流式細(xì)胞術(shù)的基本原理與應(yīng)用簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞術(shù)的基本原理與應(yīng)用簡(jiǎn)介余琪琪12-09-2011第一頁(yè)，共三十九頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）就是對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第二頁(yè)，共三十九頁(yè)。流式細(xì)胞儀工作原理示意圖第三頁(yè)，共三十九頁(yè)。流式細(xì)胞儀可提供的信息物理信息：通過(guò)散射光信號(hào)反映熒光信息：通過(guò)熒光信號(hào)反映第四頁(yè)，共三十九頁(yè)。散射光信號(hào)的產(chǎn)生488nm激光產(chǎn)生散射光SSCFSC第五頁(yè)，共三十九頁(yè)。前向角散射光信號(hào)（FSC）第六頁(yè)，共三十九頁(yè)。側(cè)向角散射光信號(hào)（SSC）第七頁(yè)，共三十九頁(yè)。利用散射光信號(hào)對(duì)混合細(xì)胞分群紅細(xì)胞裂解的全血第八頁(yè)，共三十九頁(yè)。熒光信號(hào)的產(chǎn)生第九頁(yè)，共三十九頁(yè)。熒光信號(hào)的表示方法雙參數(shù)點(diǎn)圖單參數(shù)直方圖第十頁(yè)，共三十九頁(yè)。一個(gè)完整的流式實(shí)驗(yàn)流程樣品的準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的選擇對(duì)照設(shè)置儀器條件的確定數(shù)據(jù)分析第十一頁(yè)，共三十九頁(yè)。樣品準(zhǔn)備血液或骨髓標(biāo)本體液、灌洗液、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞貼壁細(xì)胞組織標(biāo)本單細(xì)胞懸液，濃度51051106/mL第十二頁(yè)，共三十九頁(yè)。樣本流速的選擇高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低.低流速：一般用于對(duì)分辨率要求較高的分析，如DNA分析。

（注：根據(jù)制備樣本濃度隨時(shí)調(diào)整流速）第十三頁(yè)，共三十九頁(yè)。熒光標(biāo)記抗體的選擇盡量使用直標(biāo)抗體多色標(biāo)記時(shí)應(yīng)該增加各種抗體的用量或適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型及熒光素的光譜選擇熒光抗體根據(jù)檢測(cè)物（抗原）表達(dá)量選擇熒光染料使用雙標(biāo)以上抗體需要做熒光補(bǔ)償?shù)谑捻?yè)，共三十九頁(yè)。流式細(xì)胞儀型號(hào)：BDFACSCantoII光學(xué)信號(hào)的產(chǎn)生：激光（488nm，633nm）光學(xué)信號(hào)的收集：光學(xué)濾片光電倍增管（PMT）：將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)第十五頁(yè)，共三十九頁(yè)。FACSCantoII的光學(xué)濾片長(zhǎng)通濾片（Longpass，LP）帶通濾片（Bandpass，BP）LP500500/50第十六頁(yè)，共三十九頁(yè)。750-810nm650-670nmFACSCantoII信號(hào)檢測(cè)組件第十七頁(yè)，共三十九頁(yè)。常見熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度：APC>PE>PE-Cy7>FITC每個(gè)通道只能選擇一種熒光素各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配搭配的熒光素之間的發(fā)射光譜重疊盡量小第十八頁(yè)，共三十九頁(yè)。第十九頁(yè)，共三十九頁(yè)。對(duì)照設(shè)置陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照補(bǔ)償對(duì)照第二十頁(yè)，共三十九頁(yè)。陰性對(duì)照空白對(duì)照：即不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞。主要用于確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值同型對(duì)照：即用同型抗體作平行實(shí)驗(yàn)。同型抗體為沒(méi)有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2。

第二十一頁(yè)，共三十九頁(yè)。陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽(yáng)性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。通常用于檢測(cè)抗體是否有問(wèn)題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性第二十二頁(yè)，共三十九頁(yè)。補(bǔ)償對(duì)照補(bǔ)償對(duì)照:多色熒光分析，進(jìn)行熒光補(bǔ)償將用于多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本反應(yīng)，一一進(jìn)行單色標(biāo)記，以測(cè)定熒光信號(hào)的重疊并做適當(dāng)調(diào)整第二十三頁(yè)，共三十九頁(yè)。儀器條件的確定電壓閾值熒光補(bǔ)償（多色分析）第二十四頁(yè)，共三十九頁(yè)。電壓PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，調(diào)整PMT的電壓，信號(hào)強(qiáng)度將隨之改變。放大器兩種放大方式：線性放大（lin）對(duì)數(shù)放大（log）光信號(hào)光電倍增管（PMT）放大器電信號(hào)第二十五頁(yè)，共三十九頁(yè)。線性放大（lin）按光強(qiáng)度的線性關(guān)系輸出信號(hào)（FSC、SSC、細(xì)胞周期檢測(cè)等）第二十六頁(yè)，共三十九頁(yè)。對(duì)數(shù)放大（log）按光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)關(guān)系輸出信號(hào)，用于大多數(shù)熒光染色實(shí)驗(yàn)第二十七頁(yè)，共三十九頁(yè)。閾值（threshhold）屏蔽噪音信號(hào)和碎片信號(hào)第二十八頁(yè)，共三十九頁(yè)。熒光補(bǔ)償采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差第二十九頁(yè)，共三十九頁(yè)。補(bǔ)償公式通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%。RD1-X%FITC第三十頁(yè)，共三十九頁(yè)。補(bǔ)償模型PE-X%FITC橫平豎直第三十一頁(yè)，共三十九頁(yè)。補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程樣本準(zhǔn)備：陰性樣本，單陽(yáng)性樣本調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有PMT

第二步：?jiǎn)侮?yáng)性樣本調(diào)整補(bǔ)償自動(dòng)調(diào)補(bǔ)償手動(dòng)調(diào)補(bǔ)償?shù)谌?yè)，共三十九頁(yè)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：橫平豎直第三十三頁(yè)，共三十九頁(yè)。數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示方式：?jiǎn)螀?shù)直方圖二維散點(diǎn)圖二維等高線圖假三維圖三維圖列表模式設(shè)門：在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。第三十四頁(yè)，共三十九頁(yè)。單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點(diǎn)圖二維等高圖Pseudo3DPlot3DPlot密度圖假三維圖三維圖第三十五頁(yè)，共三十九頁(yè)。設(shè)門設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)第三十六頁(yè)，共三十九頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞生理學(xué)研究（細(xì)胞相對(duì)大小和顆粒性、胞內(nèi)pH值檢測(cè)、Ca2+流動(dòng)性檢測(cè)、膜電勢(shì)檢測(cè)、細(xì)胞活性檢測(cè)、細(xì)胞活力的檢測(cè)）細(xì)胞膜表面標(biāo)記胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞周期分析凋亡分析CBA（CytometricBeadArray）第三十七頁(yè)，共三十九頁(yè)。謝謝！第三十八頁(yè)，共三十九頁(yè)。內(nèi)容梗概流式細(xì)胞術(shù)的基本原理與應(yīng)用簡(jiǎn)介。12-09-2011。流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）就是對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。熒光信息：通過(guò)熒光信號(hào)反映。體液、灌洗液、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。低流速：一般用于對(duì)分辨率要求較高的分析，如DNA分析。根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型及熒光素的光譜選擇熒光抗體。型號(hào)：BDFACSCantoII。熒光強(qiáng)度：APC>PE>PE-Cy7>FITC。搭配的熒光素之間的發(fā)射光譜重疊盡量小。同型抗體為沒(méi)有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2。陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽(yáng)性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)償對(duì)照:多色熒光分析，進(jìn)行熒光補(bǔ)償。PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，調(diào)整PMT的電壓，信號(hào)強(qiáng)度將隨之改變。（FSC、SSC、細(xì)胞周期檢測(cè)等）。屏蔽噪音信號(hào)和碎片信號(hào)。采用合適的方法