DB42T1843-2022牛結(jié)核病多方法聯(lián)合診斷規(guī)程

ICS65.020CCSB10

DB42湖 北 省 地 方 標 準DB42/T1843—2022牛結(jié)核病多方法聯(lián)合診斷規(guī)程Codeofpracticeofmultiplediagnostictestsforbovinetuberculosis20222022032320220523湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布目次前言 III引言 V1范圍 12規(guī)性用件 13術(shù)和義 14縮語 15單內(nèi)態(tài)和ELISA抗檢法合 26ELISA體測和IFN-γ外放聯(lián)合 27單內(nèi)態(tài)應(yīng)比皮內(nèi)態(tài)應(yīng)合 38單內(nèi)態(tài)和IFN-γ外放聯(lián)合 49臨剖和或菌和PCR檢分法合 410物全作求 6前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學、湖北勁牛牧業(yè)有限公司、高安市裕豐農(nóng)牧有限公司。本文件實施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話bsnab@126.com；對本文件的有關(guān)修改意見建議請聯(lián)系華中農(nóng)業(yè)大學，電話郵箱：chenyingyu@。引 言（BovineTuberculosis）（2012-2020年（、IFN-γELISAPCRhELISAPCR為了在現(xiàn)有技術(shù)條件下提升牛結(jié)核病檢測的敏感性和特異性，最大限度地減少假陽性牛錯殺和假陰為了在現(xiàn)有技術(shù)條件下提升牛結(jié)核病檢測的敏感性和特異性，最大限度地減少假陽性牛錯殺和假陰結(jié)核病多方法聯(lián)合診斷規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牛結(jié)核病多方法聯(lián)合診斷規(guī)程中的單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和ELISA抗體檢測法聯(lián)合、ELISA抗體檢測法和IFN-γ體外釋放法聯(lián)合、單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)聯(lián)合、單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ體外釋放法聯(lián)合、臨床剖檢和/或細菌培養(yǎng)和PCR檢測分型法聯(lián)合以及生物安全要求等。本文件適用于牛結(jié)核病檢疫、監(jiān)測和凈化過程中的診斷。（GB/T18088GB/T18645-2020GB19489GB/T32945-2016牛結(jié)核病診斷體外檢測γ干擾素法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。GB/T32945-2016牛結(jié)核病診斷體外檢測γ干擾素法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1牛結(jié)核病bovinetuberculosis3.2個體流行率individualprevalence一段時間內(nèi)某群體中患病的動物總數(shù)與同時間該群體暴露動物數(shù)之比。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DMSO：二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附測定（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）IFN-γ：伽馬干擾素（Interferon-γ）PCR：多聚酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和ELISA同時具備臨床檢測和實驗室檢測操作條件，且牛結(jié)核病個體流行率小于3%的場群。按照GB/T18645-2020中6.3.1（檢ELISA單皮試法檢測為陽性，或ELISA抗體檢測法檢測為陽性的牛均判為結(jié)核陽性。ELISA單皮試法和ELISA抗體檢測法聯(lián)合診斷流程如圖1所示。圖1單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和抗體檢測法聯(lián)合診斷流程圖6ELISA抗體檢測法和IFN-γ體外釋放法聯(lián)合具備實驗室檢測操作條件，且牛結(jié)核病個體流行率小于3%的場群。ELISA32945-2016中4.3IFN-γELISA抗體檢測法檢測為陽性，或IFN-γ體外釋放法檢測為陽性的牛均判為結(jié)核陽性。ELISAIFN-γELISA抗體檢測法和IFN-γ體外釋放法聯(lián)合診斷流程如圖2所示。圖2ELISAIFN-γ不具備實驗室檢測操作條件，且牛結(jié)核病個體流行率大于等于3%的場群。按照GB/T18645-2020中6.3.1GB/T18645-2020中6.3.1檢單皮試法和比較皮試法檢測均為陽性的牛判為結(jié)核陽性。單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)聯(lián)合診斷流程如圖3所示。圖3單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)聯(lián)合診斷流程圖單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ牛場具備實驗室檢測操作條件，且牛結(jié)核病個體流行率大于等于3%的場群。按照GB/T18645-2020中6.3.1GB/T32945-20164.3IFN-γ單皮試法和IFN-γ體外釋放法檢測均為陽性的牛判為結(jié)核陽性。單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ單皮試法結(jié)合IFN-γ體外釋放法檢測聯(lián)合診斷流程如圖4所示。圖4單皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ體外釋放法聯(lián)合診斷流程圖9臨床剖檢和/或細菌培養(yǎng)和PCR檢測分型法聯(lián)合屠宰場宰殺?；虿∷琅＃蛐枰M行牛結(jié)核病臨床剖檢、細菌培養(yǎng)或PCR檢測分型的牛。GB/T27639-20117PCRPCR牛結(jié)核病細菌分離培養(yǎng)工作需要在生物安全三級實驗室進行。按照GB/T18645-2020動物結(jié)核病診斷技術(shù)中步驟5.5進行牛結(jié)核病細菌的分離培養(yǎng)。PCR依照商品化核酸提取試劑盒的使用說明進行樣本的處理，并提取組織內(nèi)核酸，直接用于PCR檢測或儲存于-80℃條件下備用。PCRPCRPCR表16SrRNARv0577IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120PCRPCR個PCR1～72×TaqMixture12.5μL，模板1μL1～710各1μL1～7PCR25μLPCR將本文件中7個PCR反應(yīng)管放置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)程序進行擴增：94℃10min，進入循環(huán)擴增階段：94℃1min，60℃1min，72℃1min，循環(huán)30次，最終72℃10min。PCR核酸序列引物1（16SrRNA）上游引物5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’下游引物5’-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’引物2（Rv0577）上游引物5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’下游引物5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’引物3（IS1561）上游引物5’-GCTGGGTGGGCCCTGGAATACGTGAACTCT-3’下游引物5’-AACTGCTCACCCTGGCCACCACCATTGACT-3’引物4（Rv1510）上游引物5’-GTGCGCTCCACCCAAATAGTTGC-3’下游引物5’-TGTCGACCTGGGGCACAAATCAGTC-3’引物5（Rv1970）上游引物5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’下游引物5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’引物6（Rv3877/8）上游引物5’-CGACGGGTCTGACGGCCAAACTCATC-3’；下游引物5’-CTTGCTCGGTGGCCGGTTTTTCAGC-3’引物7（Rv3120）上游引物5’-GTCGGCGATAGACCATGAGTCCGTCTCCAT-3’下游引物5’-GCGAAAAGTGGGCGGATGCCAGAATAGT-3’將PCR1，120V，100mA30min1-7PCR和4041～7號管PCR號PCRPCR表2PCRPCR結(jié)果記錄結(jié)果判定引物1引物2引物3引物4引物5引物6引物7PCR產(chǎn)物+------分枝桿菌屬+++++++結(jié)核分枝桿菌+++--+-牛分枝桿菌++++-+-山羊分枝桿菌+++----牛分枝桿菌卡介苗-------分枝桿菌屬陰性9.3結(jié)果判定臨床剖檢有疑似結(jié)核結(jié)節(jié)，且PCR檢測和分型結(jié)果為陽性的牛判為結(jié)核陽性。9.4臨床剖檢和/或細菌培養(yǎng)和