色譜柱的效能指標

12/6/2022512.有效塔板數(shù)（neff）和有效塔板高度（Heff）色譜柱的效能指標

指減去死時間后衡量柱效能的物理量。neff和Heff扣除了死時間，更能真實的反映柱效。12/6/2022521、色譜柱的理論塔板數(shù)越大，表示組分在色譜柱中達到分配平衡的次數(shù)越多，固定相的作用越顯著，因而對分離越有利,柱效能越高。但不能預(yù)言并確定各組分是否有被分離的可能，因為分離的可能性決定于試樣混合物在固定相中分配系數(shù)的差別，而不決定于分配次數(shù)的多少。2、同一色譜柱對不同組分的柱效能不同；3、色譜峰越窄，表示此組分的色譜柱效能越高。色譜柱的效能指標

討論:12/6/202253從熱力學角度解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大點的位置提出了評價柱效高低的n和H的計算式塔板理論貢獻：塔板理論沒有考慮動力學因素的影響，因而不能解決塔板高度受什么因素影響以及流速對理論塔板數(shù)的影響等問題。

不足：12/6/202254練習例：在一根2米長的色譜柱上分離苯、甲苯、乙苯的保留時間分別為1.333min，2.033min，3.017min，半峰寬分別為0.106min，0.146min，0.205min，求此色譜柱對每種組分的理論塔板數(shù)及塔板高度。解：n苯＝5.54（1.333/0.106）2＝876H苯＝2/876＝0.0023米12/6/202255問題怎樣提高色譜柱的理論塔板數(shù)n，從而提高色譜柱的效率？

12/6/202256

荷蘭學者VanDeemter在研究氣-液平衡時，提出了色譜過程動力學理論—速率理論。他吸收了塔板理論中塔板高度的概念，把色譜過程看作一個動態(tài)過程，研究過程中動力學因素對色譜峰擴展的影響，導出了速率理論方程式，較完善地解釋了影響塔板高度的各種因素。(五)色譜理論速率理論12/6/202257

A—渦流擴散項B-縱向擴散系數(shù)C—傳質(zhì)阻力系數(shù)

B/u—縱向擴散項Cu—傳質(zhì)阻力項u為流動相的線速度速率理論VanDeemter氣相色譜速率理論方程式H=A+B/u+Cu

(五)色譜理論12/6/202258

色譜柱內(nèi)填料粒度不均勻，填充不均勻是造成組分分子渦流擴散的主要原因，從而使一種組分分子經(jīng)過多個不同長度的途徑流出色譜柱而使峰展寬。對于空心毛細管柱，不存在渦流擴散，因而A=0速率理論渦流擴散項A（多徑項）12/6/202259λ—填充不規(guī)則因子dp—填料顆粒的直徑速率理論渦流擴散項A（多徑項）A=2λdp

為了減小A，提高柱效，可采?。簻p小固定相粒度用球型固定相高壓均相裝柱12/6/202260擴散即濃度趨向均一的現(xiàn)象，擴散速度的快慢可用擴散系數(shù)B來衡量?？v向擴散——使峰展寬，板高增大，柱效降低。速率理論縱向擴散系數(shù)B（分子擴散系數(shù)）樣品組分被載氣帶入色譜柱后，是以“塞子”的形式存在于色譜柱內(nèi)一小段空間中，在“塞子”前后（縱向）存在濃度差而形成濃度梯度，由此產(chǎn)生分子的縱向擴散，引起峰展寬。12/6/202261γ

：彎曲因子，反映填充物對氣體擴散的阻礙程度。Dg：組分分子在流動相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）。縱向擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差。分子擴散項與流速、柱溫和柱壓有關(guān)：流速↓，滯留時間↑，擴散↑；柱溫↑，柱壓↓，擴散↑擴散系數(shù)：Dg∝（M載氣）-1/2；M載氣↑，B值↓速率理論縱向擴散系數(shù)B（分子擴散系數(shù)）B=2γDg

由于柱中存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散。12/6/202262組分分子由于溶解、擴散、平衡及轉(zhuǎn)移的整個過程稱為傳質(zhì)過程。傳質(zhì)阻力系數(shù)C速率理論

傳質(zhì)阻力：影響傳質(zhì)過程進行速度的阻力稱為傳質(zhì)阻抗，即組分在氣相和液相兩相間進行反復(fù)分配時遇到的阻力。12/6/202263對于氣相色譜，包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl。傳質(zhì)阻抗系數(shù)C速率理論12/6/202264氣相傳質(zhì)過程：Cg=0.01k2dp2(1+k)2Dg注：式中k為容量因子；dp

為填充物顆粒的平均直徑。Cg∝dp2Cg∝1/Dg試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程，在該過程中，試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即濃度分配。如氣相傳質(zhì)過程速度慢，表示氣相傳質(zhì)阻力大，便會引起色譜峰擴張。對于填充柱：12/6/202265液相傳質(zhì)過程試樣組分從固定相的氣液界面移動到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達到分配平衡，然后再返回氣液界面的過程。在液相傳質(zhì)過程中，氣相中的組分的其它分子仍然隨載氣不斷地向柱口運動，從而造成峰形的擴張。液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl：Cl=

2kdf23(1+k)2Dl注：df為有效固定液膜厚度Dl為組分在液相中的擴散系數(shù)

componentmoleculeStationaryliquidsupport12/6/202266Cm∝dp2Cm∝1/DmCs

∝

df2Cs

∝1/Ds固定相的多孔性，會造成某部分流動相滯留在局部，微孔小或深，傳質(zhì)速度就慢，對峰的擴展影響就大。固定相的粒度越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)速率就越快，柱效就越高。傳質(zhì)阻抗系數(shù)C速率理論對于液相色譜，包括流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs。12/6/202267

低流速時（0~u最佳），u越小，B/u項越大，Cu項越小，Cu項可忽略，B/u項起主導作用，u增加則H降低。高流速時（u>u最佳），u越大，Cu越大，B/u越小，Cu項起主導作用，u增加，則H增加。H=A+B/u+Cu

1.B/u

縱向擴散項

2.Cu

傳質(zhì)阻力相

3.A

渦流擴散項

123H最小u

u最佳H板高-流速曲線流速與柱效的關(guān)系12/6/202268VanDeemter氣相色譜速率理論方程式的意義可以解釋色譜流出曲線的形狀可以解釋塔板高度-流速曲線全面概括了在色譜分離條件的選擇中，填充均勻程度、填充物的粒度、流動相的種類及流速、固定相的液膜厚度等對柱效和峰展寬的影響貢獻：速率理論12/6/202269

色譜專家系統(tǒng)，是指那些依據(jù)人類色譜專家的經(jīng)驗，模擬其思維方式，解決人類色譜專家才能解決的問題的計算機程序。具有色譜專家系統(tǒng)的全自動色譜儀稱為智能色譜儀。

自動化與智能化是分析儀器發(fā)展的趨勢。

（一）色譜專家系統(tǒng)與智能化色譜第四節(jié)色譜法發(fā)展趨勢12/6/202270

各種色譜填料的開發(fā)

HPLC—手性固定相，耐酸堿硅膠填料新型高靈敏度通用檢測器與選擇性檢測器的開發(fā)（二）新型固定相與新型檢測器第四節(jié)色譜法發(fā)展趨勢12/6/202271色譜-色譜聯(lián)用法是指二種色譜方法的聯(lián)用，也稱為二維色譜法。用一種色譜法補充另一種色譜法分離效果上的不足，提高分離效果。

氣相色譜-氣相色譜聯(lián)用、高效液相色譜-氣相色譜聯(lián)用、高效液相色譜-高效液相色譜聯(lián)用（也稱柱切換技術(shù)）、高效液相色譜-薄層色譜聯(lián)用、二維薄層色譜法等。（三）色譜—色譜聯(lián)用第四節(jié)色譜法發(fā)展趨勢12/6/202272

色譜-光譜（質(zhì)譜）聯(lián)用是當今最重要的分析方法，在色譜-光譜聯(lián)用儀器中，色譜部分負責分離，而光譜部分負責鑒定，兩者互為補充，各用其長。

氣相色譜-傅立葉變換紅外吸收光譜聯(lián)用儀（GC-FTIR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）、高效液相色譜-傅立葉變換紅外吸收光譜聯(lián)用儀（HPLC-FTIR）、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用儀（CZE-MS）。（四）色譜—光譜（質(zhì)譜）聯(lián)用第四節(jié)色譜法發(fā)展趨勢12/6/202273第五節(jié)氣相色譜法

氣相色譜法(gaschromatography,GC)：以氣體為流動相的柱色譜分離技術(shù)。于1952年由英國生物化學家MartinAJP等人在研究液液分配色譜的基礎(chǔ)上創(chuàng)立，使用了高效能的色譜柱、高靈敏度的檢測器及微處理器。（一）概述12/6/2022741.氣相色譜法的特點和應(yīng)用

適用范圍：適于分析氣體、易揮發(fā)的液體及固體，不適合分析不易氣化或不穩(wěn)定性物質(zhì)，樣品的衍生化使應(yīng)用范圍進一步擴大?！叭摺狈蛛x效能高選擇性高靈敏度高“一快”分析速度快“一廣”應(yīng)用范圍廣占有機物20%12/6/202275按固定相分

氣-固色譜(吸附色譜):應(yīng)用不廣

氣-液色譜(分配色譜):實用技術(shù)B.

按分離原理分

吸附色譜分配色譜C.

按操作形式分

填充柱色譜（基礎(chǔ)）毛細管柱色譜（主流）2.氣相色譜法的分類12/6/2022763.氣相色譜儀的組成

載氣→減壓→凈化→穩(wěn)壓→穩(wěn)流→

→色譜柱→檢測器→放大→記錄儀

進樣氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)溫控系統(tǒng)檢測系統(tǒng)12/6/202277（1）載氣：氣相色譜中常用載氣有氫氣、氮氣、氦氣和氬氣。一般由相應(yīng)的高壓鋼瓶儲裝的壓縮氣源供給。選用何種載氣主要取決于選用的檢測器和其它一些具體因素。（2）氣路結(jié)構(gòu)：單柱單氣路和雙柱雙氣路單柱單氣路：適用于恒溫分析，一些簡單氣相色譜儀屬此類。雙柱雙氣路：適用于程序升溫，目前大多數(shù)屬于此類。國內(nèi)外氣相色譜儀均由以下五大系統(tǒng)組成:A、氣路系統(tǒng)12/6/202278（3）凈化器：用來提高載氣純度的裝置，凈化劑主要有活性炭、硅膠和分子篩等，分別用來除去烴類雜質(zhì)、水分和氧氣。（4）穩(wěn)壓閥：載氣流速是影響色譜分離和定性定量的重要操作參數(shù)，因此要求載氣流速穩(wěn)定。B、進樣系統(tǒng)包括載氣預(yù)熱器、取樣器和進樣氣化裝置等，其作用是將液體或固體試樣，在進入色譜柱前瞬間氣化（不分解），然后快速定量地轉(zhuǎn)入到色譜柱中。

要求：1.準確定量，迅速注入；2.氣態(tài)或經(jīng)氣化的樣品能在載氣中形成一個窄帶集中地進入色譜柱。12/6/202279氣化室示意圖載氣入口接色譜柱散熱片加熱塊微量注射器12/6/202280用來設(shè)定、控制、測量色譜柱爐、氣化室、檢測室三處的溫度。色譜柱爐可控制恒溫，對于沸點范圍很寬的混合物，可采用程序升溫法進行分析。程序升溫指在一個分析周期內(nèi)，爐溫連續(xù)地隨時間由低溫向高溫線性或非線性地變化，以使沸點不同的組分各在其最佳柱溫下流出，從而改善分離效果，縮短分析時間。C、分離系統(tǒng)色譜柱（核心）柱長和固定相D、溫控系統(tǒng)12/6/20228112/6/202282恒溫和程序升溫分析烴類化合物12/6/202283氣化室溫度應(yīng)使試樣瞬間氣化而又不分解，通常選在試樣的沸點或稍高于沸點，一般比柱溫高10～50℃。柱室的溫度控制要求精確，可以恒溫，也可以程序升溫。檢測器溫度波動將影響檢測器靈敏度或穩(wěn)定性，比柱溫高數(shù)十度，控溫精度要求優(yōu)于±0.1℃。E、檢測器是一種將載氣里被分離組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)橐子跍y量的信號（一般為電信號）的裝置。12/6/2022844.氣相色譜法的分離過程氣化后樣品中各組分隨載氣一同進入色譜柱，由于各組分性質(zhì)差異使其在固定相和流動相具有不同溶解、解析能力（氣液色譜）、或不同的吸附、脫附能力（氣固色譜），或其它作用力差異。當兩相作相對運動時，樣品各組分在兩相間反復(fù)多次（103～106）受到上述各種作用力的作用，從而使樣品各組分在色譜柱中產(chǎn)生差速運動，最終達到色譜分離。依據(jù)：組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異與固定相作用差異隨流動相移動的速度不等差速遷移（速度差異）色譜分離。12/6/202285色譜柱

柱管

填充劑填充柱：1~4米柱長，2~6mm內(nèi)徑毛細管柱：幾十米~幾百米柱長0.1~0.5mm內(nèi)徑固體吸附劑——氣-固吸附色譜柱載體+固定液——氣-液分配色譜柱（二）氣相色譜柱12/6/2022861、分析對象：永久性氣體和低分子量烴類等氣態(tài)化合物（H2、O2、N2、CO、CO2的分離）；2、固體吸附劑要求：較大比表面，一般>200m2/g，使其對氣態(tài)樣品有較強的吸附性。好的選擇性好的熱穩(wěn)定性有一定機械強度A.氣-固吸附色譜柱12/6/2022873、常用固體吸附劑：1）分子篩類，人工合成的硅鋁酸鹽2）硅膠（強極性）3）AL2O3（極性，吸附力強）4）碳質(zhì)類，如活性炭（非極性）、碳分子篩、石墨化碳黑等5）高分子多孔微球12/6/202288B.氣-液分配色譜柱固定相：載體（擔體）+固定液12/6/202289（1）載體1．作用：承載固定液2．要求：比表面積大（多涂漬固定液）合適表面能（吸附固定液）合理孔結(jié)構(gòu)（便于樣品在兩相間快速傳質(zhì)交換）化學惰性（不與固定液及樣品發(fā)生化學反應(yīng)）熱穩(wěn)定性好一定的機械強度12/6/202290樣品固定液推薦用載體注非極性非極性未經(jīng)處理的硅藻土型載體極性極性酸洗、堿洗或硅烷化硅藻土載體酸性樣品用酸洗載體，堿性樣品用堿洗載體極性和非極性弱極性或極性酸洗硅藻土載體弱極性、極性或非極性、用量小于5%硅烷化載體高沸點玻璃微球強腐蝕性樣品聚四氟乙烯等特殊載體載體的選擇12/6/202291（2）固定液涂漬于載體表面起分離作用的氣液色譜的固定相。常溫下為液體或固體，在操作溫度下是不易揮發(fā)的液體（易于形成均勻液膜）。1．要求：（1）對樣品有較好的溶解性及選擇性（2）極性范圍廣而適當（3）操作條件下固定液熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性好（4）固定液的蒸氣壓要低（柱壽命長，檢測本底低）2．分類：化學分類法極性分類法12/6/202292按化學結(jié)構(gòu)分類的固定液固定液的結(jié)構(gòu)類型極性固定液舉例分離對象烴類最弱極性角鯊?fù)?、石蠟油分離非極性化合物硅氧烷類極性范圍廣甲基硅氧烷、苯基硅氧烷、氟基硅氧烷不同極性化合物醇類和醚類強極性聚乙二醇強極性化合物酯類和聚酯中強極性苯甲酸二壬酯應(yīng)用較廣腈和腈醚中強極性氧二丙腈、苯乙腈極性化合物有機皂土分離芳香異構(gòu)體化學分類法12/6/202293極性分類法：

規(guī)定β,β’-氧二丙腈相對極性p＝100，角鯊?fù)橄鄬O性p＝0，其余固定液相對極性在0～100之間。0——————————100+1 +2 +3 +4 +5非——————————極性-1相對極性法非極性弱極性中等極性強極性12/6/2022943、常用固定液（1）非極性固定液：用于分離非極性或弱極性的物質(zhì)。如角鯊?fù)?（2）弱極性固定液：用于分離非極性或弱極性的物質(zhì)。如硅油類SE-30,XE-54,OV-1;（3）中等極性固定液：用于分離中等極性物質(zhì)。如磷酸三甲酚酯等；（4）強極性固定液：用于分離極性物質(zhì)，如β,β’-氧二丙腈。12/6/202295三、固定相的選擇（1）按相似相溶原則選擇（2）按組分性質(zhì)的主要差別選擇12/6/202296（1）按相似相溶原則選擇

固定液與被測組分極性“相似相溶”，選擇性好

非極性組分——選非極性固定液，按沸點順序出柱，低沸點的先出柱極性組分——選極性固定液，按極性順序出柱，極性強的后出非極性和極性混合物組分——選極性固定液按極性順序出柱，非極性的先出，極性組分后出形成氫鍵的組分——選極性或氫鍵型固定液按形成氫鍵能力大小，易形成氫鍵的后出

復(fù)雜的難分離物質(zhì)——選用兩種或兩種以上的混合固定液注：對于樣品極性情況未知的，一般用最常用的幾種固定液做試驗。12/6/202297（2）按組分性質(zhì)的主要差別選擇

組分的沸點差別為主——選非極性固定液按沸點順序出柱沸點低的先出柱組分的極性差別為主

——選極性固定液按極性強弱出柱極性弱的先出柱12/6/202298例如：苯和環(huán)己烷的色譜分離 苯 沸點 80.10C 環(huán)己烷 沸點 80.70C

采用非極性固定液，因組分出峰的順序由蒸汽壓決定，所以分不開；但是苯容易極化

tR(苯）/tR（環(huán)己烷）（1）用弱極性的鄰苯二甲酸二辛酯 1.5（2）用極性的聚乙二醇-400 3.9（3）用，’氧二丙氰 6.312/6/202299第六節(jié)高效液相色譜法高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）：

20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。（一）概述12/6/2022100一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻流動相依靠重力流動柱效低（H↑，n↓）分析周期長無法在線檢測12/6/20221012．HPLC：分離和分析高壓輸送流動相柱效高（H↓，n↑）分析時間大大縮短可以在線檢測，自動化程度高柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm球形12/6/2022102可在線配備高靈敏度檢測器，實現(xiàn)高自動化高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速例：（1）分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。（2）氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。高效柱效高（理論塔板數(shù)幾萬至幾十萬）高靈敏度12/6/2022103二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測

主要區(qū)別：分析對象的差別和流動相的差別

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測，占有機物的20%。

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%。1．分析對象12/6/2022104GC：流動相為惰性氣體

組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體

流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用。流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性2．流動相差別12/6/2022105

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?．操作條件差別12/6/2022106高效液相色譜儀由四部分組成：高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)

(二)高效液相色譜儀12/6/2022107高效液相色譜儀流程圖流動相進樣器高壓泵色譜柱檢測器進樣高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)12/6/2022108梯度洗脫裝置高壓泵自動進樣器柱及柱溫箱儲液瓶檢測器12/6/2022109

問題：為什么溶劑使用前必須脫氣？（1）高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、吸濾器、脫氣裝置、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。1、溶劑貯存器

溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動相。溶劑使用前必須脫氣。2、溶劑吸濾器

由Ni合金制成，孔徑約2μm，防止小顆粒進入高壓泵。3、脫氣裝置12/6/2022110流動相中溶解的氣體妨礙柱塞及單向閥的正常工作，導致輸液不準、脈流及壓力波動，影響組分保留時間和峰面積的重現(xiàn)性；氣泡進入檢測器造成檢測器噪聲增大，使基線不穩(wěn)及漂移，出現(xiàn)有規(guī)律、不正常的尖峰或平頂大峰，在梯度洗脫時尤為突出。使用熒光檢測器時，溶解氧會導致熒光猝滅，本底熒光的猝滅會造成基線漂移，樣品熒光的猝滅會影響測定結(jié)果的正確性和重現(xiàn)性。真空脫氣機常用的脫氣方法：真空脫氣法、超聲脫氣法12/6/20221114、高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。12/6/2022112例：等度洗脫和梯度洗脫流動相：A甲醇B水0-30minA∶B（30∶70，v/v）（等度洗脫）0-5min，A10%，B90%；5-25min，A10%-70%，B90%-30%25-30min，A70%-100%，B30%-0（梯度洗脫）問題：為什么要進行梯度洗脫？5、梯度洗脫裝置

梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。使保留值相差很大的多種組分在合理的時間內(nèi)能全部洗脫并達到相互分離。12/6/2022113

常用六通閥進樣，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。取樣位進樣位六通閥示意圖（2）進樣系統(tǒng)12/6/2022114

分析型色譜柱：內(nèi)徑為2~6mm，柱長為10~30cm；制備型色譜柱：內(nèi)徑為10~25mm，柱長為15~50cm；柱形多為直形內(nèi)部充滿微粒固定相柱溫一般為室溫或接近室溫（3）分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱：12/6/2022115

色譜柱使用注意事項：（1）流動相應(yīng)清潔，水溶液使用超純水配置，有機溶劑應(yīng)為色譜純或以上試劑。使用前需過濾。（2）一般色譜柱不能反沖，除非特別注明時才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。（3）避免壓力和溫度的急劇變化及機械震動。（4）正確使用流動相，尤其注意pH值影響，以免破壞固定相。（5）建議使用預(yù)柱。（6）色譜柱使用結(jié)束后應(yīng)用純?nèi)軇_洗，清除保留在色譜柱中的樣品和雜質(zhì)。反相色譜柱一般用純甲醇或乙腈保存。12/6/2022116

（4）檢測器檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。12/6/2022117一、液-固吸附色譜法(LSAC)液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。（三）高效液相色譜法的類型12/6/2022118

在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。二、液-液分配色譜法（LLPC）三、化學鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學鍵合相作為固定相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。

鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。12/6/2022119

正相鍵合相色譜與反相鍵合相色譜法

根據(jù)固定相與流動相間極性的差異，可分為正相色譜和反相色譜。正相色譜流動相極性<固定相極性反相色譜流動相極性>固定相極性反相色譜固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如C18、C8、C3、C4、苯基、苯乙基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇-水、乙睛-水、水和無機鹽的緩沖溶液等。正相色譜以極性的有機基團，CN、NH2、雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動相，分離極性化合物。固定相流動相12/6/2022120

12/6/2022121四、離子交換色譜法（IEC）此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換。12/6/2022122五、尺寸排阻色譜法（SEC）

尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。。尺寸排阻色譜滲透模型12/6/2022123六、親和色譜法（AC）

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進行選擇性分離的一種方法。

通常是在載體（無機或有機填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。12/6/2022124

要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相