細(xì)胞培養(yǎng)工程 02A 相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)課件

11生物加工常用動(dòng)物細(xì)胞來源

種屬細(xì)胞類型

組織來源WI-38MRC-5FS-4HEK293VeroMDCKNS/SP2/0CHOBHK人人人人猴狗小鼠中國倉鼠敘利亞倉鼠成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞淋巴樣細(xì)胞上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞

肺肺包皮腎腎腎骨髓瘤卵巢腎Wei-ShouHu：CellCultureBioprocessing22盡管脊椎動(dòng)物約有200種不同細(xì)胞類型，用于生物藥物生產(chǎn)的主要有兩類，即上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；目前用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)生產(chǎn)的細(xì)胞株主要是上皮細(xì)胞（如CHO）和淋巴細(xì)胞（如NS0）；成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞常用于病毒疫苗生產(chǎn)（病毒制備）；上皮細(xì)胞：位于皮膚或腔道表皮，隨所在器官有所不同，形成組織邊界；易受損，需要不斷更新，因此生長活躍；成纖維細(xì)胞：疏松結(jié)蹄組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來；通常處于休眠狀態(tài)，在刺激因素下才會(huì)遷移至受損部位并開始增殖；淋巴細(xì)胞：已分化淋巴細(xì)胞具有較短的生命周期。生物加工常用動(dòng)物細(xì)胞來源33動(dòng)物細(xì)胞的尺度

細(xì)胞類型

體積

(m3)

直徑

(m)雜交瘤內(nèi)皮細(xì)胞中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO,懸浮)

中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO,貼壁）人包皮成纖維細(xì)胞(FS-4)1400-25001200-18001300-1800700012-2017約1455物理化學(xué)現(xiàn)象（雙層脂質(zhì)體）磷脂親水頭部向外，脂肪酸疏水尾端排列緊致，組裝形成能夠阻止物質(zhì)自由進(jìn)出的屏障，隔離細(xì)胞內(nèi)、外水溶性環(huán)境，并進(jìn)一步將細(xì)胞器與胞漿隔離；呈流體狀態(tài)，受不飽和脂肪酸含量影響，隨著溫度降低可以變?yōu)槟z狀（液晶）；飽和脂肪酸使疏水屏障更致密，不飽和脂肪酸雙鍵降低疏水屏障的致密度、提高膜的流動(dòng)性；MolecularCellBiology(5thEd.)byLodishetal.細(xì)胞膜–磷脂雙分子層膽固醇與磷脂相互作用，起到穩(wěn)定雙分子層親水區(qū)域的作用，提高磷脂雙分子層對小分子物質(zhì)的滲透性，但降低流動(dòng)性；膽固醇主要存在于細(xì)胞膜，在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中含量非常低。66膜蛋白質(zhì)膜蛋白是細(xì)胞膜的重要組成部分，其生物學(xué)功能包括接受外界信號(hào)分子的受體蛋白、負(fù)責(zé)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白、通道蛋白以及催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶蛋白等；膜蛋白質(zhì)含量典型細(xì)胞膜：約50%，脂類與蛋白分子數(shù)量約為50比1線粒體膜：約75%；消耗ATP，Na+/K+ATPase泵出三個(gè)Na+，泵入兩個(gè)K+細(xì)胞膜跨膜電壓為-80mV；線粒體膜跨膜電壓為-140mV；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部為氧化環(huán)境，外部（胞漿）為還原環(huán)境細(xì)胞內(nèi)外各種跨膜化學(xué)勢、電勢（電壓）、氧化還原電勢的維持有賴于膜蛋白的功能，也是細(xì)胞生物力能學(xué)的基礎(chǔ)。7細(xì)胞膜的通透性8膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制:離子與多數(shù)物質(zhì)1010真核細(xì)胞胞內(nèi)功能區(qū)域界定真核細(xì)胞：核膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：胞內(nèi)生理化學(xué)反應(yīng)高度空間區(qū)域化和組織化細(xì)胞器：細(xì)胞核、線粒體、高爾基體等轉(zhuǎn)運(yùn)：囊泡（vesicles）意義：提供大量表面積提高跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)效率化學(xué)加工場所經(jīng)濟(jì)效益MolecularCellBiology(5thEd.)byLodishetal.12細(xì)胞內(nèi)四種基本分子遺傳過程1414真核細(xì)胞胞內(nèi)功能區(qū)域界定胞內(nèi)游離分子的擴(kuò)散布朗運(yùn)動(dòng)Einstein’sEquation：

x=(2Dt)1/2x游離分子位移尺度t擴(kuò)散時(shí)間D游離分子在特定介質(zhì)中的擴(kuò)散系數(shù)1515細(xì)胞生長周期(1)MolecularCellBiology(5thEd.)byLodishetal.1616細(xì)胞周期G1SG2M周期蛋白（Cyclin）調(diào)節(jié)周期蛋白依賴性激酶周期性出現(xiàn)與消失周期蛋白依賴性激酶（CDK）決定進(jìn)入休眠（G0）或S然后細(xì)胞接受外源生長刺激細(xì)胞生長周期(2)1717細(xì)胞特征

大小、表面粗糙度、表面抗原細(xì)胞分離與克隆細(xì)胞生長周期(3)18環(huán)境滲透壓對細(xì)胞的影響2020細(xì)胞貼壁培養(yǎng)細(xì)胞獲?。旱鞍酌福ㄒ鹊鞍酌?，膠原酶/Ca2+）豬胰蛋白酶，重組胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑：血清/抑肽酶貼壁細(xì)胞主要類型：成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞游走型細(xì)胞主要問題：血清成本蛋白質(zhì)成分生物污染

2121細(xì)胞培養(yǎng)物（1）原代培養(yǎng)物建立原代細(xì)胞培養(yǎng)是將取自動(dòng)物組織的細(xì)胞直接接種于生長培養(yǎng)基里。在無菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無菌培養(yǎng)。皮膚、雞胚、淋巴、鼠腦等都是常用的原代培養(yǎng)物，用于研究、治療和生產(chǎn)疫苗等。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞類型，它們的生長速率各不相同，成纖維細(xì)胞最易生長，常會(huì)在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢。仔細(xì)控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類型的生長。23細(xì)胞培養(yǎng)物（2）正常細(xì)胞正常的原代培養(yǎng)物進(jìn)行傳代形成繼代培養(yǎng)物，在一定代數(shù)范圍內(nèi)保持正常細(xì)胞特征二倍體染色體互補(bǔ)沒有明顯基因改變有限的壽命反映了細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)細(xì)胞無惡性，表現(xiàn)在將該細(xì)胞注入免疫抑制動(dòng)物不能形成腫瘤貼壁依賴和密度抑制表明其增殖受到控制，當(dāng)細(xì)胞在介質(zhì)表面生長至匯合單層時(shí)增殖就停止正常細(xì)胞系（如WI-38等）安全而被廣泛用于人用疫苗的生產(chǎn)增殖能力是有限的，最多只可傳代培養(yǎng)50代左右細(xì)胞的壽命是有儲(chǔ)存記憶功能的，如人胚組織的細(xì)胞在增殖2代時(shí)儲(chǔ)存于液氮，當(dāng)重新復(fù)蘇培養(yǎng)后，它只能再增殖30代左右24細(xì)胞培養(yǎng)物（3）轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常細(xì)胞在培養(yǎng)中經(jīng)過轉(zhuǎn)化過程，喪失了對生長控制的敏感性，獲得無限增殖的能力，成為連續(xù)細(xì)胞系。細(xì)胞轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。貼壁依賴性細(xì)胞對貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍須貼壁生長，但可能生長到不止單層。應(yīng)當(dāng)注意的是，并非所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞都是惡性的。細(xì)胞轉(zhuǎn)化的四種主要途徑：自發(fā)轉(zhuǎn)化：易發(fā)生于嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，可能由內(nèi)源性病毒引起；化學(xué)轉(zhuǎn)化：某些致癌化學(xué)物會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率，如甲基膽蒽；病毒轉(zhuǎn)化：許多病毒（如腫瘤相關(guān)病毒）會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率；致瘤因子轉(zhuǎn)化：腫瘤細(xì)胞分泌，引起細(xì)胞染色體變化。主要生物制品生產(chǎn)工具：轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用來生產(chǎn)生物制品，如重組蛋白質(zhì)藥物、病毒疫苗等。2626主要細(xì)胞系CHO（中國倉鼠狼瘡細(xì)胞）：1957年建株，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，上皮細(xì)胞型，一般需貼壁生長，但并不嚴(yán)格，可以懸浮培養(yǎng)，Kl亞克隆廣泛使用。其四氫葉酸還原酶缺陷型（DG44）是用得最多的基因工程宿主細(xì)胞，表達(dá)EPO、tPA、HBsAg、抗體藥物等許多種重組蛋白質(zhì)。

NS0：小鼠雜交瘤細(xì)胞，無抗體分泌，其NS0-GS細(xì)胞株是目前抗體藥物商業(yè)化生產(chǎn)的主要工具細(xì)胞之一。HEK293：人胚腎細(xì)胞，含有Ad5El區(qū)，經(jīng)5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，由McMaster大學(xué)F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。貼壁依賴性上皮型細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型，細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。HEK293細(xì)胞為人亞三倍體細(xì)胞系。

Vero：1962年建株，來自非洲綠猴腎，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，貼壁依賴性的成纖維細(xì)胞型。較易持續(xù)培養(yǎng)，可支持多種病毒的增殖，用于生產(chǎn)人畜疫苗，是目前唯一一株獲準(zhǔn)生產(chǎn)人用疫苗的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。BHK