高效液相色譜法操作規(guī)程

高效液相色譜法操作規(guī)程ZLSOP001700高效液相色譜法操作規(guī)程執(zhí)行日期起草審核批準部門質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部質(zhì)量負責人姓名鄭亞敏白靜史修強簽名日期分發(fā)部門質(zhì)量管理部目的：建立高效液相色譜法的操作規(guī)程，以規(guī)范操作過程，確保檢驗結(jié)果準確可日靠。適用范圍：原輔料、中藥飲片責任人：質(zhì)量管理部主任、檢驗員內(nèi)容：高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等作為流動相，用高壓輸液泵壓入裝有固定相的色譜柱中，經(jīng)進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)工作站記錄色譜圖。1適用范圍高效液相色譜法適用于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物以及離子型化合物等的定性、定量分析。中國藥典主要用于藥品的含量測定，有關(guān)物質(zhì)檢查、雜質(zhì)限度檢查和鑒別等。2儀器高效液相色譜法主要由輸出液泵系統(tǒng)、進樣器系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理機（或兼有組分收集系統(tǒng)）等組成。使用時應(yīng)按儀器的說明書進行操作。3儀器的校正3.1高效液相色譜儀的柱箱控溫精度、基線噪聲、基線漂移、靈敏度可檢測限，線性范圍的檢定均按儀器說明書的技術(shù)要求進行校驗，應(yīng)符合規(guī)定。3.2以紫外--可見光檢測器為檢測器的實驗室通用液相色譜儀的檢定，所用各種標準物質(zhì)應(yīng)使用經(jīng)國家技術(shù)監(jiān)督部門批準頒發(fā)的標準物質(zhì)。3.3泵的耐壓試驗將儀器的輸液系統(tǒng)、進樣器、色譜柱和檢測器聯(lián)接好，以甲醇為流動相，流量設(shè)為1ml/min，按說明書要求啟動儀器，待壓力平穩(wěn)后保持10min，用濾紙檢查各管路接頭處應(yīng)無濕跡。卸下色譜柱，堵住泵出口端（壓力傳感器以下），使壓力達到最大允許值的90%，保持5min，應(yīng)無泄漏。3.4泵流量設(shè)定值誤差（S3）、流量穩(wěn)定性誤差（SR）的試驗。在3.3試驗條件下，按下表設(shè)定流量，待流速穩(wěn)定后，在流動相排出口用事先清洗稱重過的容量瓶收集流動相，同時用秒表計時，準確地收集10-25min，稱重，按式(1)、⑵計算S3和SR。S3=(Fm—F3)/FX100(1)SR=(Fmax—Fmin)/FX100(2)式中：S3——流量設(shè)定值誤差，%；Fm——（W2-W1）/P.t，流量的實測值，ml/min；W2容量瓶+流動相的重量，g;W1容量瓶的質(zhì)量，g；F流量設(shè)定值，ml/min；Pi——實驗溫度下流動相的密度，g/cm3；T——收集流動相的時間，min；SR——流動相穩(wěn)定性誤差，%；Fmax同一組測量中流量最大值，ml/min；Fmin同一組測量中流量最小值，ml/min。S3和SR的校正注：流量最高值的設(shè)定可根據(jù)實驗室的要求而定。流量測量順序可以隨意選擇，但不是設(shè)定某一流量后連續(xù)測量三次，每次改變流量后至少要等5min待流量穩(wěn)定后，方可收集流動相。流量設(shè)定值：ml/min測量次數(shù)收集流動相時間：minsm,%允許誤差sx,%0.51.02.0333251510±5±3±2±3±2±24儀器使用要求4.1色譜柱的填充劑和流動相組分應(yīng)符合各品種項下規(guī)定。但因儀器型號、色譜柱牌號不同，分離效果有較大差異，故除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例以及檢測器靈敏度等均可作適當改變，以適應(yīng)具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。4.2用紫外吸收檢測器時，所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法對溶劑的要求。4.3除另有規(guī)定外，柱溫為室溫。4.4進樣量一般為數(shù)微升，除按各品種項下規(guī)定外，也可適當改變。4.5流動相及供試品溶液需用濾器過濾后使用或進樣。流動相并先經(jīng)脫氣處理后使用。4.6色譜柱保存時應(yīng)使填充劑處在潤濕狀態(tài)，兩端密塞，可根據(jù)儀器說明書要求保存。如十八烷基鍵合硅膠可在甲醇中保存等。5色譜柱5.1填充劑常用色譜柱填充劑，有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氤基或氨基鍵合硅膠也有使用。如經(jīng)試用不適合時，再選用其他填充劑。硅膠色譜柱用于正相色譜；化學(xué)鍵合固定相色譜柱，根據(jù)鍵合基團的不同可用于正相色譜或反相色譜。如十八烷基鍵合硅膠、辛基鍵合硅膠用于反相色譜或離子對色譜，氤基或氨基鍵合硅膠可用于正相或反相色譜；離子交換填充劑用于離子交換色譜。凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。5.2色譜柱性能色譜柱由柱管與填充劑（固定相）組成。采用勻漿高壓（500-1000Kg/cm2）裝柱。柱管多由不銹鋼制成，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。裝柱前，應(yīng)對整個流路進行清洗、沖淋干凈、烘干、備用。填充劑選用顆粒大小均勻，以保證良好的分離效果。分析型常量柱內(nèi)徑2-5mm，長10-30cm；半微量柱內(nèi)徑1-1.5mm，長10-20cm；實驗室制備柱內(nèi)徑20-40mm，長10-30cm；各種色譜柱使用前，按說明書要求的測試條件作柱效檢查，求出理論板數(shù)（n）及相鄰組分的分離度（R>1.5）均應(yīng)符合規(guī)定。藥品檢驗中大多數(shù)采用柱效不很高的色譜柱即可滿足要求。如儀器配有較高柱效的色譜柱可妥善保存，供必要時使用。另置一般柱效的色譜柱作日常檢驗用。6內(nèi)標物的選擇6.1內(nèi)標物應(yīng)是樣品中不含有的組分，不會使峰重疊而無法準確測量標物的峰面積。6.2內(nèi)標物的保留時間應(yīng)與待測成分相近，達到完全分離，分離度N1.5。7系統(tǒng)適用性試驗按各品種項下的要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調(diào)整，應(yīng)達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)，分離度和拖尾因子。7.1色譜柱的理論板數(shù)（n）在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，測量出供試品主要成分或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬（Wh/2），按n=5.54[tR/Wh/2]2計算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于該品種項下的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長，載體性能，色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達到要求。7.2分離度（R）定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標峰之間有較好的分離度。分離度（R）按式（5）計算：2（tR2-tR1）R=（5）W1+W2式中：tR2——相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1——相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1+W2——此相鄰兩峰的寬度。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。7.3重復(fù)性取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%，也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液：配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對標準偏差也應(yīng)不大于2.0%。7.4拖尾因子（T）色譜峰的測量，除另有規(guī)定外，可根據(jù)具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一化法或內(nèi)標法測定雜質(zhì)總量時，需采用峰面積法。為保證測量精度，特別當采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項下的規(guī)定，或不同濃度進樣時的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子（T）按式（6）計算：W0.05T=（6）2d1h式中：W0.05h——為0.05峰高處的峰寬；dl——為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95-1.05之間。當采用峰面積法測量時，則應(yīng)檢查待測峰的對稱因子（S）是否符合要求。除另有規(guī)定外，S應(yīng)在0.90?1.10之間。8測定方法按各品種項下的規(guī)定，選擇下列測定法中的一種進行。8.1內(nèi)標法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量。a）按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按式（7）計算校正因子（f）。AS/CSF=（7）AR/C式中：f——校正因子；AS——內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；AR——對照品的峰面積或峰高；CS——加入內(nèi)標物質(zhì)的濃度；CR——加入對照品的濃度。b）再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按式（8）計算含量（CX）。.一AV含量（CX）=fXAX（8）AS/CS式中：AX——供試品（或其雜質(zhì)）的峰面積或峰高；CX——供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；f、AS、CS——的意義同式（7）c）色譜峰的測量，也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于規(guī)定濃度80%、100%和120%的對照品溶液。加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成三份不同濃度的溶液，分別注樣3次，計算平均校正因子。d）當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標物質(zhì)溶液時，則配制內(nèi)標物質(zhì)溶液時不必精密稱（量）取。e）用內(nèi)標法測定時，試樣和內(nèi)標物質(zhì)的相對響應(yīng)有兩種表示方法，即校正因子（f）或相對響應(yīng)值（s），兩者是倒數(shù)關(guān)系。中國藥典采用校正因子、商品積分儀兩種計算方法都有，使用時應(yīng)予注意。8.4外標法測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量a）按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品配成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積或峰高，按式（9）計算含量。AX含量CX=CRX（9）AX式中：各符合表示同式（7）、（8）。b）由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標冰法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時，以定量環(huán)進樣為好。9結(jié)果計算與制定9.1除另有規(guī)定外，高效液相色譜法作為藥品的鑒別，主要采用供試品與對照品在同一條件下記錄色譜圖進行對比的方法。供試品峰的保留時間應(yīng)與對照品峰的保留時間一致。9.2作為藥品的雜質(zhì)限度檢查或含量測定，除另有規(guī)定外，測量供試品，對照品或內(nèi)標物質(zhì)的色譜峰面積（或峰高）。外標法按8.4式（9）計算含量。內(nèi)標法（加校正因子）按式（7）、（8）計算含量。內(nèi)標法（不加校正因子）按式10）、（11）計算含量。A1/AS含量C1（%）=XCr（10）A2/AS對于正常峰，可用峰高h代替峰面積A計算含量。h1/hS含量C1（%）=XCr（11）hr/hS式中：C1——供試品濃度，%；Cr——對照品濃度，%；A1——供試品峰面積；Ar——對照品峰面積；As——內(nèi)標物質(zhì)峰面積；h1供試品峰高；hr對照品峰高；hs——內(nèi)標物質(zhì)峰高。9.3用峰高法測量色譜峰，按7.3式（6）計算拖尾因子（T）是否符合該品種項下的規(guī)定，再計算含量。分離度（R）是否符合7.2的要求。9.4含量測定的精度，除另有規(guī)定外，其相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。10清洗和關(guān)機10.1分析完畢后，先關(guān)檢測器和數(shù)據(jù)處理機，再用經(jīng)濾過和脫氣的適當溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用過含鹽流動相，則先用水，然后用甲醇一水沖洗。10.2沖洗前先用流動相沖洗濾器，再把濾器浸入流動相中，啟動泵。10.3打開泵的排放閥，用專用注射器從閥口抽出流動相約20ml，設(shè)置高流速或用沖洗鍵"PURGE”進行充泵排氣，觀察出口處流動相呈連續(xù)液流后，將流速逐步回零或停止“STOP”沖洗，關(guān)閉排放閥。10.4再用分析流速沖洗，各種沖洗一般沖洗15?30分鐘，特殊情況應(yīng)延長沖洗時間。10.5沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進樣器也應(yīng)用相應(yīng)的溶劑沖洗，可使用進樣閥所附專用沖洗接頭。10.6關(guān)斷電源，作好使用記錄，內(nèi)容包括日期，檢品，色譜柱，流動相，柱壓，使用小時數(shù)，儀器完好狀態(tài)等。11注意事項11.1色譜柱與進樣器及其出口端與檢測器之間應(yīng)為無死體積連接，以免試樣擴散影響分離。11.2新柱或被污染柱用適當溶劑沖洗時，應(yīng)將其出口端與檢測器脫開，避免污染。11.3使用的流動相應(yīng)與儀器系統(tǒng)的原保存溶劑互溶，如不互溶，則先取下上次的色譜柱，照（10.2?10.3）的方法用異丙醇沖洗過渡，進樣器和檢測器的流通池也注入異丙醇進行過渡，過渡完畢后，接上相應(yīng)的色譜柱，換上本次使用的流動相，再按（10.2）的順序操作。11.4壓力表無壓力顯示或壓力波動時不能進行分析，應(yīng)檢查泵中氣泡是否已排除，各連結(jié)處有無漏液，排除故障后方能進行操作。如壓力升高，甚至自動停泵，應(yīng)檢查柱端有無污染堵塞，可小心卸開柱的進口端螺帽，挖出被污染填沖劑后，補入同類填充劑，仔細安裝好，再進行操作。11.5發(fā)現(xiàn)記錄基線波動，出現(xiàn)毛刺等現(xiàn)象，首先應(yīng)檢查檢測器流通池中是否有氣泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘燈穩(wěn)定，同時檢查儀器的按地是否良好，必要時，換上新的氘燈。儀器穩(wěn)定后方能進行操作。11.6進樣前，色譜柱應(yīng)用流動相充分沖洗平衡，如系統(tǒng)適用懷不符合規(guī)定，或填充劑已損壞，則應(yīng)更換新的同類色譜柱進行分析，由于同類填充劑的化學(xué)鍵合相的鍵合度及性能等存在一定差異，往往體育活動操作達不到預(yù)定的分離時，可更換另一牌號的同類色譜柱進行試驗。11.7以硅膠作載體的化學(xué)鍵合相填充劑的穩(wěn)定性愛流動相受pH值的影響，使用時，應(yīng)詳細參閱該柱的說明書，在規(guī)定的pH值