蛋白質(zhì)工程原理簡介

第十一章蛋白質(zhì)工程原理簡本章主要內(nèi)容蛋白質(zhì)工程的定義蛋白質(zhì)工程的主要研究內(nèi)容蛋白質(zhì)工程的主要研究方法蛋白質(zhì)分子設(shè)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用舉一、什么是蛋白質(zhì)工術(shù)，或利用工程，對天然存在的蛋白質(zhì)（多二、蛋白質(zhì)工程的主要研究★蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，包括一級、二級、超二級、結(jié)構(gòu)★蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系★根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)規(guī)律和預(yù)期功能，設(shè)計目的蛋★目的蛋白的提取純化及其結(jié)構(gòu)與功能的鑒定三、蛋白質(zhì)工程的主要研究蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)測定★蛋白質(zhì)理化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)功能的分析方法蛋白質(zhì)的分子設(shè)計方法★目的蛋白的修飾或改造方法★目的蛋白的獲取方法 表達(dá)、化學(xué)合成四、蛋白質(zhì)分子設(shè)(一)蛋白質(zhì)分子闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次之間的相互關(guān)系探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，特別是結(jié)構(gòu)的形成規(guī)律解析蛋白質(zhì)折疊的分為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究提供改造天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，獲得符合需要的蛋為創(chuàng)造全新的蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)(二)蛋白質(zhì)分子內(nèi)核假設(shè)：蛋白質(zhì)內(nèi)核中側(cè)鏈的相互作用決定其獨(dú)特的折疊形式。內(nèi)核是指白在化形的守區(qū)。通常情況下，內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元組成。所有氫鍵都是最大滿足的，包括主鏈和側(cè)鏈對于金屬蛋白質(zhì)，圍繞金屬中心的第二殼層的相互作用是重要的!因?yàn)樵S多氨基酸含有疏水及親水基團(tuán)應(yīng)合理地分布在溶劑可及與不可及的表面結(jié)構(gòu)及功能的專一性。這是蛋白質(zhì)分子設(shè)計 的問題蛋白質(zhì)分子設(shè)計涉及到的重要技術(shù)由于工程的發(fā)展，真核表達(dá)技術(shù)的發(fā)展使了新的生物活性物質(zhì)源。即：目的表達(dá)方法的工程變得快速、容易計算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)設(shè)計中占有重要位置。建預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。(三)蛋白質(zhì)分子突突變蛋白產(chǎn)功能分構(gòu)計算機(jī)模蛋白質(zhì)分子設(shè)計MEVVP2AA—CPVVP2AA共11個AA不同，分別是位性KR堿性——堿KN堿性正電荷—極性不帶VA疏水——疏VI疏水——疏PA脯氨酸——疏DN酸性負(fù)電荷—極性不帶DY酸性負(fù)電荷—極性不帶AE疏水——酸性負(fù)電LV疏水——疏NS極性不帶電—極性不帶AG疏水——甘氨注：93、300、323、367、411、568位氨基酸性質(zhì)改變PyMol軟件預(yù)測MEVVP2各突變體的三級結(jié)AMEVBAMEVBMEVVP2323367411CMEVVP2criticalDMEVVP2323367564基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)以天然蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及功能（穩(wěn)定性）知識為基礎(chǔ)（PDB及相關(guān)數(shù)據(jù)庫可提供大量參考信息術(shù)，推測其可能的改造后的結(jié)構(gòu)與功能。然后 工程技術(shù)或人工合成技術(shù)獲得這種改造后的新白質(zhì)，并用實(shí)驗(yàn)的方法測定其結(jié)構(gòu)與功能如未達(dá)到要求，再重復(fù)上述過程，直至滿足需要設(shè)計目標(biāo)與解決設(shè)計目 解決方熱穩(wěn)定 引入二硫鍵；增加氫鍵數(shù)目；改 疏水堆積增加表面鹽橋?qū)ρ趸姆€(wěn)定 將 Ala、 Gln、Val、及Leu、 對重金屬的穩(wěn)定性 Ala、 Gln、Val、及Leu替代表面羧基pH穩(wěn)定 替換表面荷電基團(tuán)；分子內(nèi)His、Cys及Tyr的置換內(nèi)離子對的置換提高酶學(xué)性 專一性改變；增加逆轉(zhuǎn)數(shù)；改變酸堿度以天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行分子設(shè)計的具體步驟從天然蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)出發(fā)，利用計算機(jī)模擬技術(shù)確定殊扭角的氨基酸、鹽橋和密堆積區(qū)等。的關(guān)系、生物化學(xué)或蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)及結(jié)構(gòu)上考慮應(yīng)其余位置對所希望改變的影響當(dāng)進(jìn)行互換或/刪除殘基時，應(yīng)考慮它們對結(jié)構(gòu)特征及功能的影響。應(yīng)遵循以下原則：氨基酸側(cè)鏈的改變不影響該主鏈的折疊，／除些分影表區(qū)。側(cè)鏈交換遵守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守原則。以天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行的分子設(shè)計，可以的活性，改善其藥效動力學(xué)性質(zhì)那么，人們能否根據(jù)自己意愿，設(shè)計獲得具有全能的蛋白質(zhì)呢例如：離子通道納米管，血紅素結(jié)合蛋白，氧化白，DNA結(jié)合蛋全新蛋白質(zhì)分子設(shè)計是另外一種蛋白質(zhì)工程，即合成具有新的更優(yōu)良的結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)。全新蛋白質(zhì)分子設(shè)計：從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計和從頭功能蛋白質(zhì)的從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計合成一個全新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中心問題是設(shè)計一個具有穩(wěn)定和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。相互作用能大于構(gòu)象熵。（越大，反映了它的無序程度越大，所處的狀態(tài)越穩(wěn)定。物質(zhì)系統(tǒng)自發(fā)的變化過程總是向熵增大的方向進(jìn)行。）全面了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的規(guī)律是進(jìn)行蛋白質(zhì)全新分子設(shè)計的關(guān)鍵。特別是二級結(jié)構(gòu)的形成規(guī)律。目前，許多蛋白質(zhì)的分子設(shè)計都是基于對二級結(jié)構(gòu)的認(rèn)識進(jìn)行的。蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)示意a.ααb.βββc.βαβ組A:αα；B:βxβ；C:βαβαβ；D、E:單雙向β-折疊；F：β-迂回；G：回型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)左為PrPC；右為具體方法有二級結(jié)構(gòu)單元的自組優(yōu)點(diǎn)：設(shè)計簡單；容易合成問題：穩(wěn)定性差配體誘導(dǎo)組可利用與配體如金屬離子結(jié)合的特點(diǎn)，誘導(dǎo)多個二級構(gòu)如雙親性α-螺旋自組裝通過共價交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自利用二硫鍵或其他方式將幾個二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)連接，降低構(gòu)象熵基于組合庫的全新蛋白質(zhì)分子設(shè)-螺旋；-穩(wěn)定性；結(jié)合輔因子的能力；催化活性。在合成模板上肽的組線性多肽折疊為球狀結(jié)蛋白質(zhì)的從頭功能設(shè)通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能鍵合及催化的從頭設(shè)計在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計膜蛋白及離子通道的設(shè)計新材料的設(shè)計(四)蛋白質(zhì)分子設(shè)計中的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定突變的殘功能殘基的鑒定方隨機(jī)突變或刪除分接頭(linker)掃描突變利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘結(jié)構(gòu)與功能的(五)蛋白質(zhì)工程的基本問題改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本途以同源蛋白為模型推測突變體蛋白的空間構(gòu)象突變一系列有結(jié)構(gòu)傾向的氨基酸以改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類型從熱力學(xué)第一定律出發(fā)設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的基本途降低折疊與非折疊的熵差穩(wěn)定α-螺旋填充疏水內(nèi)核蛋白質(zhì)工程的與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的形成過程相比較，蛋白質(zhì)工程是一個反向構(gòu)尋求最適氨基酸序列。要做到這一點(diǎn)，就要求有先進(jìn)的計算機(jī)精確過程。但這是一個目前還沒有解決的基本問題。分子生物學(xué)過Transcription moleculardesign 五、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用舉應(yīng)用實(shí)例工程抗體組織型纖溶酶原（tPA）的改造抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能（一 工程抗Figure24.1Humoralimmunityisconferredbythebindingoffreeantibodiesto formantigen-antibodycomplexesthatareremovedfromthebloodstreambymacrophagesorthatareattackeddirectlybythecomplementproteins.Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanwithseveraldiscretes.Eachantibodyisanimmunoglobulintetramerconsistingoftwoidenticallightchains(L)andtwoidenticalheavychains(H).Ifanylightchaincanassociatewithanyheavychain,toproduce106~108potentialantibodiesrequires103~104differentlightchainsand103~104differentheavychains.蛋白質(zhì)分子剪裁例證：小鼠McAb的人源化三、存在的問題：半衰期短，特異性較四、可以在以下五個方面對tPA進(jìn)行改延長半衰期——長效增加纖維蛋白的特異性減少血漿中抑制劑對tPA的抑制提高tPAGF蛋白